Name: an in vitro model for studying cellular transformation by kaposi sarcoma herpesvirus
Uploaded: 2017-08-25T12:30:00
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Questo lavoro è stato supportato da K12 HD068322 (SCM); CA179921 R01 e P51 OD011092 (AVM); e premio 14PRE20320014 da America Heart Association (SB).

Nota: tutte le procedure descritte in questo protocollo devono essere eseguite in condizioni di BSL-2.
 1. preparazione di KSHV Stock <ol><li>buffer di preparare TNE: sciogliere 292,24 mg di EDTA in ddH 2 O, portare a 225 mL e regolare a pH 8. Sciogliere mg 605,7 Tris in ddH 2 O portare a 225 mL e regolare a pH 8. EDTA e Tris soluzioni combinate, aggiungere 4,38 g NaCl, regolare il volume finale di 500 mL, filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C .</li>
	<l...

Oncogenesi sono un processo multifasico che aggira precauzioni importanti all'interno di un organismo36. Come lesione KS esistano lungo uno spettro di infiammazione cronica al veri sarcomi, delucidazione di alcuni processi patofisiologici mediata da KSHV richiede che alcuni studi condotti in modelli di coltura cellulare che supportano la trasformazione9. Va notato che la perdita di inibizione da contatto e la crescita ancoraggio-dipendente, fenotipi indicativi di trasformaz...

Sarcoma di Kaposi (KS) è un tumore di angioproliferative multi-focale che interessano siti cutanei, mucosi e viscerali che si sviluppa più comunemente nella cornice di soppressione immune avanzata1. Sono state descritte quattro forme epidemiologiche: classic, una forma indolent che colpisce in genere persone anziane del patrimonio Mediterraneo e del Medio Oriente; iatrogena, derivando dal trattamento con farmaci immunosoppressori dopo trapianto dell'organo; epidemia, un cancro didefinizione; ed endemiche, una forma di HIV-indipendente comune nei bambini nelle regioni endemiche in Africa. Con l'avvento dei regimi della droga anti-retrovirale combinazione efficace per il trattamento dell'HIV, KS epidemica è molto meno comunemente diagnosticato in paesi in via di sviluppo. Tuttavia, le forme clinicamente aggressive endemiche ed epidemiche rimangono tra i più comunemente cancri diagnosticati in molti paesi africani2,3,4. Pertanto, l'identificazione di farmaci mirati a patogenesi efficaci per il trattamento di KS è una priorità di ricerca.
Istologicamente, KS lesioni sono caratterizzate da neovascolarizzazione abbondante ma anormali, per cui le cellule dell'alberino di origine CE formano reti vascolari discontinuo5. Questi vasi anomali ("fessure vascolari") consentono lo stravaso di eritrociti, che danno lesioni loro colore caratteristico. Inoltre, le lesioni contengono numerosi leucociti che caratterizzano l'infiammazione cronica (cioè, linfociti, macrofagi e plasmacellule). Regressione delle lesioni KS dopo ricostituzione immunitaria è stata descritta, suggerendo che KS ha caratteristiche di una lesione iper-proliferative sia un vero tumore6,7,8,9.
Il herpesvirus KS (KSHV), l'agente causativo di KS, è stato identificato nel 199410. Da allora molti in vitro coltura cellulare sono stati sviluppati modelli per attivare studi di patogenesi, comprese le cellule espiantati da materiale di biopsia del tumore e primaria o CE esprimendo la telomerasi è infettato da KSHV in vitro11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18. nessuno dei modelli attualmente disponibili completamente ricapitola il microambiente tumorale di KS, ma tutti hanno contribuito conoscenze preziose per la nostra comprensione del pathobiology dell'infezione di KSHV. A differenza del altri noto cancerogeno herpesvirus umano virus di Epstein - Barr (EBV), KSHV non prontamente trasforma le cellule in cultura seguendo de novo infezione19,20,21, 22. Tuttavia, questa limitazione è stata superata da transducing CE primaria umana del mescolato origine microvascolare o linfatico con la E6 ed E7 geni da papillomavirus umano tipo 16 prima dell'infezione con KSHV23,24 . Espressione di questi oncogeni esogeni aumenta notevolmente il potenziale trasforma di KSHV in vitro in parte fornendo ulteriore inibizione del retinoblastoma proteina e p5323,24. Questo metodo di trasduzione CE ha permesso più laboratori di identificare le alterazioni chiave nell'host espressione genica delle cellule che sono indotte dall'infezione di KSHV e che sembrano facilitare KS cella sopravvivenza e proliferazione25,26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. i protocolli descritti nel presente documento sono semplici e altamente riproducibile e comporterà la generazione di pari età e passaggio CE KSHV-infettati e controlli mock-infettati che possono essere coltivati per lontano più di cellule primarie e saranno consentire per l'indagine sui meccanismi oncogenici impiegato da KSHV. Anche se il protocollo include un metodo per la produzione di tipo selvaggio KSHV dalla linea cellulare linfoma primario di effusione BCBL-1, CE E6/E7-immortalata anche sono altamente suscettibili di infezione con BACmid ricombinante derivato KSHV-BAC1630. Protocolli per la preparazione di BAC16 sono descritti altrove33,34.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BCBL-1 cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>3233</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PA317 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2203</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neonatal dermal microvascular endothelial cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2505</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 Basal Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3156</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KSHV LANA/ORF 73</td>
			<td>Advanced Biotechnologies</td>
			<td>13-210-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLETMExpress, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12604013</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS with calcium and magnesium</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro model for studying cellular transformation by kaposi sarcoma herpesvirus

Sarcoma di Kaposi (KS) è un tumore insolito composto di proliferazione delle cellule dell'alberino che è iniziato da infezione delle cellule endoteliali (CE) con KSHV e si sviluppa più spesso nella regolazione di immunosoppressione. Nonostante decenni di ricerca, il trattamento ottimale di KS rimane definito male e gli esiti clinici sono particolarmente sfavorevoli nelle impostazioni di risorse limitate. Le lesioni KS sono guidate da angiogenesi patologica, infiammazione cronica e oncogenesi e vari in vitro modelli di coltura cellulare sono stati sviluppati per studiare questi processi. KS deriva dalle cellule di KSHV-infettati di origine endoteliale, così le cellule CE-stirpe di fornire i più appropriati in vitro surrogati del precursore delle cellule dell'alberino. Tuttavia, perché CE hanno una durata limitata in vitro , e come i meccanismi oncogenici impiegati da KSHV sono meno efficaci di quelli di altri virus cancerogeno, è stato difficile valutare i processi di trasformazione primaria o telomerase-immortalized EC. Di conseguenza, è stato sviluppato un modello di romanzo cultura basata su CE che prontamente supporta la trasformazione dopo l'infezione con KSHV. Espressione ectopica dei geni E6 ed E7 del papillomavirus umano di tipo 16 consente estesa cultura di pari età e passaggio mock - e KSHV-infettati CE e supporta lo sviluppo di un veramente trasformato (cioè, cancerogeno) fenotipo in colture di cellule infette . Questo modello altamente riproducibile e trattabile di KS ha facilitato la scoperta di diverse vie di segnalazione essenziale ad alto potenziale per la traduzione in contesti clinici.

La morfologia della primaria CE è classicamente descritto come "ciottoli", e questa morfologia non è alterata dall'espressione del papillomavirus E6 ed E7 geni (Figura 1A). Espressione dei geni E6 ed E7 da solo non induce un fenotipo trasformato; così, le cellule sono suscettibili di contattare inibizione e cesseranno dividendo dopo aver raggiunto la confluenza nella cultura. Le cellule saranno tuttavia proliferare e ricrescere alla confluenza su trypsinization e ricro...

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An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Sarcoma di Kaposi (KS) è un tumore indotto tramite l'infezione con il virus oncogeno herpesvirus-8/KS il herpesvirus umano (HHV-8/KSHV). Il modello di coltura delle cellule endoteliali descritto qui è specificatamente concepito per studiare i meccanismi da cui KSHV trasforma le cellule ospite.

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