Name: an in vitro model for studying cellular transformation by kaposi sarcoma herpesvirus
Uploaded: 2017-08-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av K12 HD068322 (SCM); R01 CA179921 og P51 OD011092 (AVM); og tildele 14PRE20320014 fra Amerika Heart Association (SB).

Merk: alle prosedyrene som er beskrevet i denne protokollen skal utføres under BSL-2 forhold.
 1. KSHV lager forberedelse <ol><li>forberede TNE buffer: oppløse 292.24 mg EDTA i ddH 2 O bringe til 225 mL og justere pH 8. Oppløse 605.7 mg Tris i ddH 2 O, bringe til 225 mL og justere pH 8. Kombinere EDTA og Tris løsninger, legge 4,38 g NaCl, justere endelige volumet til 500 mL, filtrere sterilisere, og lagre på 4 ° C .</li>
	<li>Kultur KSHV-positive, EBV-...

Oncogenesis er en må prosess som omgår viktig beskyttelse i en organisme36. Som KS lesjoner finnes langs et spekter av kronisk betennelse til sann sarkomer, krever utviklingen av visse patofysiologiske prosesser formidlet av KSHV at noen studier gjennomføres i celle kultur modeller som støtter transformasjon9. Det bør bemerkes at kontakt hemming og anchorage-avhengige vekst, fenotyper indikativ av mobilnettet transformasjon, ikke lett utvikle etter smitte av primære E...

Kaposis sarkom (KS) er en Multi-Focal angioproliferative svulst påvirker dermal, mucosal og visceral områder som utvikler vanligvis i innstillingen for avansert uimottakelig undertrykkelse1. Fire epidemiologisk skjemaer har blitt beskrevet: klassisk, en lat form som vanligvis påvirker eldre mennesker i middelhavs- og arv; iatrogenic, som følge av behandling med suppressive medikamenter etter organtransplantasjon; epidemien, en AIDS-definerende kreft; og endemisk, et uavhengig av HIV-skjema som er vanlig i barn i endemiske områder i Afrika. Med ankomsten av effektiv kombinasjon anti-retroviral narkotika regimer for behandling av HIV, er epidemi KS mye mindre vanlig diagnostisert i utviklingsland. Imidlertid fortsatt skjemaene for klinisk aggressiv endemisk og epidemien blant de vanligste diagnostisert kreft i mange afrikanske land2,3,4. Identifikasjon av effektiv patogenesen målrettede legemidler for behandling av KS er derfor forskning prioritet.
Histologisk, er KS lesjoner preget av omfattende men unormal neovascularization der spindelen cellene opprinnelsesland EC danner usammenhengende vaskulære nettverk5. Disse unormale fartøyene ("vaskulære slits") gjør bloduttredelse av erytrocytter, som gir lesjoner sine karakteristiske farger. I tillegg inneholder lesjoner mange leukocytter som karakteriserer kronisk betennelse (dvs. lymfocytter, makrofager og plasma celler). Regresjon av KS lesjoner etter immune rekonstituering har blitt beskrevet, antyder at KS har både en hyper-proliferativ leksjonen og sanne svulst6,7,8,9.
KS herpesvirus (KSHV), den utløsende agenten for KS, ble identifisert i 199410. Siden så mange i vitro cellekultur modeller er utviklet for å aktivere patogenesen studier, inkludert celler explanted fra svulst biopsi materiale og primær eller telomerase-uttrykke EC infisert med KSHV i vitro11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18. ingen av de tilgjengelige modellene viser fullt KS svulst microenvironment, men alle har bidratt verdifull kunnskap til vår forståelse av pathobiology av KSHV. I motsetning til de andre kjente tumorigenic menneskelig herpesvirus Epstein - Barr virus (EBV), KSHV lett transformerer ikke celler i kultur etter de novo infeksjon19,20,21, 22. imidlertid denne begrensningen er løst med transducing primære menneskelige EC enten blandet mikrovaskulær eller lymfatisk opprinnelse med E6 og E7 gener fra humant papillomavirus type 16 før infeksjon med KSHV23,24 . Uttrykk for disse eksogene oncogenes øker dramatisk transformere potensialet i KSHV i vitro delvis ved å gi ytterligere hemming av retinoblastoma protein og p5323,24. Denne EC signaltransduksjon metoden har tillatt flere laboratorier for å identifisere viktige endringer i verten celle genuttrykk som er indusert av KSHV infeksjon, og som synes å lette KS celle overlevelse og spredning25,26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. protokollene beskrevet her er enkel og svært reproduserbare og vil medføre generering av alder - og passasje-matchet KSHV-infiserte EC og uekte-infiserte kontroller som kan kultivert langt lenger enn primære celler og vil tillate etterforskningen av kreftfremkallende mekanismer ansatt hos KSHV. Selv om protokollen inneholder en metode for produksjon av vill-type KSHV fra primære effusjon lymfom cellen linje BCBL-1, E6/E7-udødeliggjort EC er også svært utsatt for avledet infeksjon med rekombinant BACmid KSHV-BAC1630. Protokoller for utarbeidelse av BAC16 er beskrevet andre steder33,34.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BCBL-1 cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>3233</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PA317 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2203</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neonatal dermal microvascular endothelial cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2505</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 Basal Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3156</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KSHV LANA/ORF 73</td>
			<td>Advanced Biotechnologies</td>
			<td>13-210-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLETMExpress, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12604013</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS with calcium and magnesium</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro model for studying cellular transformation by kaposi sarcoma herpesvirus

Kaposis sarkom (KS) er en uvanlig svulst består av voksende spindel celler som startes av infeksjon av endotelceller (EC) med KSHV, og utvikler oftest i innstillingen for immunsuppresjon. Til tross for tiår med forskning, optimal behandling for KS er dårlig definert og kliniske utfall er spesielt ugunstige i ressurs-begrenset innstillinger. KS lesjoner er drevet av patologisk angiogenese, kronisk betennelse og oncogenesis, og ulike i vitro celle kultur modeller er utviklet for å studere disse prosessene. KS oppstår fra KSHV-infiserte celler endothelial opprinnelse, slik EU-lineage celler gir de mest passende i vitro surrogater av spindel celle forløperen. Men fordi EU har en begrenset i vitro levetid, og som de kreftfremkallende mekanismene ansatt hos KSHV er mindre effektiv enn andre tumorigenic virus, har det vært vanskelig å vurdere prosessene av transformasjon i primære eller telomerase-udødeliggjort EC. Derfor ble en roman EC-baserte kultur-modellen utviklet som lett støtter transformasjon etter infeksjon med KSHV. Ektopisk uttrykk for E6 og E7 genene for humant papillomavirus type 16 gir utvidet kultur av alder - og passasje-matchet uekte - og KSHV-infiserte EC og støtter utviklingen av en virkelig transformert (dvs. tumorigenic) fenotypen i infiserte cellekulturer . Denne medgjørlig og svært reproduserbar modellen av KS har muliggjort oppdagelsen av flere viktige signalveier med stort potensial for oversettelse til kliniske innstillinger.

Morfologi av primære EC er klassisk beskrevet som "brolegge-stein", og denne morfologi endres ikke av uttrykk papillomavirus E6 og E7 gener (figur 1A). Uttrykk for E6 og E7 genene alene få ikke en transformert fenotypen; dermed celler er utsatt for kontakt hemming og vil slutte å dele på å nå samløpet i kultur. Cellene vil imidlertid sprer og regrow til elvene trypsinization og replating på lavere tetthet, slik at vedlikehold av alder - og passasje-matchet kulture...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus at JoVE.com

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposis sarkom (KS) er en svulst forårsaket av infeksjon med kreftfremkallende viruset menneskelig herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV). Endothelial celle kultur modellen beskrevet her er unikt tilpasset for å studere mekanismer som KSHV forvandler vertsceller.

En In Vitro -modellen for å undersøke mobilnettet transformasjon av Kaposis sarkom Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

Research

JoVE Journal

Biology

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis Interview

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that ...

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Sporing av Hematopoietiske Stem og stamceller i Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Adenofection: A Method for Studying the Role of Molecular Chaperones in Cellular Morphodynamics by Depletion-Rescue Experiments

Adenofection: En metode for å studere rollen for molekylær anstand i Cellular Morphodynamics av ​​Nedbryting-redning Eksperimenter

Cellular processes such as mitosis and cell differentiation are governed by changes in cell shape that largely rely on proper remodeling of the cell ...

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

En effektiv In Vitro transponering metode av Transcriptionally regulert sovende skjønnhet pakket i en integrasjon defekt Lentiviral vektor

The Sleeping Beauty (SB) transposon is a non-viral integrating system with proven efficacy for gene transfer and functional genomics. To optimize the SB ...

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Kvantitative tilnærminger for Studying Cellular strukturer og organelle morfologi i Caenorhabditis elegans

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these ...