Name: an in vitro model for studying cellular transformation by kaposi sarcoma herpesvirus
Uploaded: 2017-08-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par le HD068322 K12 (SCM) ; R01 CA179921 et P51 OD011092 (AVM) ; et 14PRE20320014 les prix de l’Association coeur Amérique (SB).

Remarque : toutes les procédures décrites dans le présent protocole doivent être effectuées dans des conditions de BSL-2.
 1. KSHV Stock préparation tampon préparer TNE <ol><li> : dissoudre 292,24 mg EDTA dans ddH 2 O, porter à 225 mL et ajuster le pH 8. Dissoudre 605,7 mg Tris dans FD 2 O, porter à 225 mL et ajuster le pH 8. Combiner les solutions EDTA et Tris, ajouter 4,38 g NaCl, ajuster le volume final à 500 mL, filtre, stériliser et conserver à 4 ° ...

Oncogenèse est un processus multipas qui contourne les mesures de sécurité importantes au sein d’un organisme36. Comme les lésions de KS existent le long d’un spectre d’inflammation chronique au vrais sarcomes, élucidation de certains processus physiopathologiques médiée par KSHV exige que certaines études conduits dans des modèles de culture cellulaire qui prennent en charge la transformation9. Il est à noter que la perte d’inhibition de contact et de cro...

Le sarcome de Kaposi (KS) est une tumeur angioproliférative multi-focal affectant les sites par voie cutanée, muqueuses et viscérales qui se développe le plus souvent dans le cadre d’immunodépression avancé1. Quatre formes épidémiologiques ont été décrites : classique, une forme indolente qui touche généralement les personnes âgées du patrimoine méditerranéen et du Moyen-Orient ; iatrogène, résultant du traitement avec des médicaments immunosuppresseurs après transplantation d’organes ; épidémie, un cancer définissant le sida ; et endémiques, une forme indépendante du VIH fréquente chez les enfants dans les régions endémiques en Afrique. Avec l’avènement de régimes de médicaments anti-rétroviraux combinaison efficace pour le traitement du VIH, épidémie KS est beaucoup moins souvent diagnostiquée chez les pays en développement. Cependant, les formes endémiques et épidémiques cliniquement agressifs demeurent parmi les plus couramment des cancers diagnostiqués dans plusieurs pays d’Afrique,2,3,4. Identification des médicaments efficaces axés sur la pathogenèse, pour le traitement de KS est donc une priorité de recherche.
Histologiquement, les lésions de KS sont caractérisées par la néovascularisation vaste mais anormale par lequel des cellules de tige d’origine ce formulaire réseaux vasculaire discontinue5. Ces vaisseaux anormaux (« fentes vasculaires ») permettre l’extravasation des érythrocytes, qui donnent des lésions leur couleur caractéristique. En outre, les lésions contiennent nombreux leucocytes qui caractérisent l’inflammation chronique (c'est-à-dire, lymphocytes, macrophages et plasmocytes). Régression des lésions de KS après la reconstitution immunitaire a été décrit, ce qui suggère que KS a des fonctions d’une lésion hyper-proliférative et une véritable tumeur6,7,8,9.
L’herpèsvirus KS (KSHV), l’agent causal de KS, a été identifié en 1994,10. Depuis puis nombreux in vitro culture cellulaire modèles ont été développés pour permettre des études de pathogenèse, y compris les cellules explantées de matériel de biopsie tumorale et primaire ou EC exprimant le télomérase infectés par KSHV dans vitro11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18. aucun des modèles actuellement disponibles entièrement récapitule le microenvironnement tumoral de KS, mais tous ont contribué des connaissances précieuses à notre compréhension de la pathologie de l’infection de KSHV. À la différence des autres connus tumorigènes herpèsvirus humain virus Epstein - Barr (EBV), KSHV ne transforme pas facilement les cellules en culture après nouvelle infection19,20,21, 22. Toutefois, cette limitation a été surmontée par transduction primaire EC humaine soit mélangé origine microvasculaire ou lymphatique le E6 et E7 des gènes du virus du papillome humain de type 16 avant l’infection de KSHV23,24 . Expression des ces oncogènes exogènes augmente considérablement le potentiel de transformation de KSHV in vitro en partie en fournissant d’autres inhibition du rétinoblastome protéine et p5323,24. Cette méthode de transduction EC a permis à plusieurs laboratoires pour identifier les altérations clées hôte l’expression génique cellulaire qui sont induits par l’infection de KSHV et qui semblent faciliter KS cellule survie et la prolifération25,26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. les protocoles décrits sont simples et très reproductible et se traduira par la génération d’appariés selon l’âge et le passage des EC KSHV-infectés et infectés par le simulacre des contrôles qui peuvent être cultivées pendant beaucoup plus de cellules primaires et seront permettent l’étude des oncogènes mécanismes employés par KSHV. Bien que le protocole inclut une méthode pour la production de type sauvage KSHV de la lignée effusion primaire de cellules lymphocytaires BCBL-1, EC E6/E7-immortalisé sont également très sensibles au Infectionà BACmid recombinante dérivées KSHV-BAC1630. Protocoles pour la préparation de BAC16 sont décrites ailleurs33,34.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BCBL-1 cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>3233</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PA317 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2203</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neonatal dermal microvascular endothelial cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2505</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 Basal Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3156</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KSHV LANA/ORF 73</td>
			<td>Advanced Biotechnologies</td>
			<td>13-210-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLETMExpress, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12604013</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS with calcium and magnesium</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro model for studying cellular transformation by kaposi sarcoma herpesvirus

Arcome de Kaposi (SK) est une tumeur rare composée de cellules en prolifération broche qui est déclenchée par l’infection des cellules endothéliales (EC) avec KSHV et développe le plus souvent dans le cadre de l’immunosuppression. Malgré des décennies de recherche, un traitement optimal de KS reste mal défini et les résultats cliniques sont particulièrement défavorables à ressources limitées. Les lésions de KS, résultent de l’angiogénèse pathologique, l’inflammation chronique et oncogenèse et différents des modèles in vitro cell culture ont été développées pour étudier ces processus. KS provient de cellules infectées par KSHV d’origine endothéliale, pour fournissent à des cellules de lignée EC les plus appropriée en vitro substituts du précurseur cellules fusiformes. Cependant, parce que les EC ont une durée de vie limitée in vitro , et comme les oncogènes mécanismes employés par KSHV sont moins efficaces que ceux des autres virus tumorigènes, il a été difficile d’évaluer les processus de transformation dans le primaire ou télomérase-immortalisé EC. Par conséquent, un modèle de nouvelle culture axée sur l’EC a été développé qui supporte facilement transformation suite à une infection avec KSHV. L’expression ectopique des gènes E6 et E7 du virus du papillome humain type 16 permet la culture prolongée d’appariés selon l’âge et le passage mock et KSHV-infectés par EC et soutient le développement d’une véritable transformation (c.-à-d. tumorigènes) phénotype dans des cultures cellulaires infectées . Ce modèle souple et hautement reproductible de KS a facilité la découverte de plusieurs voies de signalisation essentielles à fort potentiel pour la traduction en milieu clinique.

La morphologie des EC primaire est classiquement décrit comme « Pierre de galets », et cette morphologie n’est pas modifiée par l’expression du virus du papillome E6 et E7 gènes (Figure 1 a). L’expression des gènes E6 et E7 seuls n’induit pas un phénotype transformé ; ainsi, les cellules sont sensibles à l’inhibition de contact et cesseront divisant en arrivant à confluence dans la culture. Les cellules seront toutefois prolifèrent et les repoussen...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus at JoVE.com

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Le sarcome de Kaposi (KS) est une tumeur induite par l’infection par l’herpèsvirus virus oncogènes de KS-8/herpesvirus humain (HHV-8/KSHV). Le modèle de culture de cellules endothéliales décrit ici est particulièrement bien adapté pour étudier les mécanismes par lesquels KSHV transforme les cellules hôtes.

Un modèle In Vitro pour étudier la Transformation cellulaire par Herpesvirus sarcome de Kaposi

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

Research

JoVE Journal

Biology

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis Interview

Christopher Hughes: un modèle in vitro pour l&#39;étude de l&#39;angiogenèse (Interview)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that ...

Recherche

Biologie

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

Un dispositif microfluidique avec des modèles Groove pour étudier le comportement cellulaire

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Techniques de microinjection pour l&#39;étude de la mitose dans les Drosophila melanogaster Embryon syncytial

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

Une méthode à haut débit pour la cryoconservation du sperme de poisson zèbre et de In Vitro La fertilisation

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Génération de souris transgéniques C. elegans Par transformation biolistique

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp et des techniques de perfusion pour étudier les canaux ioniques Exprimé en Xenopus Ovocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo suivi 4-Dimensional de hématopoïétiques cellules souches et progénitrices adultes dans la voûte du crâne de souris de moelle osseuse

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Adenofection: A Method for Studying the Role of Molecular Chaperones in Cellular Morphodynamics by Depletion-Rescue Experiments

Adenofection: Une méthode pour étudier le rôle des chaperons moléculaires dans Cellular Morphodynamique par Experiments Depletion-sauvetage

Cellular processes such as mitosis and cell differentiation are governed by changes in cell shape that largely rely on proper remodeling of the cell ...

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

Une méthode de Transposition efficace In Vitro par un système de beauté dormir transcriptionnellement réglementé empaquetée dans un vecteur Lentiviral défectueux de l’intégration

The Sleeping Beauty (SB) transposon is a non-viral integrating system with proven efficacy for gene transfer and functional genomics. To optimize the SB ...

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Approches quantitatives pour l'étude des structures cellulaires et de la morphologie d'organite à Caenorhabditis elegans

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these ...