Name: an in vitro model for studying cellular transformation by kaposi sarcoma herpesvirus
Uploaded: 2017-08-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af K12 HD068322 (SCM); R01 CA179921 og P51 OD011092 (AVM); og tildele 14PRE20320014 fra Amerika Heart Association (SB).

Bemærk: alle procedurerne i denne protokol bør udføres BSL-2 betingelser.
 1. KSHV Stock forberedelse <ol><li>forberede TNE buffer: 292.24 mg EDTA i ddH 2 O opløses, bringe til 225 mL, og justeres til pH 8. 605.7 mg Tris i ddH 2 O opløses, bringe til 225 mL, og justeres til pH 8. Kombinere EDTA og Tris løsninger, tilføje 4,38 g NaCl, justere endelige mængden til 500 mL, filtrere steriliseres og opbevares ved 4 ° C .</li>
	<li>Kultur KSHV-positive, E...

Oncogenesis er en omstændelig proces, der omgår vigtige sikkerhedsforanstaltninger inden for en organisme36. KS læsioner findes langs et spektrum af kronisk inflammation til sande sarkomer, kræver udredning af visse patofysiologiske processer, formidlet af KSHV at blive gennemført nogle undersøgelser i celle kultur modeller, der understøtter transformation9. Det skal bemærkes, at tab af kontakt hæmning og forankring-afhængige vækst, fænotyper vejledende for cell...

Kaposis sarkom (KS) er en multi focal angioproliferative tumor påvirker gennem huden, slimhinder og visceralt sites der udvikler sig oftest i fastsættelsen af avancerede immunsuppression1. Fire epidemiologiske former er blevet beskrevet: classic, en indolent form, der typisk rammer ældre mennesker i Middelhavsområdet og Mellemøsten arv; iatrogen, som følge af behandling med immunosuppressive lægemidler efter organtransplantation; epidemien, en AIDS-definerende kræft; og endemiske, en HIV-uafhængig form almindelige hos børn i endemiske områder i Afrika. Med fremkomsten af effektive kombination anti-retroviral medicin regimer til behandling af HIV er epidemi KS langt mindre almindeligt diagnosticeret i udviklingslande. Men de klinisk aggressive endemiske og epidemiske formularer stadig blandt de mest almindeligt diagnosticeret kræft i mange afrikanske lande2,3,4. Identifikation af effektive patogenese-målrettede lægemidler til behandling af KS er derfor prioriteres forskning.
Histologisk, er KS læsioner karakteriseret af omfattende, men unormal neovascularization hvorved spindel celler af EF-oprindelse danner diskontinuert vaskulære netværk5. Disse unormale fartøjer ("vaskulære slidser") tillader ekstravasation af erytrocytter, som giver læsioner deres karakteristiske farve. Derudover indeholde læsioner talrige leukocytter, der karakteriserer kronisk betændelse (dvs., lymfocytter, makrofager og plasma celler). Regression af KS læsioner efter immun rekonstituering er blevet beskrevet, tyder på, at KS har funktioner i både et hyper-proliferativ læsion og en ægte tumor6,7,8,9.
KS herpesvirus (KSHV), det agens af KS, blev identificeret i 199410. Siden så mange in vitro- cellekultur modeller er blevet udviklet for at aktivere patogenese undersøgelser, herunder celler eksplanterede fra tumor biopsi materiale og primære eller at udtrykke telomerase EF inficeret med KSHV in vitro-11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18. ingen af de aktuelt tilgængelige modeller fuldt sammenfatter KS tumor mikromiljø, men alle har bidraget med værdifuld viden til vores forståelse af pathobiology af KSHV infektion. I modsætning til de andre kendte tumorfremkaldende humant herpesvirus Epstein - Barr virus (EBV), KSHV ikke let transformere celler i kultur efter de novo infektion19,20,21, 22. imidlertid denne begrænsning har overvundet af transducing primære menneskelige EF af enten iblandet E6 mikrovaskulære eller lymfatisk oprindelse og E7 gener fra human papillomavirus type 16 forud for infektion med KSHV23,24 . Udtryk for disse eksogene onkogener øger dramatisk transformerende potentialet i KSHV in vitro- delvis ved at tilbyde yderligere hæmning af Retinoblastom-protein og p5323,-24. Denne EF transduktion metode har tilladt flere laboratorier til at identificere vigtige ændringer i vært celle genekspression der er fremkaldt af KSHV infektion og der synes at lette KS celle overlevelse og spredning25,26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. de protokoller er beskrevet heri er ligetil og meget reproducerbar, og vil resultere i generation af alder - og passage-matchede KSHV-inficerede EF og mock-inficerede objekter, der kan være kulturperler i langt længere tid end primærelementer og vil giver mulighed for undersøgelse af muterede mekanismer ansat af KSHV. Selv om protokollen inkluderer en metode til produktion af vildtype KSHV fra den primære effusion lymfom cellelinje BCBL-1, E6/E7-udødeliggjort EF er også meget modtagelige for stammer infektion med rekombinante BACmid KSHV-BAC1630. Protokoller for forberedelse af BAC16 er beskrevet andetsteds33,34.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BCBL-1 cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>3233</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PA317 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2203</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neonatal dermal microvascular endothelial cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2505</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 Basal Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3156</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KSHV LANA/ORF 73</td>
			<td>Advanced Biotechnologies</td>
			<td>13-210-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLETMExpress, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12604013</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS with calcium and magnesium</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro model for studying cellular transformation by kaposi sarcoma herpesvirus

Kaposis sarkom (KS) er en usædvanlig tumor bestående af spindel celler, der er initieret af infektion i endothelial celler (EF) med KSHV, og udvikler sig oftest i fastsættelsen af immunosuppression. Trods årtiers forskning, optimal behandling af KS forbliver dårligt defineret og kliniske resultater er især ugunstige i ressource-begrænset indstillinger. KS læsioner er drevet af patologiske angiogenese, kronisk inflammation og oncogenesis, og forskellige i vitro celle kultur modeller er blevet udviklet for at studere disse processer. KS udspringer af KSHV-inficerede celler i endothelial oprindelse, så EF-slægt celler giver de mest hensigtsmæssige i vitro surrogater af spindel celle forløber. Dog fordi EF har en begrænset in vitro- levetid, og som de muterede mekanismer, der er ansat af KSHV er mindre effektiv end andre tumorfremkaldende virus, har det været vanskeligt at vurdere processer af transformation i primære eller telomerase-udødeliggjort EC. Derfor, en roman EF-baserede kultur model blev udviklet som let understøtter transformation efter infektion med KSHV. Ektopisk udtryk for human papillomavirus type 16 E6 og E7 gener giver mulighed for udvidede kultur af alder - og passage-matchede mock - og KSHV-inficeret EF og støtter udviklingen af en virkelig omdannet (dvs., tumorfremkaldende) fænotype i inficerede cellekulturer . Denne tractable og stærkt reproducerbare model af KS har lettet opdagelsen af flere væsentlige signaling veje med stort potentiale for oversættelse i kliniske indstillinger.

Morfologi af primære EF er klassisk beskrevet som "cobble stone", og denne morfologi ændres ikke af udtryk for papillomavirus E6, E7 gener (figur 1A). Udtryk af E6 og E7 gener alene fremkalde ikke en transformeret fænotype; således celler er modtagelige for kontakt hæmning og vil ophøre med at dividere ved ankomsten til sammenløbet i kultur. Cellerne vil dog formere og regrow til sammenløbet på trypsinization og replating på en lavere tæthedsgrad, giver mulighe...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus at JoVE.com

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposis sarkom (KS) er en tumor forårsaget af infektion med muterede virus humant herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV). I endothelial celle kultur model beskrevet her er unikt tilpasset til at studere de mekanismer, hvorved KSHV forvandler værtsceller.

En In Vitro Model til at studere cellulær Transformation af Kaposis sarkom Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

Research

JoVE Journal

Biology

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis Interview

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that ...

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional sporing af hæmatopoietisk stamcelletransplantation og stamcelle i Voksen Mouse calvarie knoglemarv

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Adenofection: A Method for Studying the Role of Molecular Chaperones in Cellular Morphodynamics by Depletion-Rescue Experiments

Adenofection: En metode til at studere den rolle molekylchaperoner i Cellular morfologiske dynamik ved Udtømmelse-Rescue Eksperimenter

Cellular processes such as mitosis and cell differentiation are governed by changes in cell shape that largely rely on proper remodeling of the cell ...

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

En effektiv In Vitro gennemførelse metode af en Transcriptionally regulerede sovende skønhed System pakket ind i en Integration defekte Lentiviral vektor

The Sleeping Beauty (SB) transposon is a non-viral integrating system with proven efficacy for gene transfer and functional genomics. To optimize the SB ...

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Kvantitative tilgange til at studere cellulære strukturer og organelle morfologi i Caenorhabditis elegans

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these ...