Name: visualizing the interrenal steroidogenic tissue and its vascular microenvironment in zebrafish
Uploaded: 2016-12-21T13:00:00
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Agradecemos al Prof. Christoph Englert y el Prof. Didier Stainier para regalar la Tg (wt1b: GFP) LI1 y Tg (kdrl: EGFP) s843 cepas, respectivamente, y el Fondo para el pez cebra Taiwán Core para proporcionar Tg (kdrl: mCherry) CI5. Este estudio fue apoyado por subvenciones del Ministerio de Ciencia y Tecnología (96-2628-B-029-002-MY3, 101-2313-B-029-001, 102-2628-B-029-002-MY3 de Taiwán, 102- 2321-B-400-018).

Ética Declaración: Todos los procedimientos experimentales en el pez cebra fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Tunghai (Aprobación del IRB NO 101-12.) Y llevada a cabo de conformidad con las directrices aprobadas. 1. Soluciones de archivo para 3β-HSD actividad enzimática de tinción <ol><li> Preparar trans-dehydroandrosterone [10 mg / ml en sulfóxido de dimetilo (DMSO)]. </li><li> Preparar β-nicotinamida adenina dinucleóti...

<ol>
	<li>Hsu, H. J., Lin, G., Chung, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+early+development+of+zebrafish+interrenal+glands+and+pronephros:+differential+control+by+wt1+and+ff1b.">Parallel early development of zebrafish interrenal glands and pronephros: differential control by wt1 and ff1b.</a> Development. 130, 2107-2116 (2003).</li><li>To, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary-interrenal+interaction+in+zebrafish+interrenal+organ+development.">Pituitary-interrenal interaction in zebrafish interrenal organ development.</a> Mol Endocrinol. 21, 472-485 (2007).</li><li>Liu, Y. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+zebrafish+hsd3b+genes+are+distinct+in+function,+expression,+and+evolution.">Two zebrafish hsd3b genes are distinct in function, expression, and evolution.</a> Endocrinology. 156, 2854-2862 (2015).</li><li>Grassi Milano, E., Basari, F., Chimenti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenocortical+and+adrenomedullary+homologs+in+eight+species+of+adult+and+developing+teleosts:+morphology,+histology,+and+immunohistochemistry.">Adrenocortical and adrenomedullary homologs in eight species of adult and developing teleosts: morphology, histology, and immunohistochemistry.</a> Gen Comp Endocrinol. 108, 483-496 (1997).</li><li>Chai, C., Liu, Y. W., Chan, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ff1b+is+required+for+the+development+of+steroidogenic+component+of+the+zebrafish+interrenal+organ.">Ff1b is required for the development of steroidogenic component of the zebrafish interrenal organ.</a> Dev Biol. 260, 226-244 (2003).</li><li>Liu, Y. W., Gao, W., Teh, H. L., Tan, J. H., Chan, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prox1+is+a+novel+coregulator+of+Ff1b+and+is+involved+in+the+embryonic+development+of+the+zebra+fish+interrenal+primordium.">Prox1 is a novel coregulator of Ff1b and is involved in the embryonic development of the zebra fish interrenal primordium.</a> Mol Cell Biol. 23, 7243-7255 (2003).</li><li>Chai, C., Liu, Y. W., Chan, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ff1b+is+required+for+the+development+of+steroidogenic+component+of+the+zebrafish+interrenal+organ.">Ff1b is required for the development of steroidogenic component of the zebrafish interrenal organ.</a> Dev. Biol. 260, 226-244 (2003).</li><li>Chou, C. W., Zhuo, Y. L., Jiang, Z. Y., Liu, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hemodynamically-regulated+vascular+microenvironment+promotes+migration+of+the+steroidogenic+tissue+during+its+interaction+with+chromaffin+cells+in+the+zebrafish+embryo.">The hemodynamically-regulated vascular microenvironment promotes migration of the steroidogenic tissue during its interaction with chromaffin cells in the zebrafish embryo.</a> PLoS One. 9, e107997 (2014).</li><li>Liu, Y. W., Guo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium+is+required+for+the+promotion+of+interrenal+morphogenetic+movement+during+early+zebrafish+development.">Endothelium is required for the promotion of interrenal morphogenetic movement during early zebrafish development.</a> Dev Biol. 297, 44-58 (2006).</li><li>Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish.">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132, 5199-5209 (2005).</li><li>Proulx, K., Lu, A., Sumanas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranial+vasculature+in+zebrafish+forms+by+angioblast+cluster-derived+angiogenesis.">Cranial vasculature in zebrafish forms by angioblast cluster-derived angiogenesis.</a> Dev Biol. 348, 34-46 (2010).</li><li>Perner, B., Englert, C., Bollig, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wilms+tumor+genes+wt1a+and+wt1b+control+different+steps+during+formation+of+the+zebrafish+pronephros.">The Wilms tumor genes wt1a and wt1b control different steps during formation of the zebrafish pronephros.</a> Dev Biol. 309, 87-96 (2007).</li><li>Chou, C. W., Chiu, C. H., Liu, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+mediates+correct+positioning+of+the+interrenal+organ+in+zebrafish.">Fibronectin mediates correct positioning of the interrenal organ in zebrafish.</a> Dev Dyn. 242, 432-443 (2013).</li><li>Chiu, C. H., Chou, C. W., Takada, S., Liu, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+fibronectin+signaling+requirements+of+the+zebrafish+interrenal+vessel.">Development and fibronectin signaling requirements of the zebrafish interrenal vessel.</a> PLoS One. 7, e43040 (2012).</li></ol>

La intensidad de la señal de la actividad 3β-HSD aumentó durante el curso de la reacción. se detectaron señales claras de la actividad 3β-HSD después de 4 horas de reacción para las etapas de 28 hpf en adelante. Sin embargo, la duración de la reacción requiere la determinación empírica, dependiendo de la finalidad del ensayo. En los casos en que la tinción requiere procesamiento durante la noche, un fondo ligeramente azulado tiende a desarrollarse en las muestras. Este problema se puede superar mediante el ...

La glándula suprarrenal, un componente crucial del eje hipotálamo-pituitario-adrenal, segrega esteroides y coordina la homeostasis de esteroides y la respuesta del cuerpo al estrés. La glándula suprarrenal comprende la corteza exterior, que segrega los esteroides de manera-zona específica, y médula interna, que sintetiza las catecolaminas. La glándula interrenal en teleósteos es la contraparte de la glándula suprarrenal en los mamíferos y se compone de células cromafines interrenal y androgénica, que son equivalentes funcionales de la corteza suprarrenal y la médula, respectivamente 1-3. Estudios llevados a cabo utilizando el modelo de pez cebra han informado de que los dos linajes de células esteroidogénicas y cromafines se forman por los mecanismos moleculares y celulares altamente parecidas a las de los mamíferos 1,2. Por lo tanto, el pez cebra es un modelo potencialmente poderosa para el estudio de enfermedades genéticas, el control neuroendocrino, y la biología de sistemas del eje hipotálamo-pituitario-adrenal (interrenal). <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; En la glándula adrenal, 3β-HSD cataliza la conversión de la progesterona a partir de pregnenolona, 17α-hidroxiprogesterona de 17α-hydroxypregnelolone, y la androstenediona de dehidroepiandrosterona 4,5. 3β-HSD es esencial para la biosíntesis de todas las clases de esteroides hormonales, a saber, la progesterona, glucocorticoides, mineralocorticoides, andrógenos y estrógenos. Los dos humana 3β-HSD isoenzimas hsd3b1 y HSD3B2 se expresan diferencialmente 6. Hsd3b1 se expresa en la placenta y en los tejidos periféricos, mientras que HSD3B2 se expresa en la corteza adrenal y las gónadas. Hsd3b1 humana y HSD3B2 son co-orthologs de hsd3b1 pez cebra, que se expresa en el tejido interrenal gónadas y adultos; HSD3B2 pez cebra es un gen expresado maternalmente cuyas transcripciones desaparecer antes de la organogénesis 7. El protocolo de todo el montaje en el ensayo de actividad enzimática 3β-HSD para el pez cebra fue desarrollado modificando el método de Levy,s descrito por Milano et al. , En secciones congeladas de ocho especies de teleósteos 8. Debido a la permeabilidad del tejido y la transparencia óptica del pez cebra en desarrollo, todo el montaje 3β-HSD la histoquímica se puede utilizar con éxito para el embrión del pez cebra fija y larvas y específicamente delinear los tejidos interrenal diferenciadas. Este ensayo sensible y rápido se ha aplicado a diversos mutantes y morphants que demuestran diferentes tipos de dysmorphogenesis interrenal. La actividad 3β-HSD interrenal está ausente en el embrión, donde la especificación del tejido interrenal se interrumpe a través de una caída específica del factor de transcripción ff1b y se disminuyó a medida que la diferenciación interrenal se ve afectada por una caída de la coregulator ff1b Prox1 9,10. En particular, la actividad 3β-HSD se puede detectar en los mutantes con defectos severos en fase inicial, tales como una cabeza de alfiler de ojos y estrabismo, donde el 3β-Hhistoquímica sd delinea cómo la migración de las células se ve afectado interrenal 11. La diferenciación del tejido interrenal no se vea comprometida incluso en ausencia completa de la sangre y la vasculatura. Por lo tanto, cómo las señales derivadas del endotelio forma al órgano interrenal en desarrollo puede ser determinada 12,13. En general, este ensayo histoquímico ha sido utilizado con éxito para el estudio de la especificación, diferenciación y migración de las células esteroidogénicas en el modelo de pez cebra. Por lo tanto, debe ser un una herramienta fiable para todas las pantallas genéticas o químicas dirigidas a trastornos de los órganos suprarrenales y interrenal eficiente y.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="565">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:187px;">Carl Zeiss&#160;</td>
			<td style="width:72px;">LSM510&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>USB</td>
			<td>US16374</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hyclone Fetal Calf Serum&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30073</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#946;-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N1636</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-Nitro blue tetrazolium</td>
			<td>Promega</td>
			<td>S380C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nusieve GTG</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50081</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenylthiourea</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P7629</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417-100Tab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PYREX Spot Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7220-85</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reef Salt</td>
			<td>AZOO</td>
			<td>AZ28001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">trans-Dehydroandrosterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the interrenal steroidogenic tissue and its vascular microenvironment in zebrafish

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying differentiated steroidogenic tissues through chromogenic histochemical staining of 3-&#946;-Hydroxysteroid dehydrogenase /&#916;5-4 isomerase (3&#946;-Hsd) activity-positive cells is critical for monitoring the morphology and differentiation of adrenocortical and interrenal tissues in mammals and teleosts, respectively. In the zebrafish model, the optical transparency and tissue permeability of the developing embryos and larvae allow for whole-mount staining of 3&#946;-Hsd activity. This staining protocol, as performed on transgenic fluorescent reporter lines marking the developing pronephric and endothelial cells, enables the detection of the steroidogenic interrenal tissue in addition to the kidney and neighboring vasculature. In combination with vibratome sectioning, immunohistochemistry, and confocal microscopy, we can visualize and assay the vascular microenvironment of interrenal steroidogenic tissues. The 3&#946;-Hsd activity assay is essential for studying the cell biology of the zebrafish interrenal gland because to date, no suitable antibody is available for labeling zebrafish steroidogenic cells. Furthermore, this assay is rapid and simple, thus providing a powerful tool for mutant screens targeting adrenal (interrenal) genetic disorders as well as for determining disruption effects of chemicals on steroidogenesis in pharmaceutical or toxicological studies.

Para determinar cómo las codevelops tejido interrenal androgénica, con el glomérulo renal pronephric y su naciente sistema vascular, el ensayo de actividad enzimática 3β-HSD se llevó a cabo en el doble transgénico Tg (wt1b: GFP) LI1; Tg (kdrl: mCherry) CI5 embrión en 34 HPF (Figura 1). En esta etapa, el tejido steroidogenic actividad positiva 3β-HSD está situado justo a la línea media y caudal inmediatamente al glomérulo renal p...

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Visualizing the Interrenal Steroidogenic Tissue and Its Vascular Microenvironment in Zebrafish

La glándula interrenal en el pez cebra es la contraparte teleósteos de la glándula adrenal de los mamíferos. Este protocolo presenta cómo realizar la deshidrogenasa 3-β-hidroxiesteroide (Δ 5-4 isomerasa; 3β-HSD) ensayo de actividad enzimática, que detecta las células esteroidogénicas diferenciadas en el pez cebra en desarrollo.

La visualización del Tejido Interrenal androgénica, y su microambiente vascular en el pez cebra

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

La captura de Reparación de Tejidos en pez cebra larvas con Time-lapse Brightfield Estereomicroscopía

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Análisis de pez cebra larvas esquelético Integridad del músculo con el colorante azul de Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

La disección de las larvas de pez cebra de tejidos gonadales

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protocolos para la visualización androgénica, órganos y sus órganos interactivos con inmunotinción en la mosca de la fruta<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Una nueva técnica de trasplante de grasa mamaria para visualizar la generación de vasos de células madre endoteliales vasculares

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Imágenes en vivo de la fusión secundaria del paladar del ratón

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualización de las células Multiciliated en el pez cebra a través de un protocolo combinado de todo Monte fluorescente In Situ hibridación e inmunofluorescencia

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

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Célula de ensayos de agregación para evaluar el atascamiento de la muesca de Drosophila con Trans-ligandos y su inhibición por Cis-ligandos

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

Siguientes movimientos de tejido endocárdico vía Photoconversion de la célula en el embrión de pez cebra

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualización de la placa notocordal en embriones de ratón Gastrulating con microscopía electrónica e inmunofluorescencia de Monte todo y nodo

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...