Name: visualizing the interrenal steroidogenic tissue and its vascular microenvironment in zebrafish
Uploaded: 2016-12-21T13:00:00
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S843 : LI1과의 Tg (EGFP kdrl) : 우리는 Tg가 (GFP wt1b)를 증여에 대한 교수 크리스토프 Englert 교수 디디에 Stainier 감사합니다 균주 각각과의 Tg (kdrl을 : mCherry) 제공하는 대만 Zebrafish의 핵심 시설 C15- 카르을. 이 연구는 102-, 과학 기술 (96-2628-B-029-002-MY3, 101-2313-B-029-001, 102-2628-B-029-002-MY3 대만의 정부에서 보조금에 의해 지원되었다 2321-B-400-018).

윤리 정책 : 제브라 피쉬의 모든 실험 절차는 동해 대학의 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다 (IRB 승인 NO 101-12합니다.) 및 승인 된 지침에 따라 수행 하였다. 3β-HSD 효소 활성 염색 1. 재고 솔루션 <ol><li> 트랜스 dehydroandrosterone [디메틸 술폭 사이드 (DMSO)에 10 ㎎ / ㎖]를 준비한다. </li><li> β - 니코틴 아미드 아데닌 디 뉴클레오티드 수화물 (0.1 M 인산염 완충액...

<ol>
	<li>Hsu, H. J., Lin, G., Chung, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+early+development+of+zebrafish+interrenal+glands+and+pronephros:+differential+control+by+wt1+and+ff1b.">Parallel early development of zebrafish interrenal glands and pronephros: differential control by wt1 and ff1b.</a> Development. 130, 2107-2116 (2003).</li><li>To, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary-interrenal+interaction+in+zebrafish+interrenal+organ+development.">Pituitary-interrenal interaction in zebrafish interrenal organ development.</a> Mol Endocrinol. 21, 472-485 (2007).</li><li>Liu, Y. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+zebrafish+hsd3b+genes+are+distinct+in+function,+expression,+and+evolution.">Two zebrafish hsd3b genes are distinct in function, expression, and evolution.</a> Endocrinology. 156, 2854-2862 (2015).</li><li>Grassi Milano, E., Basari, F., Chimenti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenocortical+and+adrenomedullary+homologs+in+eight+species+of+adult+and+developing+teleosts:+morphology,+histology,+and+immunohistochemistry.">Adrenocortical and adrenomedullary homologs in eight species of adult and developing teleosts: morphology, histology, and immunohistochemistry.</a> Gen Comp Endocrinol. 108, 483-496 (1997).</li><li>Chai, C., Liu, Y. W., Chan, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ff1b+is+required+for+the+development+of+steroidogenic+component+of+the+zebrafish+interrenal+organ.">Ff1b is required for the development of steroidogenic component of the zebrafish interrenal organ.</a> Dev Biol. 260, 226-244 (2003).</li><li>Liu, Y. W., Gao, W., Teh, H. L., Tan, J. H., Chan, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prox1+is+a+novel+coregulator+of+Ff1b+and+is+involved+in+the+embryonic+development+of+the+zebra+fish+interrenal+primordium.">Prox1 is a novel coregulator of Ff1b and is involved in the embryonic development of the zebra fish interrenal primordium.</a> Mol Cell Biol. 23, 7243-7255 (2003).</li><li>Chai, C., Liu, Y. W., Chan, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ff1b+is+required+for+the+development+of+steroidogenic+component+of+the+zebrafish+interrenal+organ.">Ff1b is required for the development of steroidogenic component of the zebrafish interrenal organ.</a> Dev. Biol. 260, 226-244 (2003).</li><li>Chou, C. W., Zhuo, Y. L., Jiang, Z. Y., Liu, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hemodynamically-regulated+vascular+microenvironment+promotes+migration+of+the+steroidogenic+tissue+during+its+interaction+with+chromaffin+cells+in+the+zebrafish+embryo.">The hemodynamically-regulated vascular microenvironment promotes migration of the steroidogenic tissue during its interaction with chromaffin cells in the zebrafish embryo.</a> PLoS One. 9, e107997 (2014).</li><li>Liu, Y. W., Guo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium+is+required+for+the+promotion+of+interrenal+morphogenetic+movement+during+early+zebrafish+development.">Endothelium is required for the promotion of interrenal morphogenetic movement during early zebrafish development.</a> Dev Biol. 297, 44-58 (2006).</li><li>Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish.">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132, 5199-5209 (2005).</li><li>Proulx, K., Lu, A., Sumanas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranial+vasculature+in+zebrafish+forms+by+angioblast+cluster-derived+angiogenesis.">Cranial vasculature in zebrafish forms by angioblast cluster-derived angiogenesis.</a> Dev Biol. 348, 34-46 (2010).</li><li>Perner, B., Englert, C., Bollig, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wilms+tumor+genes+wt1a+and+wt1b+control+different+steps+during+formation+of+the+zebrafish+pronephros.">The Wilms tumor genes wt1a and wt1b control different steps during formation of the zebrafish pronephros.</a> Dev Biol. 309, 87-96 (2007).</li><li>Chou, C. W., Chiu, C. H., Liu, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+mediates+correct+positioning+of+the+interrenal+organ+in+zebrafish.">Fibronectin mediates correct positioning of the interrenal organ in zebrafish.</a> Dev Dyn. 242, 432-443 (2013).</li><li>Chiu, C. H., Chou, C. W., Takada, S., Liu, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+fibronectin+signaling+requirements+of+the+zebrafish+interrenal+vessel.">Development and fibronectin signaling requirements of the zebrafish interrenal vessel.</a> PLoS One. 7, e43040 (2012).</li></ol>

3β-HSD 활동의 신호 강도는 반응의 과정을 통해 증가. 3β-HSD 활동의 명확한 신호는 이후 28 HPF에서 단계에 대한 반응 4 시간 후에 발견되었다. 그러나, 반응 시간은 분석의 목적에 따라 경험적 결정이 필요하다. 염색 밤새 처리 요구의 경우, 약간 엷은 배경 샘플을 개발하는 경향이있다. 이 문제는 HSD-3β 활성 염색 전에 고정 지속 시간 (예를 들어, RT에서 4 % PFAT에서 4 시간)의 증가에 의해 극복 ?...

부신은 시상 하부 - 뇌하수체 - 부신 축의 중요한 구성 요소, 스테로이드를 분비하고 스테로이드 항상성과 스트레스에 대한 신체 반응을 조정한다. 부신은 카테콜아민을 합성 ㄱ 영역 별 방식으로 스테로이드를 분비 바깥 쪽 피질, 및 내부 수질를 포함한다. 경골 어류의 interrenal 선은 포유 동물의 부신의 상대이며, 부신 피질과 수질, 각각 1-3의 기능적 등가물이다 steroidogenic interrenal과 크롬 친화 세포로 구성되어있다. 제브라 피쉬 모델을 사용하여 수행 연구는 모두 steroidogenic 및 크롬 친화 세포의 계보가 매우 포유류 1, 2에서와 유사한 분자 및 세포 메커니즘에 의해 형성되는 것으로보고있다. 따라서, 제브라 피쉬는 유전 질환, 신경 내분비 조절하고, 시상 하부 - 뇌하수체 - 부신 (interrenal) 축 시스템 생물학 연구를위한 잠재적으로 강력한 모델이다. 4,5에서 17α-hydroxypregnelolone에서 프레 그네 놀론, 17α-hydroxyprogesterone에서 프로게스테론의 변환 및 안드로 스텐 디온을 촉매. 3β-HSD 호르몬 스테로이드, 즉 황체 호르몬, 글루코 코르티코이드, 무기질 코르티코이드, 안드로겐과 에스트로겐의 모든 클래스를 생합성을 위해 필수적이다. 두 사람의 3β-HSD는 HSD3B1을 동질 효소와 HSD3B2는 차동 (6) 표현된다. HSD3B2가 신피질 생식선에서 발현되는 반면 HSD3B1는 태반 및 말초 조직에서 발현된다. 인간 HSD3B1 및 HSD3B2는 interrenal 조직과 성인 생식선에서 표현되는 제브라 피쉬 hsd3b1, 공동 orthologs이다; 제브라 피쉬 hsd3b2 누구의 성적 기관 형성 칠하기 전에 사라질 모체 표현 유전자이다. 제브라 피쉬의 전체 마운트 3β-HSD 효소 활성 분석의 프로토콜, 레비의 방법을 수정하여 개발 된밀라노 등의 알에 의해 설명 s의. 여덟 경골 종 (8)의 동결 절편에. 때문에 조직 투과성 현상 지브라 피쉬의 광학 투명성, 3β-HSD 조직 화학 성공적 고정 제브라 배아와 유충에 사용할 수있는 전체 마운트 구체적 차별화 interrenal 조직을 서술. 이 민감하고 신속한 분석은 interrenal dysmorphogenesis의 다른 유형을 보여주는 다양한 돌연변이 morphants 적용되었다. interrenal 3β-HSD 활성은 interrenal 조직 명세가 Ff1b 전사 인자의 특정 녹다운을 중단하고 interrenal 분화가 Ff1b의 coregulator Prox1 9,10-의 최저 의해 영향으로 감소 된 배아 부재. 특히, 3β-HSD 활동과 같은 하나 아이드 핀 머리 심한 초기 결손 돌연변이 체에서 검출 될 수 있고, 여기서 H-3β, 곁눈질SD 조직 화학은 interrenal 세포 이동 (11)를 어떻게 영향을 받는지 묘사. interrenal 조직의 분화에도 혈액과 혈관의 완전한 부재에 손상되지 않습니다. 따라서, 내피 세포 유래 신호를 형성하는 방법을 개발 interrenal 기관은 12, 13를 측정 할 수있다. 전반적으로,이 조직 화학적 분석은 성공적으로 제브라 피쉬 모델의 사양, 차별화, 그리고 steroidogenic 세포의 이동을 연구에 사용되었다. 따라서, 효율적이고 부신 및 interrenal 장기 장애를 타겟팅하는 유전자 또는 화학 스크린에 대한 신뢰할 수있는 도구를해야한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="565">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:187px;">Carl Zeiss&#160;</td>
			<td style="width:72px;">LSM510&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>USB</td>
			<td>US16374</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hyclone Fetal Calf Serum&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30073</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N1636</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-Nitro blue tetrazolium</td>
			<td>Promega</td>
			<td>S380C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nusieve GTG</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50081</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenylthiourea</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P7629</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417-100Tab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PYREX Spot Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7220-85</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reef Salt</td>
			<td>AZOO</td>
			<td>AZ28001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">trans-Dehydroandrosterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the interrenal steroidogenic tissue and its vascular microenvironment in zebrafish

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying differentiated steroidogenic tissues through chromogenic histochemical staining of 3-&#946;-Hydroxysteroid dehydrogenase /&#916;5-4 isomerase (3&#946;-Hsd) activity-positive cells is critical for monitoring the morphology and differentiation of adrenocortical and interrenal tissues in mammals and teleosts, respectively. In the zebrafish model, the optical transparency and tissue permeability of the developing embryos and larvae allow for whole-mount staining of 3&#946;-Hsd activity. This staining protocol, as performed on transgenic fluorescent reporter lines marking the developing pronephric and endothelial cells, enables the detection of the steroidogenic interrenal tissue in addition to the kidney and neighboring vasculature. In combination with vibratome sectioning, immunohistochemistry, and confocal microscopy, we can visualize and assay the vascular microenvironment of interrenal steroidogenic tissues. The 3&#946;-Hsd activity assay is essential for studying the cell biology of the zebrafish interrenal gland because to date, no suitable antibody is available for labeling zebrafish steroidogenic cells. Furthermore, this assay is rapid and simple, thus providing a powerful tool for mutant screens targeting adrenal (interrenal) genetic disorders as well as for determining disruption effects of chemicals on steroidogenesis in pharmaceutical or toxicological studies.

pronephric 신장 사구체 및 초기 혈관과 steroidogenic interrenal 조직 codevelops에서, 3β-HSD 효소 활성 분석은 이중 형질 전환의 Tg (wt1b : GFP)에서 수행 된 방법을 결정하려면 LI1, Tg는 (kdrl : mCherry) C15- 카르 배아를 34 HPF에서 (그림 1). 이 단계에서, 3β-HSD 활동을 양성 steroidogenic 조직을 바로 중간 선에 위치하고 있으며 일부 steroidogenic 세포가 중?...

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Visualizing the Interrenal Steroidogenic Tissue and Its Vascular Microenvironment in Zebrafish

제브라 피쉬의 interrenal 선은 포유 동물의 부신의 teleostean 대응이다. 효소 활성 분석, 개발 제브라 피쉬에서 차별화 된 steroidogenic 세포를 감지,이 프로토콜은 3-β-하이드 록시 탈수소 효소 (3β-HSD Δ 5-4 이성화 효소)를 수행하는 방법을 소개합니다.

Interrenal Steroidogenic 조직 및 제브라 피쉬의 혈관 미세 시각화

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

시간 경과 브라이트 실체 현미경으로 Zebrafish의 애벌레에서 조직 복구를 캡처

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

연구

발생학

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

애벌레 Zebrafish의 생식소 조직의 해부

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

과일 플라이의 면역 염색과 Steroidogenic 기관 및 그들의 상호 작용하는 장기를 시각화하기위한 프로토콜<em&gt; 노랑 초파리</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

혈관 내피 줄기 세포의 혈관 생성을 시각화하기위한 유방 팻 패드 이식 기술

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Mouse Secondary Palate Fusion의 라이브 이미징

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Multiciliated 셀 전체 마운트 형광 제자리에서 교 잡 및 면역 형광의 결합 된 프로토콜을 통해 Zebrafish에 시각화

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

트랜스와 초파리 노치의 바인딩을 평가를 집계 분석 셀-Ligands 및 Cis에 의해 그것의 억제-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

Zebrafish 태아에 있는 세포 Photoconversion 통해 다음 Endocardial 조직 움직임

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

노드 및 스캐닝 전자 현미경 검사 법, 면역 형광 산 전체를 사용 하 여 Gastrulating 마우스 배아에서 Notochordal 접시를 시각화

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...