Name: development and identification of a novel subpopulation of human neutrophil-derived giant phagocytes in vitro
Uploaded: 2017-01-25T14:00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro at JoVE.com

Författarna tackar Dr Edith Suss-Toby för hennes ovärderlig hjälp med konfokalmikroskopi studierna. Denna studie stöddes av ministeriet för invandring Absorption och utskottet för planering och budgetering av rådet för högre utbildning inom ramen för den Kamea programmet (LD och AP). Vi har också tacksamt erkänna stöd av Research Fellow från Lady Davis Foundation Post-Doctoral Research Fellowship (OR).

Protokollet godkändes av den lokala Kommittén för mänskliga rättigheter i enlighet med Helsingforsdeklarationen, och alla deltagare undertecknat ett informerat samtycke formulär. 1. Neutrofil Isolering och utveckling av Gφ i kultur OBS: Alla steg ska utföras med steril vävnadskvalitet lipopolysackarid (LPS) -fria lösningar i en biosäkerhet laminärt flöde huva. Lägg inte till antibiotika, cytokiner eller tillväxtfaktorer till Roswell Park Memorial Institute (RPMI) -1640 medium. <ol><li> Erhålla åtminstone 40 ml venöst blod från unga friska vuxna med hjälp av en steril hårbotten ven set. Dra blod i vacutainerrör innehåller etylendiamintetra ättiksyra K 3 salt (K 3 EDTA) och blanda försiktigt. Hålla blodet vid rumstemperatur. </li><li> Isolera neutrofilerna med två steg diskontinuerlig densitetsgradient med hjälp polysackaros på 1,119 och 1,077 g / ml. Ta lösningar till rumstemperatur före användning. OBS! Under centrifugering, röda blodceller (RBC) aggregeras av polysackaros och sediment snabbt. De mononukleära cellerna (monocyter / lymfocyter) finns mellan den övre plasma / polysackaros -1077 gränssnitt, medan neutrofilerna finns precis ovanför RBC vid polysackaros -1077 / 1119 gränssnitt (se figur 2). Denna metod tillåter samtidig separation av mononukleära celler och neutrofiler från samma individ. </li></ol><img alt="figur 2" src="/files/ftp_upload/54826/54826fig2.jpg" /> Figur 2: neutrofila Isolering från humant helblod. Polysackaros vid en 1,077 g / ml är noggrant lager ovanpå polysackaros-1,119 g / ml för att bilda en diskontinuerlig gradient. Den utspädda helblod sedan skiktas ovanpå polysackaros-1.077. De rör omedelbart utsattes för centrifugering vid 700 xg under 30 min, vid rumstemperatur utan broms. Tre distinkta band noteras. (A) mononukleära celler, (B) polymorfonukleära celler (PMN),och (C) röda blodkroppar (RBC) i botten av röret. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54826/54826fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <ol style="margin-left: 40px;"><li> Tillsätt 12 ml polysackaros-1119 till botten av en 50 ml steril polypropen koniskt centrifugrör. </li><li> skikt försiktigt 12 ml polysackaros-1077 på polysackaros -1119. </li><li> Späd 10 - 12 ml helblod till en slutlig volym av 24 ml blod med jonfritt fosfatbuffrad saltlösning (PBS) innehållande 2% värmeinaktiverat fetalt kalvserum (HI-FCS). skikt noggrant 24 ml av det utspädda helblodet på den övre gradient av röret. </li><li> Centrifugera vid 700 xg under 30 minuter vid rumstemperatur (20-24 ° C) utan broms. OBS: Centrifugering vid lägre temperaturer kan resultera i cellklumpning och dålig återhämtning. </li><li> Försiktigt bort rören från centrifugen withoutt störa gradienten. Bör observeras två ogenomskinliga skikt (A: Mononukleära celler och B: PMN, som avbildas i figur 2). </li><li> Aspirera och kasta vätskan upp till 0,5 cm ovanför lagret A. Transfer (eller kasse) cellerna från detta skikt till ett rör märkt &quot;mononukleära&quot;. </li><li> Aspirera och kasta den överblivna vätskan upp till 0,5 cm ovanför lagret B. Överför celler från detta skikt till ett rör märkt &quot;PMN&quot;. </li><li> Pool PMN från vardera två lutnings rör och tvätta med PBS innehållande 2% HI-FCS till en slutlig volym på 30 ml. Centrifugera i 12 minuter vid 200 xg, avlägsna supernatanten och kassera. </li><li> För att bli av förorenande röda blodkroppar (RBC), tillsätt 3 ml hypoton 0,2% iskall steril NaCl medan resuspendering pelleten genom att försiktigt dra in och ut med en 1 ml steril pipett spets. Håll på is under 30 sek. </li><li> Efter 30 sekunder, åter isotonicitet genom tillsats av 3 ml steril 1,6% iskall NaCl till röret. </li><li> Till de 6 ml isoton koksaltlösning, tillsätt 6 ml förvärmda (37 ° C) RPMI-1640-medium kompletterat med 2% HI-FCS och centrifugera vid 250 xg under 12 min. Kassera supernatanten. PMN pellets ska vara rent av RBC förorening. OBS: Om förorenat av RBC visas PMN pellets rödaktig. </li><li> Om några kontaminerande RBC kvar, upprepa steg 9 och 10 en gång mer. </li><li> Resuspendera cellpelleten i 4 ml RPMI-1640 kompletterat med 10% HI-FCS och räkna cellerna för att bestämma deras koncentration och livsduglighet genom trypan blå exklusion. </li><li> Justera koncentrationen till 1,25-1,5 x 10 6 PMN / ml (beroende på experimentella behov), och plattan 1,0 ml / brunn i en platta med 24 brunnar. OBS: Renheten av neutrofiler i granulocyt population alltid översteg 95%, enligt bedömning av maj Grunewald-Giemsa-färgning och ljusmikroskop. </li><li> Efter sådd, placera cellerna i ett fuktad 5% CO2 inkubator vid 37 ° C. </li><li> Byt medium var 3 dagar genom att försiktigt suga hälften avmediet och tillsats av samma volym av färskt RPMI-1640-medium kompletterat med 10% HI-FCS. Använd LPS fria lösningar och föreningar och låga LPS nivåer i HI-FCS (0,05 ng / ml eller mindre). OBS: En mild medel förändring är absolut nödvändigt eftersom Gφ, som utvecklas i kultur inte ordentligt fäster till odlingsskålen och kraftig tvätt kan också tvätta ur utvecklings celler. Utseendet på Gφ är märkbar vid 3 - 4 dagar efter PMN odling, beroende på blodgivaren. De flesta av de analyser och analyser som beskrivs här utförs mellan 6 - 7 dagar i kultur, när Gφ är mycket stora. Det bör noteras att tillsats av en - 10 ng / ml LPS till RPMI-1640-medium inte påverkade Gφ utveckling i odling. 14 </li></ol> 2. Confocal Laser Scanning Microscopy <ol style="margin-left: 40px;"><li> Förbered cytospins 16 från nyisolerade neutrofiler, och från 7 dagar utvecklade Gφ kulturer(Framställd i avsnitt 1). OBS: För att öka koncentrationen av Gφ i skålen för olika analyser, försiktigt bort hälften av mediet. Se till att Gφ inte detekteras i det avlägsnade mediet genom att undersöka mediet under ett ljusmikroskop. Då, intensivt pipettera den återstående mediet för att avlägsna lätt vidhäftat Gφ. Centrifugera mediet under 10 minuter vid 200 xg, och återsuspendera pelleten i 100-120 ^ il medium. <ol><li> Använd 100 - 120 ul av mediet innehållande celler för varje bild. Förbered dubbletter eller trippelglas från varje behandling. Spin för 7 minuter vid 84 x g. </li></ol></li><li> Torka de spunna cellerna och fixera cellerna med 4% paraformaldehyd vid rumstemperatur under 10 min under en kemisk huva. Tvätta 3x med PBS (~ 100 | il under några sekunder per tvättning). För intracellulär färgning, permeabilize celler med 0,5% Triton X-100 i PBS vid rumstemperatur under 10 minuter och tvätta 5x med PBS. OBS: I alla stadier, använda lämpliga buffert / lösning VOLUmig för att täcka omkretsen av cellerna på objektglaset. Använd en hydrofob barriär penna för att bestämma celler omkrets. Varning: Paraformaldehyd är giftig. Undvik kontakt med hud och ögon. Bär lämplig personlig skyddsutrustning. </li><li> Blockera celler med 10% normalt getserum i RPMI-1640-medium och inkubera över natten vid 4 ° C eller vid rumstemperatur under 40 min. Tvätta med PBS. </li><li> Inkubera med enda antikropp (Ab) eller en kombination av mus och kanin primära antikroppar (ABS) vid en 1: 100 spädning (~ 100 | il). Inkubera över natten (18-20 timmar) vid 4 ° C. OBS: Här ingår musmonoklonal Abs: anti-CD14, anti-CD63, anti-CD66b, anti-CD1c, anti- CD15 och anti-cytokrom bs-245 lätt kedja (p22- phox identifiering). Kanin polyklonalt Abs ingår: anti-CD68, anti-CD36, anti-LC3B, anti-Myeloperoxidas, anti-neutrofil elastas (NE), och anti-Nox2 / gp91- phox Abs. Isotypkontrollerna ingår renad mus IgG1 och IgG2, och kanin-IgG. prepare de Abs enligt tillverkarens instruktioner och använda lämplig volym (ca 100 | j, l) för att täcka omkretsen av cellerna. </li><li> Tvätta cellerna och inkubera med 1/400 sekundära antikroppar Cy2-CF (488A) -konjugerat get-anti-kanin-IgG (grön) och / eller Cy5 (CF 647) -konjugerad get-anti-mus-IgG (röd) vid rumstemperatur under 40 min. OBS: Späd och förbereda Abs enligt tillverkarens anvisningar. </li><li> Efter tvätt, montera bilder med en droppe monteringsmedium, innehållande 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) för nukleär färgning, sedan omedelbart placera täckglaset. </li><li> Analysera bilderna av en konfokala laserskanningssystem med hjälp av fluorescensmikroskop och Plan Apo 40X immersionsolja mål. Utföra analysen inom 30 min till 2 h efter beredning av bilderna eller hålla vid 4 ° C över natten. <ol><li> Beräkna cellområdet och fluorescensintensitet med hjälp av en bildbehandlingsprogram (t.ex. Bild J). För samlokalisering, quantify av programvara med hjälp av Manders Overlap koefficient (MOC) 17. OBS: Endast celler med MOC&gt; 0,6 kan betraktas som celler med betydande samlokalisering. </li></ol></li></ol> 3. Transmigration av PMN Across endotelceller: Effekter av IL-8 på Giant fagocyt (Gφ) Formation OBS: Använd 24-väl genomsläppliga cellodling infogas för celltrans analysen. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Coat den övre kammaren av insatsen med 150 pl fibronektin vid en koncentration av 50 pg / ml, och hålla vid rumstemperatur i 30 minuter. </li><li> Lägga till den övre kammaren 5 x 10 4 EA.hy926 endoteliala celler / brunn, återsuspenderades i 150 pl formulerad Dulbeccos modifierade Eagles medium (komplett tillväxtmedium). OBS: Se till att endothelial monolager är sammanflytande före användning. </li><li> Till den undre kammaren, tillsätt 700 | il av den fullständiga tillväxtmediet. </li><li> Placera den permeablacellodling infogas i klusterbrickor och kultur EA.hy926 endotelceller för 2 dagar vid 37 ° C i 5% CO2. OBS: Parallellt den andra dagen förbereda färsk PMN (som beskrivs i avsnitt 1). </li><li> Efter 2 dagar, byt mediet i de nedre och övre kamrarna av skären. <ol><li> Till den undre kammaren, tillsätt RPMI-1640-medium kompletterat med 10% IH-FCS och interleukin (IL) -8 vid en slutlig koncentration av 50 nM / ml. Lägg inte till IL-8 för att styra lägre kammare. </li><li> Till varje övre kammaren, tillsätt 10 6 färsk PMN i 100 pl RPMI-1640-medium kompletterat med 10% IH-FCS. </li></ol></li><li> Inkubera kluster brickorna vid 37 ° C i 5% CO2 under 90 min. </li><li> Efter 90 minuters inkubation, avlägsna cellerna från den övre och nedre kamrarna separat och räkna varje subpopulation. Express celler i varje kammare som en procentandel av de totala cellerna tillsätts. OBS: Ta försiktigt bort celler från övre Chamber genom att pipettera försiktigt för att undvika att ta bort endotelceller och överföra till ett sterilt rör. Avlägsnande av cellerna från den nedre kammaren genom att pipettera och tvättning av nedre kammaren med 500 | j, l och överför till en andra steril rör. </li><li> Pool 10 6 celler från flera brunnar i transmigrating (nedre kammaren) och icke-migrerande (övre kammaren) PMN fraktionerna och kultur var under 7 dagar utan tillväxtfaktorer som anges i steg 14-16 (avsnitt 1). </li><li> Spin celler på objektglas 16 och analysera de utvecklade cellerna i varje odlingsbetingelse genom konfokalmikroskopi som beskrivs i avsnitt 2. </li></ol>

<ol>
	<li>Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils,+from+marrow+to+microbes.">Neutrophils, from marrow to microbes.</a> Immunity. 33, 657-670 (2010).</li><li>Silva, M. T., Correia-Neves, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+macrophages:+the+main+partners+of+phagocyte+cell+systems.">Neutrophils and macrophages: the main partners of phagocyte cell systems.</a> Front. Immunol. 3, 174 (2012).</li><li>Cowburn, A. S., Condliffe, A. M., Farahi, N., Summers, C., Chilvers, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+neutrophil+biology:+clinical+implications.">Advances in neutrophil biology: clinical implications.</a> Chest. 134, 606-612 (2008).</li><li>Duffin, R., Leitch, A. E., Fox, S., Haslett, C., Rossi, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+granulocyte+apoptosis:+mechanisms,+models,+and+therapies.">Targeting granulocyte apoptosis: mechanisms, models, and therapies.</a> Immunol. Rev. 236, 28-40 (2010).</li><li>Silva, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+phagocytosis+of+neutrophils+at+inflammatory/infectious+foci:+a+cooperative+mechanism+in+the+control+of+infection+and+infectious+inflammation.">Macrophage phagocytosis of neutrophils at inflammatory/infectious foci: a cooperative mechanism in the control of infection and infectious inflammation.</a> J. Leukoc. Biol. 89, 675-683 (2011).</li><li>Witko-Sarsat, V., Pederzoli-Ribeil, M., Hirsch, E., Sozzani, S., Cassatella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulating+neutrophil+apoptosis:+new+players+enter+the+game.">Regulating neutrophil apoptosis: new players enter the game.</a> Trends Immunol. 32, 117-124 (2011).</li><li>Cassatella, M. A., Locati, M., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Never+underestimate+the+power+of+a+neutrophil.">Never underestimate the power of a neutrophil.</a> Immunity. 31, 698-700 (2009).</li><li>Zhang, X., Majlessi, L., Deriaud, E., Leclerc, C., Lo-Man, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coactivation+of+Syk+kinase+and+MyD88+adaptor+protein+pathways+by+bacteria+promotes+regulatory+properties+of+neutrophils.">Coactivation of Syk kinase and MyD88 adaptor protein pathways by bacteria promotes regulatory properties of neutrophils.</a> Immunity. 31, 761-771 (2009).</li><li>Araki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+postmitotic+neutrophils+into+macrophages+by+growth+factors.">Reprogramming of human postmitotic neutrophils into macrophages by growth factors.</a> Blood. 103, 2973-2980 (2004).</li><li>Iking-Konert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+the+dendritic+cell+marker+CD83+on+polymorphonuclear+neutrophils+(PMN):+divergent+expression+in+acute+bacterial+infections+and+chronic+inflammatory+disease.">Up-regulation of the dendritic cell marker CD83 on polymorphonuclear neutrophils (PMN): divergent expression in acute bacterial infections and chronic inflammatory disease.</a> Clin. Exp. Immunol. 130, 501-508 (2002).</li><li>Rydell-Tormanen, K., Uller, L., Erjefalt, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+cannibalism--a+back+up+when+the+macrophage+clearance+system+is+insufficient.">Neutrophil cannibalism--a back up when the macrophage clearance system is insufficient.</a> Resp. Res. 7, 143 (2006).</li><li>Esmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+of+apoptotic+cells+by+neutrophil+granulocytes:+diminished+proinflammatory+neutrophil+functions+in+the+presence+of+apoptotic+cells.">Phagocytosis of apoptotic cells by neutrophil granulocytes: diminished proinflammatory neutrophil functions in the presence of apoptotic cells.</a> J. Immunol. 184, 391-400 (2010).</li><li>Nordenfelt, P., Tapper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosome+dynamics+during+phagocytosis+by+neutrophils.">Phagosome dynamics during phagocytosis by neutrophils.</a> J. Leukoc. Biol. 90, 271-284 (2011).</li><li>Dyugovskaya, L., Berger, S., Polyakov, A., Lavie, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+giant+phagocytes+in+long-term+neutrophil+cultures.">The development of giant phagocytes in long-term neutrophil cultures.</a> J. Leukoc. Biol. 96, 511-521 (2014).</li><li>Dyugovskaya, L., Berger, S., Polyakov, A., Lavie, P., Lavie, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermittent+Hypoxia+Affects+the+Spontaneous+Differentiation+In+Vitro+of+Human+Neutrophils+into+Long-Lived+Giant+Phatocytes.">Intermittent Hypoxia Affects the Spontaneous Differentiation In Vitro of Human Neutrophils into Long-Lived Giant Phatocytes.</a> Oxid. Med. Cell. Longev. , 9636937 (2016).</li><li>Mihalache, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation-associated+autophagy-related+programmed+necrotic+death+of+human+neutrophils+characterized+by+organelle+fusion+events.">Inflammation-associated autophagy-related programmed necrotic death of human neutrophils characterized by organelle fusion events.</a> J. Immunol. 186, 6532-6542 (2011).</li><li>Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Colocalization+of+Objects+in+Dual-Color+Confocal+Images.">Measurement of Colocalization of Objects in Dual-Color Confocal Images.</a> J. Microsc. 169, 375-382 (1993).</li><li>Matsushima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+differentiation+into+a+unique+hybrid+population+exhibiting+dual+phenotype+and+functionality+of+neutrophils+and+dendritic+cells.">Neutrophil differentiation into a unique hybrid population exhibiting dual phenotype and functionality of neutrophils and dendritic cells.</a> Blood. 121, 1677-1689 (2013).</li><li>Oehler, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+granulocyte-committed+cells+can+be+driven+to+acquire+dendritic+cell+characteristics.">Neutrophil granulocyte-committed cells can be driven to acquire dendritic cell characteristics.</a> J. Exp. Med. 187, 1019-1028 (1998).</li><li>Berton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+Gigantism:+a+new+way+to+prolong+neutrophil+life.">Editorial: Gigantism: a new way to prolong neutrophil life.</a> J. Leukoc. Biol. 96, 505-506 (2014).</li><li>Milde, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multinucleated+Giant+Cells+Are+Specialized+for+Complement-Mediated+Phagocytosis+and+Large+Target+Destruction.">Multinucleated Giant Cells Are Specialized for Complement-Mediated Phagocytosis and Large Target Destruction.</a> Cell. Rep. 13, 1937-1948 (2015).</li><li>Deretic, V., Saitoh, T., Akira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+infection,+inflammation+and+immunity.">Autophagy in infection, inflammation and immunity.</a> Nat. Rev. Immunol. 13, 722-737 (2013).</li></ol>

Författarna har ingenting att lämna ut.

Giant fagocyter (Gφ) är en nyligen definierade subpopulation av neutrofila-härledda celler som uttrycker grundläggande och specifika neutrofila markörer såsom CD66b / CD15 / CD63 / MPO / NE. Denna typ av neutrofil-härlett fagocyt var inte beskrivits i litteraturen tidigare. Till skillnad från neutrofiler som är kortlivade och genomgår apoptos, Gφ är Annexin-V-negativa och visa utökad livslängd. Men som neutrofiler, Gφ internalisera även partiklar och producera NADPH-oxidas-beroende ROS som svar på dessa partiklar och PMA. Men för att deras förmåga internalisera OxLDL och därmed producera ROS är unika egenskaper Gφ. 14 Ett antal faktorer har visat sig påverka utvecklingen i kultur. Bristen på externa cytokiner eller tillväxtfaktorer i tillväxtmediet är väsentlig (specifikt GM-CSF / IL-4). Men neutrofiler migration mot IL-8 visat sig vara en diskriminerande faktor mellan dem som devrymt in Gφ och de som inte gjorde det. Även internalisering av skräp som härrör från apoptotiska neutrofiler, ett uttryck för Autophagy proteiner (LC3B) och funktionella NADPH-oxidas, var alla visat sig vara nödvändigt för deras utveckling, eftersom deras hämning hindrade Gφ bildning (Figur 1). Tydligen, utvecklingen av dessa jätteceller som härrör från neutrofiler skiljer sig från det som kännetecknar jättecellbildning i monocyt / makrofag-härkomst. Den senare formen flerkärnjätteceller i samband med olika kroniska inflammatoriska sjukdomar, 20, 21, medan den neutrofila Gφ beskrivs här utvecklas via autophagocytosis, genom att uppsluka cellrester och förblir oftast monokärnbildas hela deras utveckling, 14 (sällan men ibland en andra kärna kan observeras). Dessutom har ett antal kontroller etablerat sin neutrofil ursprung: (1) expression av de specifika neutropilic markörer och frånvaro av dendritiska och monocytisk härstamningsmarkörer, (2) deras hämmas utveckling i monocyter / PMN co-kulturer, (3) deras olika rörelsemönster i kultur från makrofager (vilket framgår av levande cell imaging och tid -lapse mikroskopi), 14 (4) deras ljus vidhäftning till plastskålar och (5) deras utveckling från ren CD15 + / CD14 - PMN förvärvats av flödescytometri. Några av de funktioner som anges in vitro kan ge oss ledtrådar till deras potentiella funktioner in vivo. Till exempel, att förmågan hos Gφ konsumerar stora mängder av neutrofila granuler och skräp, förekomsten av stora vakuoler, och uttrycket LC3B - en autophagy protein som bidrar till att minska inflammation genom reglerings interaktioner med medfödda immunsignalvägar, 22 - som alla stödavlägsnande förmågor. Som sådanDessa fynd tyder också på att Gφ kan fungera på inflammatoriska platser där M O / DC-systemet är otillräcklig eller överväldigad, och på så sätt bidra till att lösa inflammation. Detta begrepp kan stödjas av det faktum att Gφ utveckling i blandade monocyt / neutrofila kulturer hämmas. 14 också, med tanke på att Gφ uttrycka oxLDL renhållare receptorer (CD36, CD68), internalisera oxLDL och producera ROS som svar på det, kan tyda på att de är inblandade i aterosklerotiska processer för att lösa inflammation. Eftersom Gφ utvecklade endast från neutrofiler som migrerade mot IL-8 och neutrofiler &quot;trans över endotelceller monolager mot IL-8 representerar neutrofil rekrytering till akuta inflammatoriska ställen, detta fynd även kan stödja antiinflammatoriska funktioner. Omvänt kan utförandet av Gφ i vissa inflammatoriska tillstånd gör det möjligt för dem att fullgöra granulat beståndsdelar och ROS därmed bidra till perkonsekvent inflammation och vävnadsskada. 20 Men totalt sett, deras autophagic förmåga tyder på att Gφ sannolikt inblandade i fallande den inflammatoriska responsen snarare än permanenta den. Intressant har vi nyligen identifierat närvaron av Gφ i humana aterosklerotiska plack. (i förberedelse). Men ett stort antal frågor återstår att redas ut. Till exempel, är Gφ pro- eller anti-inflammatoriskt? Vilka är de faktorer som bestämmer deras bildning och funktion in vitro eller in vivo? Vilken specifik neutrofilt subpopulation är deras föregångare cell som underlättar deras utveckling i Gφ? Är de i samband med vissa sjukdomar och som? Tillsammans utgör intressanta frågor om deras ursprung och potentiella funktioner. Men kritiska steg och fallgropar i protokollet bör hållas i åtanke. Ett kritiskt steg i utvecklingen av Gφ is odling av rena neutrofiler i medium som saknar cytokiner, tillväxtfaktorer eller antibiotika. En annan avgörande steg är att utesluta att Gφ utvecklas från kontaminerande monocyter och fastställa neutrofila ursprung Gφ. Alltså, efter blodseparation genom diskontinuerlig gradient, neutrofilerna rades vidare utsattes för ett ytterligare steg med rening genom flödescytometri med användning av granulocyt gating och CD15 + / CD14 - markörer. Den utvecklade Gφ erhållen från neutrofiler som renades vidare genom flödescytometri separation skilde sig inte från de som inte utsattes för detta reningssteg. Därför är de flesta av de experiment utfördes utan flödescytometri reningssteg på grund av ytterligare cellförlust. Notera i vissa sällsynta fall vissa eosinofiler noterades i kultur. Deras storlek oförändrad under hela odlingsperioden. Vi bör också notera att även om det finns ett antal metoderför neutrofila separation från humant blod, den metod som beskrivs här är det enda sättet vi anställda och därför kan vi inte jämföra Gφ utveckling av andra tillgängliga metoder för neutrofila separation. En stor fallgrop att utreda Gφ resultat av oförmågan att få tillräckligt antal ren Gφ befolkning som lämpar sig för olika biokemiska analyser. Det är i princip omöjligt under de förhållanden våra experiment genomfördes. För det första är utbytet av Gφ låg. Från 1,0 x 10 6 PMN såddes cirka 100-200 Gφ utvecklas efter sju dagar i kultur, beroende på blodgivare. För det andra är det i princip svårt just nu att separera utvecklade Gφ i kultur från den återstående neutrofila skräp i skålen. Dessa begränsningar har gjort det praktiskt taget omöjligt att analysera cellerna genom biokemiska eller molekylärbiologiska metoder. Därför är detta protokoll fokuserar på att beskriva Gφ identifiering och funktion med hjälp av ljusoch konfokalmikroskopi. Deras morfologiska omvandling från neutrofiler till Gφ i kultur följdes också av levande cell imaging och time lapse mikroskopi. 14 Uppenbarligen kan mycket större blodvolymer behövs för att genomföra biokemiska eller molekylärbiologiska metoder och övervinna det låga utbytet erhållits och separera livskraftig Gφ från neutrofiler &quot;skräp i skålen. Sammanfattningsvis har vi nyligen beskrevs för första gången utvecklingen av Gφ i kultur, en subpopulation av långlivade fagocyter av neutrofila ursprung. Därför är detta den enda metoden för närvarande finns tillgängliga för att erhålla Gφ i odling, även om de två stora begränsningar som nämnts ovan bör övervinnas (det låga utbytet av Gφ erhållen i kultur och oförmågan att separera den utvecklade Gφ från neutrofil skräp i kulturen maträtt). Ändå deras framställning och identifiering, som presenteras i detta protokoll, är essential för forskare som är intresserade av inflammatoriska svar och neutrofila biologi och plasticitet, i syfte att ytterligare undersöka den potentiella betydelsen och funktioner Gφ.

Polymorfonukleära neutrofiler (PMN) utgör den största populationen av leukocyter i blodet, som fungerar som den första försvarslinjen mot invaderande patogener genom att producera ett brett spektrum av cytotoxiska molekyler. Den traditionella synen har länge varit att cirkulerande blod, kortlivad, professionella fagocyter, som är de första att anlända till akuta inflammatoriska platser för att bekämpa infektioner och stöd i avslutandet av patogener och skadliga partiklar. 1 I sin icke-aktiverade tillstånd, neutrofiler är konstitutivt engagerade i apoptos. När du migrerar från blodet till inflammationsställen, neutrofiler genomgå aktivering för att lösa inflammation. De fagocytera och döda invaderande mikroorganismer, genom att producera en rad cytotoxiska molekyler som reaktiva syreföreningar (ROS), lytiska enzymer såsom neutrofilelastas (NE) och katepsiner med potent mikrobicid aktivitet. För att fånga patogener, neutrofiler frisläpper också extracellulära fällor (NET) Som består av kärn kromatin trådar som innehåller antibakteriella peptider och olika lytiska enzymer. Emellertid kan okontrollerat utsläpp av dessa cytotoxiska molekyler från neutrofiler också föreviga inflammatoriska svar och framkalla skador på omgivande vävnader. 2 Därför är en effektiv clearance av apoptotiska neutrofiler genom makrofager (M O) och dendritiska celler (DC) avgörande för att lösa inflammation. 3, 4, 5, 6 Under de senaste åren har det dock blivit allt tydligare att neutrofiler är mycket mångsidiga celler, vars funktioner går långt utöver fagocytos och patogen dödande. 6, 7 genom att genomgå priming eller aktivering är neutrofila plasticitet gradvis att få uppmärksamhet. Till exempel, bakterier och svamp utmanade neutrofiler visade sigutsöndrar interleukin (IL) -10 och kontrollera den inflammatoriska responsen, vilket tyder på förekomsten av immunreglerande svar. 8 Post-mitotiska neutrofiler visade sig trans differentiera till M O-liknande celler, eller DC-liknande celler genom att smälta och presentera antigen fragment vid behandling med cytokiner och tillväxtfaktorer, 9, 10 således, som betjänar en kritisk roll för att integrera medfödda och adaptiva svar. 3, 6 Aktivering av tillväxtfaktorer främjas omvälvning av apoptotiska neutrofiler eller cellrester, och därmed underlätta clearance av skräp vid inflammationsställen och upplösningen av inflammation, 3, 9 särskilt när M O / DC klareringssystem är otillräcklig eller överväldigad, 11, 12 vilket tyder på potential &quot;självreglering&quot; för att hjälpa relösa det inflammatoriska svaret. Detta eftersom apoptos är en form av reglerad själv död, som kan hämma extracellulär frisättning av cytotoxiska föreningar och sålunda förhindra skada på omgivande vävnader. 6 Förlängd överlevnad är en annan funktion av neutrofil aktivering och påvisades genom behandling med olika värd härledda faktorer såsom granulocyt-kolonistimulerande faktor (G-CSF), granulocyt-makrofag-kolonistimulerande faktor (GM-CSF), inflammatoriska cytokiner såsom interferon ( IFN) -γ, tumörnekrosfaktor (TNF) -a och / eller patogena framställda produkter, alltså, så neutrofiler att modulera deras överlevnad svar. 6 I själva verket är neutrofila överlevnad en förutsättning för dess plasticitet och i samband med dess förmåga att utföra fagocytos. 6, 13 Följaktligen var det också visat sig associera med fenotypiska och funktionella förändringar som depended på uppregleras genuttryck genom att inducera syntes av nya proteiner involverade i neutrofil livslängd förlängning, och minskade apoptos. 10 Till skillnad från neutrofiler som är kortlivade och konstitutivt genomgår apoptos i odling, eller cytokiner / tillväxtfaktorer-aktiverade neutrofiler, som beskrivits ovan, som har förlängda livslängden, har vi nyligen identifierat en ny, liten subpopulation av neutrofiler som utvecklar spontant i långvarig standardodlings villkor från nyligen isolerade humana blod neutrofiler utan externt lägga cytokiner eller tillväxtfaktorer. 14 Dessa neutrofil-härledda celler, som inte beskrivits tidigare i litteraturen benämndes jätte fagocyter (Gφ). Den Gφ har förlängt livslängden i kultur, är de fullt utvecklade inom 5-7 dagar, och kännetecknas av unika morfologiska egenskaper, fenotypiska uttrycket och funktioner. De är kraftigt förstorade på grund av autophagocytosis av döda neutrofiler lämningar, vakuoliserade och innehåller phagolysosomes. Den Gφ uttrycker specifika neutrofila granuler markör - kluster av differentiering (CD) 66b, de azurofila granuler markörerna - CD63 och myeloperoxidas (MPO) och ytterligare neutrofiler markörer såsom CD11b, NE, CD15, de NADPH-oxidas subenheter gp91- phOx och p22- phOx och autophagy markör -LC3BII. 14, 15 Funktionellt de aktivt ta upp latexpärlor och zymosan partiklar och genererar ROS som svar på zymosan och forbol-12-myristat 13-acetat (PMA) stimulering. Intressant, till skillnad från färska neutrofiler, Gφ också intensivt uttrycka renhållare receptorer CD68 och CD36, ta upp oxiderat lågdensitetslipoprotein (oxLDL), och generera ROS som svar på stimulering med oxLDL. Dessutom Gφ saknar de monocytiska härstamning markörer CD14, CD16 och CD163 eller dendritiska markörer CD1c och CD141. Dessutom phagocytosis och autophagy och sannolikt funktionellt NADPH-oxidas är en förutsättning för deras utveckling. Detta eftersom, fagocytos-hämmaren cytochalsin B, den Autophagy inhibitorer 3-metyladenin (3-MA) ​​och bafilomycin (BafA1) och NADPH-oxidas-hämmare - difenylen jodonium (DPI) - förhindrade deras utveckling. Dessutom, monocyter / neutrofiler samodlingar samt exponering för intermittent hypoxi hindras deras utveckling, medan neutrofila anpassning till ihållande hypoxi var uppenbar. 14,15 Deras föreslagna utvecklingen i kultur illustreras i figur 1 .Den protokoll i detta dokument beskriver steg för steg framställningen av Gφ från nyligen isolerade cirkulerande humana blod neutrofiler, deras utveckling, identifiering och vissa grundläggande egenskaper. Detta protokoll kan användas för att ytterligare undersöka och avslöja det breda spektrum och rollerna för dessa nyligen beskrivits och spännande neutrofil-härlett Gφ för att characterize deras betydelse och deras potentiella funktioner. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/54826/54826fig1.jpg" /> Figur 1: Schematisk representation av jätteceller utveckling 7 Dag neutrofila kulturer. Det föreslås att vid inflammatoriska ställen (1) neutrofiler genomgå apoptotisk celldöd, och (2) frigörmembran inringade fragment innehållande kärn skräp, granulat (gröna och röda prickar) och andra subcellulära komponenter som utlöser Autophagy mekanismer. (3) Jätte fagocyter (Gφ) utvecklas på lång sikt neutrofila kulturer saknar cytokiner eller tillväxtfaktorer från internalisera apoptotiska kroppar och neutrofila skräp, samtidigt som funktionella NADPH oxidase.They kännetecknas av olika neutrofilt CD66b + / CD63 + / MPO + / CD15 + / CD11b + / NE markörer, stora fagosomer omsluter granuler och cellrester, och asätare receptorer CD36 och CD68. gb1; är oftast mononukleära celler, som kan internalisera också olika partiklar och oxiderat LDL och generera ROS. Membranen i vakuoler fyllnings Gφ innehåller LC3B (markerat med mörkblå), en markör av autophagosomal membran, vilket antyder ett strikt samband mellan autophagy och jätte fagocyt bildning. Gφ utvecklar inte i medium innehållande GM-CSF / IL-4. Även inhibitorer såsom NADPH-oxidas-hämmare - difenylen jodonium (DPI), de Autophagy hämmare 3-metyladenin (3-MA) ​​och bafilomycin (BafA1) och fagocytos hämmaren cytochalasin B (. Cyto B) avskaffa deras bildning. (4) Potentiella Gφ funktioner in vivo kan omfatta anti- eller pro-inflammatoriska egenskaper och deltagande i aterosklerotiska processer (denna siffra är baserad på våra resultat 14, 15 och ändrades från medföljande Ledare av BErton 20). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54826/54826fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1272">
		<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:479px;">Sterile scalp vein set (21GX3/4)&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Bio Diagnostics Ltd.</td>
			<td style="width:131px;"># 20080312</td>
			<td style="width:433px;">A strile needle for venipancture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VACUETTE HOLDEX Single-Use Holder PP</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td># 450263</td>
			<td>For securing during venipuncture&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VACUETTE Tube K3E K3EDTA (16x100/9 ml)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td># 455036</td>
			<td>Sterile tube for blood collection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nunclon MultiDish (24 wellx1ml)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td># 142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polypropylene conical centrifuge tube (50 ml)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td># E14103PJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Transwell-24 well (transmigration assay)</td>
			<td>Corning</td>
			<td># CA-3415</td>
			<td>Polycarbonate membrane, 6.5 mm diameter, 3 &#956;m pores)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI-1640 medium</td>
			<td>BioIndustries</td>
			<td># 01-100-1A</td>
			<td>Do not add antibiotics&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EA.hy926 (ATCC CRL2922)&#160;&#160;</td>
			<td style="width:231px;">BioIndustries</td>
			<td># CRL-2922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ATCC-formulated Dulbecco&#8217;s&#160; Modified Eagle&#8217;s Medium</td>
			<td>BioIndustries</td>
			<td># 302002</td>
			<td>complete growth medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polysucrose - Histopaque1119</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># 1119-1</td>
			<td>Tissue culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polysucrose - Histopaque1077</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># 1077-1</td>
			<td>Tissue culture grade&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate buffered saline (PBS) - ion free</td>
			<td>BioIndustries</td>
			<td># 02-023-1A</td>
			<td>Cell biology and molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heat inactivated Fetal calf serum (HI-FCS)</td>
			<td>BioIndustries</td>
			<td># 04-121-1B</td>
			<td>Cell biology grade or tissue culture grade, low LPS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># S3014</td>
			<td>Molecular biology grade, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Paraformaldehyde, 16%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td># 15710</td>
			<td>Cell bology grade or tissue culture grade (only 16% PFA)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=9002-93-1&amp;interface=CAS%20No.&amp;N=0&amp;mode=partialmax&amp;lang=en&amp;region=IL&amp;focus=product"># 9002-93-1</a></td>
			<td>Molecular biology grade&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Normal Goat Serum</td>
			<td>BioIndustries</td>
			<td># 04-009-1</td>
			<td>Cell biology and molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypan blue</td>
			<td>BioIndustries</td>
			<td># 031021B</td>
			<td>Tissue culture grade&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">May-Gr&#252;nwald</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># MG500</td>
			<td>Cell biology grade-(procedure No GS-10)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Giemsa stain Kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># 48900</td>
			<td>Cell biololgy grade-(procedure No GS-10)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fibronectin</td>
			<td>BioIndustries</td>
			<td># 03090105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:479px;">Human Interleukin-8 (CXCL8)</td>
			<td style="width:231px;">PeproTech</td>
			<td># 200-08-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-CD14 (clone 5A3B11B5)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td># sc-58951</td>
			<td>Mouse IgG2b; expressed by&#160; monocytes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-CD63 (clone MX-49.129.5)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td># sc-5275</td>
			<td>Mouse IgG1; expressed by neutrophils</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-CD66b (clone 80H3)</td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td># MCA216</td>
			<td>Mouse IgG1; expressed by neutrophils</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-CD1c (BDCA-1) (clone AD5-8E7)</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td># 130-090-695</td>
			<td>Mouse IgG2a; expressed by&#160; dendritic cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-CD15 (clone MY-1)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td># ab754</td>
			<td>Mouse IgM; expressed by neutrophils</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Cytochrome b-245 Light Chain (p22-phox) (clone 44.1)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td># 650001</td>
			<td>Mouse IgG2a; to recognize neutrophil NADPH oxidase complex</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-CD68</td>
			<td>Protein Tech</td>
			<td># 16192-1-AP</td>
			<td>Rabbit IgG; to recognize oxLDL scavenger receptor&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-LC3B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td># L7543</td>
			<td>Rabbit IgG&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Myeloperoxidase</td>
			<td>Abcam</td>
			<td># ab45977</td>
			<td>Rabbit IgG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Neutrophil elastase</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td># 481001</td>
			<td>Rabbit IgG&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-NOX2 (gp91-phox)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td># ab131083</td>
			<td>Rabbit IgG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-CD36 (SR-B3)</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td># NB400-144</td>
			<td>Rabbit IgG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Purified Mouse IgG1, &#954; Isotype Control (clone MG1-45)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td># 401401</td>
			<td>Antibody used as isotype control</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Purified Mouse IgG2a, &#954; Isotype Control (clone MOPC-173)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td># 400263</td>
			<td>Antibody used as isotype control</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Normal rabbit IgG</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td># sc-2027</td>
			<td>Antibody used as isotype control</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CF488A Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Biotium&#160;</td>
			<td># 20012</td>
			<td>Anti-Rabbit IgG with the green fluorescent dye CF488A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CF647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Biotium&#160;</td>
			<td># 20043</td>
			<td>Anti-Rabbit IgG with the red fluorescent dye CF647</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CF488A Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Biotium&#160;</td>
			<td># 20010</td>
			<td>Anti-Mouse IgG with the green fluorescent dye CF488A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CF647 Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Biotium&#160;</td>
			<td># 20040</td>
			<td>Anti-Mouse IgG with the red fluorescent dye CF647</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescent Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vectashield H-1000; Vector Lab Inc.</td>
			<td># E19-18</td>
			<td>Nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Confocal laser scanning microscope (LSM 700)&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Carl Zeiss</td>
			<td>Ser.# 3523000380</td>
			<td>Plan Apo x40 immersion oil objective&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zeiss CLSM software (ZEN 2010)</td>
			<td style="width:231px;">Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td>
			<td>version 6.0</td>
			<td>For colocalization analysis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:479px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:231px;">Wayne Rasband, NIH, USA</td>
			<td style="width:131px;">version 1.49k</td>
			<td>For determination of cell&#160; areas and fluorescence intensity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:479px;">Light microscope (Axiovert 25)</td>
			<td style="width:231px;">Carl Zeiss</td>
			<td>Ser.# 201060153</td>
			<td>Examination of cells in culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:479px;">Centrifuge (Megafuge 1.0 R)</td>
			<td style="width:231px;">Heraeus Instruments</td>
			<td># D-37520</td>
			<td>Cells separation from blood; cytospins preparation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Inverted fluorescent microscope (Zeiss Axio Observer Z.1)</td>
			<td style="width:231px;">Carl Zeiss</td>
			<td>Ser.# 3834001470</td>
			<td>Demonstration of giant phagocytes development</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:479px;">Temperature-controlled incubation system (Cube&#38;Box)</td>
			<td>Life Imaging Services</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Temperature control system for microscopes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:479px;">High&#160;resolution digital CCD camera (AxioCam HRm)</td>
			<td style="width:231px;">Carl Zeiss</td>
			<td>Ser.# 117090279</td>
			<td>For capturing high-contrast&#160; image data from an examined cell objects</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development and identification of a novel subpopulation of human neutrophil-derived giant phagocytes in vitro

Neutrofiler (PMN) är mest känd för sina fagocytiska funktioner mot invaderande patogener och mikroorganismer. De har den kortaste halveringstiden bland leukocyter och deras icke-aktiverade tillståndet är konstitutivt åtagit sig att apoptos. När rekryteras till inflammatoriska ställen att lösa inflammation, de producerar en rad cytotoxiska molekyler med potent antimikrobiell dödande. Men när dessa kraftfulla cytotoxiska molekyler frigörs på ett okontrollerat sätt de kan skada omgivande vävnader. Under de senaste åren dock är neutrofila mångsidighet allt bevisas genom att visa plasticitet och immunfunktioner. Vi har nyligen identifierat en ny neutrofil-härlett subpopulation, som utvecklar spontant i standardodlingsförhållanden utan tillsats av cytokiner / tillväxtfaktorer såsom granulocyt-kolonistimulerande faktor (GM-CSF) / interleukin (IL) -4. Deras fagocytiska förmågor neutrofila rester i stor utsträckning bidra till att öka derasstorlek oerhört; därför de kallades jätte fagocyter (Gφ). Till skillnad från neutrofiler, är Gφ långlivade i kultur. De uttrycker kluster av differentiering (CD) neutrofila markörer CD66b / CD63 / CD15 / CD11b / myeloperoxidas (MPO) / neutrofilelastas (NE), och saknar den monocytiska härstamning markörer CD14 / CD16 / CD163 och de dendritiska CD1c / CD141 markörer . De tar också upp latex och zymosan och svara genom oxidativ burst stimulering med opsoniserad-zymosan och PMA. Gφ uttrycker också renhållare receptorer CD68 / CD36, och till skillnad från neutrofiler, internalisera oxiderat-lågdensitetslipoprotein (oxLDL). Till skillnad från färska neutrofiler, eller odlade monocyter, de svarar på oxLDL upptag av ökade reaktiva syreradikaler (ROS) produktion. Dessutom dessa fagocyter innehåller mikrotubuli-associerat protein-1 lätta kedjan 3B (LC3B) belagda vakuoler, vilket indikerar aktivering av autophagy. Användning av specifika hämmare är det uppenbart att både fagocytos och autophagy är prerequisites för deras utveckling och sannolikt NADPH-oxidas beroende ROS. Vi beskriver här en metod för framställning av denna nya subpopulation av långlivade, neutrofiler härrörande fagocytiska celler i odling, identifiering och deras närvarande kända egenskaper. Detta protokoll är en förutsättning för att erhålla och karakterisera Gφ för att ytterligare undersöka deras betydelse och funktioner.

Neutrofil Autophagocytosis och utveckling i kultur Neutrofil autophagocytosis och deras utveckling till Gφ inom 7 dagar i kultur visas i figurerna 3 och 4. Genom dagar 4 - 7, deras storlek var enormt förstorad, 15 och autophagosytosis var tydlig redan efter 90 minuter efter samodling neutrofilerna med fluorescerande membran fläckar (PKH-26, röd, PKH-67, grön). 14 Som en kontroll till denna neutrofil subpopulation, var några neutrofila kulturer behandlades också med GM-CSF / IL-4. De cytokin-behandlade celler ökade i storlek inom 7 - 14 dagar i odling såsom beskrivits tidigare. 18, 19 Men, var mindre än Gφ och hade cytoplasmiska utsprång liknar DC-liknande celler (Figur 5), såsom tidigare b rapporterats<html> y Oehler et al. 19 Även GM-CSF / IL-4 behandlade celler var negativa eller hade en låg CD66b uttryck, 15 tydligt visar morfologiska och potentiellt funktionella skillnader. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54826/54826fig3.jpg" /> Figur 3: Autophagocytosis i utvecklings Giant fagocyter (Gφ) i kultur. Nyligen isolerade renade neutrofiler märktes med PKH-67 (grön) eller PKH-26 (röd) membran fluorescerande färger på nolltid, och sedan samodlades och följs upp till sju dagar. Cellerna centrifugerades på objektglas, kärnor färgades med DAPI och proverna analyserades med konfokalmikroskopi. Autophagocytosis är redan märkbar efter 90 minuter av co-kultur. Sammanslagning av rött och grönt i gult och orange är tydligt i utvecklings Gφ.filer / ftp_upload / 54826 / 54826fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klicka här för att se en större version av denna siffra. <img alt="figur 4" src="/files/ftp_upload/54826/54826fig4.jpg" /> Figur 4: Utveckling av Giant fagocyter (Gφ) i kultur. Nyligen isolerade renade neutrofiler följdes upp till 7 dagar i odling. Cellerna spanns på glasskivor vid de angivna tidsintervallen, färgade med May Grunewald-Giemsa, och analyserades med en ljusfältsmikroskopi. En individ med några eosinofiler presenteras för jämförelse. Notera att storleken av eosinofiler är oförändrad i kultur. Förstoring 100X olja. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54826/54826fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="figur 5" src="/files/ftp_upload/54826/54826fig5.jpg" /> Figur 5: Jämförelse mellan utveckling av Giant fagocyter (G φ) och GM-CSF / IL behandlad Neutrofiler i kultur. (A) maj Grunwald-Giemsa färgade neutrofiler odlades utan (Gφ) och med GM-CSF / IL-4 under 7 dagar. Prover analyserades med en ljus-fält mikroskop. Förstoring, X40. Celler som utvecklas i kulturer med medium kompletterat med GM-CSF / IL-4 visar utbredda cytoplasmiska utsprång men är mindre än Gφ. (B) Nyligen isolerade neutrofiler märktes med PKH-26 (röd) färgämne och odlades i cytokin-fritt medium under 7 dagar eller märkta med PKH-67 (grön) färgämne och odlades i medium supplementerat med GM-CSF / IL-4 för 7 dagar. Därefter tillsattes de utvecklade cellerna blandades i ett 1: 1-förhållande och samodlades under 2 h. Cellerna fixerades och analyserades genom konfokal microscopy. Denna siffra har modifierats referens. 15 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54826/54826fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> För att ytterligare undersöka under Gφ utveckling, deras morfologiska förändringar också följt av tidsförlopp mikroskopi. Video-1 (dag 3 till dag 4) och video-2 (dag 4 till dag 5) visar deras utveckling i renade neutrofila kulturer. Dessa Gφ är icke-vidhäftande eller lätt vidhäftande med begränsad kapacitet rörelse och aktivt äter kring neutrofila rester och skräp. I video-3, är rörelsen av monocyt-härledda M O och Gφ jämförs i en blandad monocyt / neutrofil kultur. Den M O kryper aktivt (vänster, omärkt cell). Den Gφ (höger), är ljus PKH-26 märkt cell. Video-1: Demonstrerar utveckling av Giant fagocyter i renat PMN kulturer på dag 3 - 4 av Time-lapse mikroskopi. Neutrofiler följdes upp i kultur från dag 3 till dag fyra av tidsförlopp microscopy.The time-lapse mikroskopi system består av inverterat motoriserade fluorescerande mikroskop, och en hög upplösning B / W CCD-kamera, med en på scenen inkubator. Bildinsamling förvärv av tidsförlopp togs var 10 min. Ursprungligen publicerad i 14 referens <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54826/Video-1.mpg" target="_blank">Klicka här för att se filmen.</a> <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/54826/54826mov2.jpg" /> Video-2: Demonstrerar utveckling av Giant fagocyter i renat PMN Kultur Dag 4-5 av Timig-lapse mikroskopi. Neutrofiler följdes upp i kultur från dag 4 till dag fem av tidsförlopp mikroskopi. Time-lapse mikroskopi system består av inverterat motoriserade fluorescerande mikroskop, och en hög upplösning B / W CCD-kamera, med en på scenen inkubator. Bildinsamling förvärv av tidsförlopp togs var 10 min. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54826/Video-2.mp4" target="_blank">Klicka här för att se filmen.</a> <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/54826/54826mov3.jpg" /> Video-3: en jätte fagocyt och Macrophage Utvecklad i Co-kultur. Monocyter / neutrofiler co-kultur följdes upp från dag 4 till dag fem av tidsförlopp mikroskopi. Monocyt-härledda makrofager (till vänster); ljus (PKH-26 färgad cell) neutrofil-härlett jätte fagocyt (höger). Time-lapse mikroskopi för video består av inverterad motoriserade fluorescerande microscope, och en hög upplösning B / W CCD-kamera, med en på scenen inkubator. Bildinsamling förvärv av tidsförlopp togs var 10 min. Ursprungligen publicerad i 14 referens <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54826/Video-3.mp4" target="_blank">Klicka här för att se filmen.</a> Expression av markörer i Giant fagocyter Den neutrofil ursprung Gφ verifierades genom positivt uttryck för följande neutrofila markörer CD66b / CD63 / MPO / NE / CD15 (figur 6). Den Gφ uttryckte också NADPH-oxidas, de oxLDL renhållare receptorer - CD68 och CD36, och innehöll LC3B-belagda vakuoler och aggregat (identifierade genom Western blotting som LC3BII 15), som visar närvaron av en autophagy markör. Men de var negativa för monocytisk härkomst (CD14, CD16 och CD163) och dendritic-celler (CD1c och CD141) markörer, vilket tyder på att Gφ inte uppstå från förorenande monocyter. <img alt="figur 6" src="/files/ftp_upload/54826/54826fig6.jpg" /> Figur 6: Expression av olika markörer för neutrofiler, monocyter och dendritiska celler i Giant fagocyter (Gφ) efter 7 dagar i kultur. Positivt uttryck för den neutrofila specifik granulat markör CD66b, den azurofilgranuler markörer CD63 och MPO, neutrofilt elastas och CD15. Negativa uttryck för de dendritiska CD1c och CD141 markörer och monocytiska härstamning markörer CD14, CD16 och CD163. Dessutom Gφ uttryckte autophagy markör LC3B de renhållare receptorer CD68 och CD36 och NADPH-oxidas subenheter gp91-phOx / p22-phOx subenheter. Kärnor färgades med DAPI, och proverna analyserades med konfokalmikroskopi. Denna siffra har modifierats referenser. 14 </sup&gt;, 15 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54826/54826fig6large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> Funktioner av Gφ - NADPH-oxidas Aktivering, ROS Produktion och Fagocytos: Fagocytos av latexpärlor och zymosan var uppenbar i Gφ. Gφ också genererade basala ROS (Figur 7A), och svarade på zymosan och PMA-stimulering genom oxidativ burst (Figur 7B-D). Men till skillnad från monocyter eller neutrofiler, Gφ genererade ROS också som svar på oxLDL stimulans och färgades av Oil Red O (figur 7B, F). Notera behandling av färska neutrofiler med NADPH-oxidas-hämmare - DPI, inte bara hämmade ROS produktion, men också prevented Gφ bildning i kultur, vilket tyder på att ROS-signalering är avgörande för Gφ bildning. 14, 15 <img alt="figur 7" src="/files/ftp_upload/54826/54826fig7.jpg" /> Figur 7: Oxidativ Burst, fagocytos och oxLDL upptag av Giant fagocyter (Gφ). (A) Basal ROS produktion är tydligt i lysosomer Gφ. (B) ROS produktion som svar på oxiderat LDL (oxLDL), PMA och zymosan (zymosan partiklar klart anges). (C) Nitro (NBT) test i Gφ visar respiratoriska utbrott aktivitet utan och med PMA (bilderna är ofärgade, men insatserna är färgade med May Grunwald-Giemsa). (D) NBT-testet och kan Grunewald-Giemsa färgade Gφ med PMA och PMA / DPI som hämmade NADPH-oxidas och ROS. (E) fagocytos av Latex och IgG-zymosan i PKH-26 (röd) färgade celler. (F) Oil Red O färgning i obehandlat och oxLDL behandlade Gφ. Denna siffra har modifierats referenser. 14, 15 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54826/54826fig7large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> Trans av PMN Across endotelceller För att identifiera potentiella neutrofiler delpopulationer som kan utvecklas till Gφ, var migrationen av neutrofiler genom endotelceller cellmonoskikt bestämdes (figur 8A). Efter 90 min, transmigrated 62,3 ± 12,2% av neutrofilerna genom endotelcellerna mot IL-8 i den undre avdelningen. Notera Gφ positivt för CD66b / CD15 / LC3B utvecklats endast från transmigrated populationen av neutrofiler medan de celler som utvecklats från den icke-migrerande neutrofiler fraktion var mindre i storlek och negativ för neutrofila markörer CD66b / CD15 (figur 8B, 8C) . <img alt="Figur 8" src="/files/ftp_upload/54826/54826fig8.jpg" /> Figur 8: Effekter av IL-8-beroende PMN Transmigration Through endotelceller på Giant fagocyt (Gφ) Formation. (A) Ett system som visar neutrofil trans analys över endotelceller monolager (ECS) mot IL-8. Denna analys kan betraktas som en modell för neutrofiler rekrytering till akuta inflammatoriska ställen. (B - C) I analysen cellmigration (som anges i protokoll 3), transmigrating (B) och icke-migrerande (C) neutrofiler fracningar odlades under sju dagar utan tillväxtfaktorer (som i protokoll 1). Därefter tillsattes cellerna centrifugerades på objektglas och analyserades med konfokalmikroskopi. Fixerade celler färgades för CD66b (röd), LC3B (grön) och CD15 (röd). Kärnor färgades med DAPI (blå). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54826/54826fig8large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro at JoVE.com

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Vi beskriver här en metod för att erhålla och identifiera en nyligen tecknas subpopulation av neutrofil-härlett jätte fagocyter. Dessa celler utvecklas i odling från färska humana blod neutrofiler, och kännetecknas av fagocytos, autophagy, oerhört stora, och förlängd livslängd. Denna metod är viktigt att ytterligare undersöka denna unika neutrofil-härlett subpopulation.

Utveckling och identifieringen av en ny underpopulation av humant neutrofilt härrörande Giant fagocyter<em&gt; In Vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Ett<em&gt; In vitro</em&gt; Modell för att studera skillnader mellan de mänskliga makrofagdifferentiering och polarisation

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Analyser för identifiering av nya Virushämmande medel mot blåtungevirus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel<em&gt; In vitro</em&gt; Modell för att studera interaktioner mellan humant helblod och endotelet

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

Upptäckt av HLA-antigen Biomarkers i bröstcancer Använda Label fria Biosensor Teknik

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Visualisera effekterna av Sputum på Biofilm Development Använda en Chambered coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

In vitro- metoder för att jämföra målbindning och CDC-induktion mellan terapeutiska antikroppar: applikationer i biosimilaritetsanalys

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

Simultaneous Distinction of Monospecific and Mixed DFS70 Patterns During ANA Screening with a Novel HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout Substrate

Samtidiga skillnaden av monospecifikt och blandade DFS70 mönster under ANA Screening med romanen HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout substrat

Systemic autoimmune connective tissue disorders are characterized by circulating antinuclear antibodies (ANA). Although there are several technologies ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

En roman Feeder-fria System för massproduktion av murina naturliga mördarceller In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

En roman In Vitro Wound Healing analys för att utvärdera cellmigration

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...