Name: an in vitro model for studying cellular transformation by kaposi sarcoma herpesvirus
Uploaded: 2017-08-25T12:30:00
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Este trabalho foi financiado pelo HD068322 K12 (SCM); R01-CA179921 e OD011092 P51 (AVM); e o prêmio 14PRE20320014 de associação de coração da América (SB).

Nota: todos os procedimentos descritos no presente protocolo devem ser realizados sob condições de BSL-2.
 1. preparação de estoque KSHV <ol><li>buffer de TNE preparar: dissolver 292,24 mg EDTA em ddH 2 O, trazer a 225 mL e ajustar o pH 8. Dissolver 605,7 mg Tris em ddH 2 O, trazer a 225 mL e ajustar o pH 8. Combine as soluções de EDTA e Tris, adicionar 4,38 g NaCl, ajustar volume final de 500 mL, filtrar esterilizar e armazenar a 4 ° C .</li>
	<li>Cu...

Mixomas é um processo de várias etapas que contorna precauções importantes dentro de um organismo de36. Como lesões do KS existem ao longo de um espectro de inflamação crônica a verdadeiras sarcomas, elucidação de determinados processos fisiopatológicos mediada por KSHV requer que ser realizados alguns estudos em modelos de cultura de células que suportam transformação9. Note-se que a perda da inibição de contato e crescimento dependente de ancoragem, fenót...

Sarcoma de Kaposi (KS) é um tumor de angioproliferativas multi focal afetando sites dérmicas, da mucosa e viscerais que se desenvolve mais comumente na configuração de imunossupressão avançada1. Quatro formas epidemiológicas têm sido descritas: clássico, uma forma indolente que normalmente afeta idosos do património do Mediterrâneo e do Médio Oriente; iatrogênica, resultantes de tratamento com imunossupressores após um transplante de órgão; epidemia, um câncer AIDS-definindo; e endêmicas, uma forma de HIV independente comum em crianças em regiões endêmicas na África. Com o advento dos regimes de drogas anti-retrovirais combinação eficaz para o tratamento do HIV, a epidemia KS é muito menos comumente diagnosticado nos países em desenvolvimento. No entanto, as formas endêmicas e epidêmicas clinicamente agressivas continuam entre os mais comumente diagnosticado câncer em muitos países africanos2,3,4. Portanto, identificação dos medicamentos eficazes patogênese-alvo para o tratamento de KS é uma prioridade de pesquisa.
Histologicamente, as lesões do KS caracterizam-se por neovascularização extensa mas anormal no qual células fusiformes de origem CE formam redes vasculares descontínuos5. Esses vasos anormais ("vasculares fendas") permitem o extravasamento de eritrócitos, que dão lesões sua cor característica. Além disso, lesões contêm numerosos leucócitos que caracterizam a inflamação crônica (ou seja, linfócitos, macrófagos e plasmócitos). Regressão das lesões do KS após reconstituição imunológica tem sido descrita, sugerindo que o KS tem características de uma lesão proliferativa-hiper e um tumor verdadeiro6,7,8,9.
Herpesvírus de KS (KSHV), o agente causador da KS, foi identificado em 199410. Desde então muitos em vitro cultura celular modelos foram desenvolvidos para permitir estudos de patogênese, incluindo células explantados do material de biópsia do tumor e primária ou telomerase-expressando CE infectado com KSHV em vitro11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18. nenhum dos modelos atualmente disponíveis totalmente recapitula o microambiente do tumor KS, mas todos contribuíram com valiosos conhecimentos para nosso entendimento sobre o Patobiológico de infecção KSHV. Ao contrário de outro conhecido oncogenicidade herpesvirus humano vírus Epstein - Barr (EBV), KSHV prontamente não transformar células em cultura, seguindo de novo infecção19,20,21, 22. no entanto, esta limitação foi superada pela transducing CE humano primário de um misto de origem linfática ou microvascular com o E6 e E7 genes do vírus do papiloma humano tipo 16 antes da infecção com KSHV23,24 . Expressão de oncogenes estes exógenas aumenta drasticamente o potencial transformador de KSHV em vitro em parte fornecendo mais inibição do retinoblastoma proteína e p5323,24. Este método de transdução CE permitiu vários laboratórios para identificar alterações chaves host de expressão gênica de células que são induzidas pela infecção KSHV e que aparecem para facilitar KS célula sobrevivência e proliferação25,26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. os protocolos descritos neste documento são simples e altamente reprodutível e resultará na geração de idade - e passagem-combinada CE KSHV infectados e controles infectados por simulação que podem ser cultivadas por mais tempo que as células primárias e serão permitem a investigação de mecanismos oncogênicas empregado pelo KSHV. Embora o protocolo inclui um método para a produção de tipo selvagem KSHV da linha de celular de linfoma primário de efusão BCBL-1, CE E6/E7-imortalizado também são altamente suscetíveis à infecção com BACmid recombinante derivado KSHV-BAC1630. Protocolos para a preparação de BAC16 são descritos em outro lugar33,34.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BCBL-1 cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>3233</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PA317 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2203</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neonatal dermal microvascular endothelial cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2505</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 Basal Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3156</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KSHV LANA/ORF 73</td>
			<td>Advanced Biotechnologies</td>
			<td>13-210-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLETMExpress, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12604013</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS with calcium and magnesium</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro model for studying cellular transformation by kaposi sarcoma herpesvirus

Sarcoma de Kaposi (KS) é um tumor incomum composto por proliferação de células fusiformes que é iniciado pela infecção das células endoteliais (CE) com KSHV e desenvolve-se mais frequentemente no cenário de imunossupressão. Apesar de décadas de pesquisa, tratamento ideal de KS permanece mal definido e os resultados clínicos são especialmente desfavoráveis em recursos limitados. Lesões do KS são conduzidas pela angiogênese patológica, inflamação crônica e mixomas, e vários em vitro celular cultura modelos foram desenvolvidos para estudar estes processos. KS surge a partir de células infectadas KSHV de origem endotelial, então CE-linhagem células fornecem os mais apropriado em vitro substitutos do precursor do fuso celular. No entanto, porque CE têm uma duração limitada em vitro , e que os mecanismos oncogênicos empregados pelo KSHV são menos eficientes do que aqueles de outros vírus oncogenicidade, tem sido difícil de avaliar os processos de transformação primária ou telomerase-imortalizada EC. Portanto, foi desenvolvido um modelo de romance cultura baseada em CE que suporta prontamente transformação após infecção com KSHV. Gravidez ectópica expressão dos genes E6 e E7 do vírus do papiloma humano tipo 16 permite a cultura prolongada de idade - e passagem-combinada mock e KSHV-infectados CE e apoia o desenvolvimento de um verdadeiramente transformado (i.e., oncogenicidade) fenótipo em culturas de células infectadas . Este modelo tractable e altamente reprodutível de KS tem facilitado a descoberta de várias vias de sinalização essenciais com elevado potencial para a tradução em ambientes clínicos.

A morfologia da CE primário é classicamente descrita como "pedra do godo", e esta morfologia não é alterada pela expressão do papilomavírus E6 e E7 genes (figura 1A). Expressão dos genes E6 e E7 sozinhos não induz um fenótipo transformado; assim, as células são suscetíveis a entrar em contato com a inibição e cessarão dividindo ao atingir a confluência na cultura. As células serão no entanto proliferam e regenerar a confluência tripsinização e replati...

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An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Sarcoma de Kaposi (KS) é um tumor induzido por infecção pelo herpesvírus oncogênicos vírus humano herpesvírus-8/KS (HHV-8/KSHV). O modelo de cultura de células endoteliais descrito aqui é especialmente adequado para estudar os mecanismos pelos quais KSHV transforma células hospedeiras.

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