Name: visualizing the interrenal steroidogenic tissue and its vascular microenvironment in zebrafish
Uploaded: 2016-12-21T13:00:00
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Nous remercions Prof. Christoph Englert et le Professeur Didier Stainier pour les dons de la Tg (wt1b: GFP) li1 et Tg (kdrl: EGFP) S843 souches, respectivement, et la facilité de Taiwan Zebrafish de base pour fournir Tg (kdrl: mCherry) CI5. Cette étude a été soutenue par des subventions du ministère de Taiwan de la science et de la technologie (96-2628-B-029-002-MY3, 101-2313-B-029-001, 102-2628-B-029-002-MY3, 102- 2321-B-400-018).

Déclaration éthique: Toutes les procédures expérimentales sur le poisson zèbre ont été approuvés par le soin et l&#39;utilisation des animaux Commission institutionnelle de l&#39;Université Tunghai (Approbation CISR NO 101-12.) Et réalisée en conformité avec les lignes directrices approuvées. 1. Stock Solutions pour 3β-HSD activité enzymatique Coloration <ol><li> Préparer le trans-dehydroandrosterone [10 mg / ml dans du diméthylsulfoxyde (DMSO)]. </li><li> Préparer l&#39;...

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	<li>Hsu, H. J., Lin, G., Chung, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+early+development+of+zebrafish+interrenal+glands+and+pronephros:+differential+control+by+wt1+and+ff1b.">Parallel early development of zebrafish interrenal glands and pronephros: differential control by wt1 and ff1b.</a> Development. 130, 2107-2116 (2003).</li><li>To, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary-interrenal+interaction+in+zebrafish+interrenal+organ+development.">Pituitary-interrenal interaction in zebrafish interrenal organ development.</a> Mol Endocrinol. 21, 472-485 (2007).</li><li>Liu, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrenal+organogenesis+in+the+zebrafish+model.">Interrenal organogenesis in the zebrafish model.</a> Organogenesis. 3, 44-48 (2007).</li><li>Cravioto, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+inherited+variant+of+the+3+beta-hydroxysteroid+dehydrogenase-isomerase+deficiency+syndrome:+evidence+for+the+existence+of+two+isoenzymes.">A new inherited variant of the 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase-isomerase deficiency syndrome: evidence for the existence of two isoenzymes.</a> J Clin Endocrinol Metab. 63, 360-367 (1986).</li><li>Lachance, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+3+beta-hydroxysteroid+dehydrogenase/delta+5-delta+4-isomerase+gene+and+its+expression+in+mammalian+cells.">Characterization of human 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta 5-delta 4-isomerase gene and its expression in mammalian cells.</a> J Biol Chem. 267, 3551 (1992).</li><li>Simard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+the+3beta-hydroxysteroid+dehydrogenase/delta5-delta4+isomerase+gene+family.">Molecular biology of the 3beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta5-delta4 isomerase gene family.</a> Endocr Rev. 26, 525-582 (2005).</li><li>Lin, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+zebrafish+hsd3b+genes+are+distinct+in+function,+expression,+and+evolution.">Two zebrafish hsd3b genes are distinct in function, expression, and evolution.</a> Endocrinology. 156, 2854-2862 (2015).</li><li>Grassi Milano, E., Basari, F., Chimenti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenocortical+and+adrenomedullary+homologs+in+eight+species+of+adult+and+developing+teleosts:+morphology,+histology,+and+immunohistochemistry.">Adrenocortical and adrenomedullary homologs in eight species of adult and developing teleosts: morphology, histology, and immunohistochemistry.</a> Gen Comp Endocrinol. 108, 483-496 (1997).</li><li>Chai, C., Liu, Y. W., Chan, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ff1b+is+required+for+the+development+of+steroidogenic+component+of+the+zebrafish+interrenal+organ.">Ff1b is required for the development of steroidogenic component of the zebrafish interrenal organ.</a> Dev Biol. 260, 226-244 (2003).</li><li>Liu, Y. W., Gao, W., Teh, H. L., Tan, J. H., Chan, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prox1+is+a+novel+coregulator+of+Ff1b+and+is+involved+in+the+embryonic+development+of+the+zebra+fish+interrenal+primordium.">Prox1 is a novel coregulator of Ff1b and is involved in the embryonic development of the zebra fish interrenal primordium.</a> Mol Cell Biol. 23, 7243-7255 (2003).</li><li>Chai, C., Liu, Y. W., Chan, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ff1b+is+required+for+the+development+of+steroidogenic+component+of+the+zebrafish+interrenal+organ.">Ff1b is required for the development of steroidogenic component of the zebrafish interrenal organ.</a> Dev. Biol. 260, 226-244 (2003).</li><li>Chou, C. W., Zhuo, Y. L., Jiang, Z. Y., Liu, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hemodynamically-regulated+vascular+microenvironment+promotes+migration+of+the+steroidogenic+tissue+during+its+interaction+with+chromaffin+cells+in+the+zebrafish+embryo.">The hemodynamically-regulated vascular microenvironment promotes migration of the steroidogenic tissue during its interaction with chromaffin cells in the zebrafish embryo.</a> PLoS One. 9, e107997 (2014).</li><li>Liu, Y. W., Guo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium+is+required+for+the+promotion+of+interrenal+morphogenetic+movement+during+early+zebrafish+development.">Endothelium is required for the promotion of interrenal morphogenetic movement during early zebrafish development.</a> Dev Biol. 297, 44-58 (2006).</li><li>Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish.">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132, 5199-5209 (2005).</li><li>Proulx, K., Lu, A., Sumanas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranial+vasculature+in+zebrafish+forms+by+angioblast+cluster-derived+angiogenesis.">Cranial vasculature in zebrafish forms by angioblast cluster-derived angiogenesis.</a> Dev Biol. 348, 34-46 (2010).</li><li>Perner, B., Englert, C., Bollig, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wilms+tumor+genes+wt1a+and+wt1b+control+different+steps+during+formation+of+the+zebrafish+pronephros.">The Wilms tumor genes wt1a and wt1b control different steps during formation of the zebrafish pronephros.</a> Dev Biol. 309, 87-96 (2007).</li><li>Chou, C. W., Chiu, C. H., Liu, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+mediates+correct+positioning+of+the+interrenal+organ+in+zebrafish.">Fibronectin mediates correct positioning of the interrenal organ in zebrafish.</a> Dev Dyn. 242, 432-443 (2013).</li><li>Chiu, C. H., Chou, C. W., Takada, S., Liu, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+fibronectin+signaling+requirements+of+the+zebrafish+interrenal+vessel.">Development and fibronectin signaling requirements of the zebrafish interrenal vessel.</a> PLoS One. 7, e43040 (2012).</li></ol>

L&#39;intensité du signal de l&#39;activité 3β-HSD a augmenté au cours de la réaction. Des signaux clairs de l&#39;activité 3β-HSD ont été détectées après 4 heures de réaction pour les étapes à partir de 28 HPF en avant. Toutefois, la durée de la réaction nécessite la détermination empirique, en fonction du but de l&#39;essai. Dans le cas où la coloration nécessite un traitement pendant une nuit, un fond légèrement bleutée tend à se développer sur les échantillons. Ce problème peut être surm...

La glande surrénale, un élément crucial de l&#39;axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien, sécrète stéroïdes et coordonne l&#39;homéostasie des stéroïdes et la réponse du corps au stress. La glande surrénale comprend le cortex externe, qui sécrète des stéroïdes d&#39;une manière spécifique de la zone, et la médulla interne, qui synthétise catécholamines. La glande interrénal en téléostéens est la contrepartie de la glande surrénale chez les mammifères et est composé de cellules interrénales et chromaffines stéroïdogenèse, qui sont des équivalents fonctionnels du cortex surrénalien et de la moelle, respectivement 1-3. Des études réalisées en utilisant le modèle de poisson zèbre ont rapporté que les deux lignées de cellules chromaffines stéroïdogenèse et sont formées par des mécanismes moléculaires et cellulaires très semblables à ceux des mammifères 1,2. Par conséquent, le poisson zèbre est un modèle potentiellement puissant pour l&#39;étude des troubles génétiques, le contrôle neuroendocrine, et la biologie des systèmes de l&#39;axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien (interrénal). <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Dans la glande surrénale, 3β-HSD catalyse la conversion de la progestérone à partir de prégnénolone, 17α-hydroxyprogestérone , de la 17α-hydroxypregnelolone et de l&#39; androstènedione déhydroépiandrostérone 4,5. 3β-HSD est essentiel pour la biosynthèse toutes les classes de stéroïdes hormonaux, à savoir la progestérone, les glucocorticoïdes, les minéralocorticoïdes, les androgènes et oestrogènes. Les deux 3β-HSD humaine isoenzymes HSD3B1 et HSD3B2 sont exprimés de manière différentielle 6. HSD3B1 est exprimée dans le placenta et les tissus périphériques, tandis que HSD3B2 est exprimée dans le cortex surrénal et les gonades. HSD3B1 humaine et HSD3B2 sont co-orthologues de HSD3B1 zebrafish, qui est exprimé au niveau du tissu interrénal et les gonades adultes; hsd3b2 zebrafish est un gène maternellement exprimé dont les transcriptions disparaître avant organogenèse 7. Le protocole de l&#39;ensemble de montage 3β-HSD dosage d&#39;activité enzymatique pour le poisson zèbre est développé en modifiant la méthode de Levy,s décrite par Milano et al. , Sur des coupes congelées de huit espèces de téléostéens 8. En raison de la perméabilité du tissu et de la transparence optique du poisson zèbre développement, l&#39;ensemble du montage 3β-HSD histochimie peut être utilisé avec succès pour l&#39;embryon de poisson zèbre fixe et les larves, et plus particulièrement à délimiter les tissus différenciés interrénales. Ce dosage rapide et sensible a été appliquée à divers mutants et morphants montrent différents types de dysmorphogenèse interrénal. L&#39;activité 3β-HSD interrénal est absent dans l&#39;embryon , où la spécification du tissu interrénal est perturbé par un effet de choc spécifique du facteur de transcription Ff1b et diminue à mesure que la différenciation interrénal est affectée par un effet de choc de la co - régulateur Ff1b Prox1 9,10. Notamment, l&#39;activité 3β-HSD peuvent être détectés chez des mutants présentant des défauts graves à un stade précoce, comme borgnes tête d&#39; épingle et strabisme, où le 3β-Hsd histochimie définit la façon dont la migration cellulaire interrénal est affectée 11. La différenciation du tissu interrénal ne soit pas compromise, même en l&#39;absence complète de sang et le système vasculaire. Par conséquent, comment les signaux de endothéliale façonnent l&#39;organe interrénal développement peut être déterminé 12,13. Dans l&#39;ensemble, cette analyse histochimique a été utilisé avec succès pour l&#39;étude de la spécification, la différenciation et la migration des cellules stéroïdogènes dans le modèle de poisson zèbre. Par conséquent, il devrait être un moyen efficace et un outil fiable pour tous les écrans génétiques ou chimiques ciblant les troubles des organes surrénales et interrénales.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="565">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:187px;">Carl Zeiss&#160;</td>
			<td style="width:72px;">LSM510&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>USB</td>
			<td>US16374</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hyclone Fetal Calf Serum&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30073</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N1636</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-Nitro blue tetrazolium</td>
			<td>Promega</td>
			<td>S380C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nusieve GTG</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50081</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenylthiourea</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P7629</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417-100Tab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PYREX Spot Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7220-85</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reef Salt</td>
			<td>AZOO</td>
			<td>AZ28001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">trans-Dehydroandrosterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the interrenal steroidogenic tissue and its vascular microenvironment in zebrafish

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying differentiated steroidogenic tissues through chromogenic histochemical staining of 3-&#946;-Hydroxysteroid dehydrogenase /&#916;5-4 isomerase (3&#946;-Hsd) activity-positive cells is critical for monitoring the morphology and differentiation of adrenocortical and interrenal tissues in mammals and teleosts, respectively. In the zebrafish model, the optical transparency and tissue permeability of the developing embryos and larvae allow for whole-mount staining of 3&#946;-Hsd activity. This staining protocol, as performed on transgenic fluorescent reporter lines marking the developing pronephric and endothelial cells, enables the detection of the steroidogenic interrenal tissue in addition to the kidney and neighboring vasculature. In combination with vibratome sectioning, immunohistochemistry, and confocal microscopy, we can visualize and assay the vascular microenvironment of interrenal steroidogenic tissues. The 3&#946;-Hsd activity assay is essential for studying the cell biology of the zebrafish interrenal gland because to date, no suitable antibody is available for labeling zebrafish steroidogenic cells. Furthermore, this assay is rapid and simple, thus providing a powerful tool for mutant screens targeting adrenal (interrenal) genetic disorders as well as for determining disruption effects of chemicals on steroidogenesis in pharmaceutical or toxicological studies.

Pour déterminer comment les codevelops de tissus interrénales stéroïdogènes avec le glomérule du rein pronephrique et son vascularisation naissante, le dosage de l&#39; activité enzymatique 3β-HSD a été réalisée sur la double transgénique Tg (wt1b: GFP) li1; Tg (kdrl: mCherry) CI5 embryon à 34 HPF (figure 1). A ce stade, le tissu stéroïdogénique activité positive 3β-HSD est situé juste à la ligne médiane et caudale imm...

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Visualizing the Interrenal Steroidogenic Tissue and Its Vascular Microenvironment in Zebrafish

La glande interrénal chez le poisson zèbre est la contrepartie téléostéen de la glande surrénale chez les mammifères. Ce protocole présente comment effectuer la déshydrogénase 3-β-hydroxystéroïde (Δ 5-4 isomérase; 3β-HSD) dosage de l&#39; activité enzymatique, qui détecte les cellules stéroïdogènes différenciées chez le poisson zèbre en développement.

Visualiser le tissu interrénal stéroïdogénique et son vasculaire Microenvironnement dans Zebrafish

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

Capture réparation des tissus chez le poisson zèbre larves avec Time-lapse Brightfield stéréomicroscopie

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Recherche

Biologie du développement

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse des Muscle intégrité poisson zèbre larves squelettique avec colorant bleu Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

Dissection de tissu gonadique Larval Zebrafish

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protocoles pour Visualizing stéroïdogénique organes et leurs organes interactifs avec Immunostaining dans le Fruit Fly<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Une nouvelle technique de transplantation de graisse mammaire mammaire pour visualiser la génération de vaisseaux de cellules souches endothéliales vasculaires

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Imagerie en direct de la souris Fusion de palais secondaire

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualisation des cellules multiciliées dans le poisson-zèbre à travers un protocole combiné de toute monture Fluorescent In Situ hybridation et Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

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Cellule des épreuves d’agrégation pour évaluer la liaison de l’encoche de la drosophile avec Trans-Ligands et son Inhibition par Cis-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

Mouvements de tissu endocardique suivant via Photoconversion de cellules dans l’embryon de poisson zèbre

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualiser le nœud et la notochorde plaque en Gastrulating des embryons de souris à l’aide de la microscopie électronique à balayage et toute monture Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...