Name: an in vitro model for studying cellular transformation by kaposi sarcoma herpesvirus
Uploaded: 2017-08-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus at JoVE.com

Эта работа была поддержана на HD068322 K12 (SCM); R01 CA179921 и P51 OD011092 (АВМ); и награда 14PRE20320014 из Америки ассоциации сердца (SB).

Примечание: все процедуры, описанные в настоящем протоколе должны выполняться в условиях BSL-2.
 1. Подготовка KSHV фондовая <ol><li>подготовить TNE буфера: распустить 292.24 мг ЭДТА в ddH 2 O, довести до 225 мл и приспособиться к рН 8. Растворяют 605.7 мг трис ddH 2 O, довести до 225 мл ...

Онкогенеза это многоэтапный процесс, который обходит важные гарантии внутри организма36. Как KS поражений существуют вдоль спектра хронического воспаления в истинной саркомы, разъяснение некоторых патофизиологических процессов при посредничестве KSHV требует провести нек?...

Саркома Капоши (KS) является мульти фокуса angioproliferative опухоли, затрагивающих дермы, слизистых оболочек и висцеральных сайты, которые чаще всего развивается в условиях современных иммуносупрессия1. Были описаны четыре эпидемиологических формы: классика, праздного форма, которая обычно затрагивает пожилых людей наследия Средиземноморья и Ближнего Востока; Ятрогенные, приводя к от лечения с иммуносупрессивных препаратов, после трансплантации; эпидемия СПИДа определение рака; и эндемичные, ВИЧ независимые формы, часто встречается у детей в эндемичных регионах в Африке. С появлением эффективного сочетания схем антиретровирусного препарата для лечения ВИЧ эпидемии KS гораздо менее часто диагностируется в развивающихся странах. Однако клинически агрессивные формы эндемических и эпидемических остаются среди наиболее часто диагноз рака в многих африканских стран2,,3-4. Таким образом определение эффективных ориентированных на патогенез препаратов для лечения KS является приоритетом исследования.
Гистологически KS поражений характерны обширные но ненормальное неоваскуляризация, whereby шпинделя клетки ЕС происхождения формируют разрывными сосудистой сети5. Эти аномальные судов («сосудистые прорезями») позволяют экстравазации эритроцитов, которые дают поражения их характерный цвет. Кроме того поражения содержат многочисленные лейкоцитов, которые характеризуют хронического воспаления (т.е., лимфоцитов, макрофагов и плазматические клетки). Был описан регрессия новообразований KS, после восстановления иммунитета, предполагая, что KS имеет черты как гипер Пролиферативная поражения и истинный опухоли6,,78,9.
KS герпеса (KSHV), возбудителя KS, была определена в 1994 году10. С затем многие в vitro клеточной культуры модели были разработаны чтобы включить исследования патогенеза, включая клетки описаны от опухоли биопсийного материала и начальной или теломеразы выражая EC инфицированных KSHV в vitro11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18. ни одно из имеющихся в настоящее время модели полностью повторяет KS микроокружения опухоли, но все внесли ценные знания для нашего понимания pathobiology KSHV инфекции. В отличие от других известных онкогенной человеческого герпеса вирус Эпштейна - Барр (EBV), KSHV не легко превратить клетки в культуре, после de novo инфекции19,20,21, 22. Тем не менее, это ограничение было преодолено путем преобразования первичного человека ЕС либо смешанные микрососудистой или лимфатическую происхождения с E6 и E7 гены от вируса папилломы человека типа 16 до инфекции с KSHV23,24 . Выражение этих внешних онкогенов резко увеличивает преобразование потенциал KSHV в пробирке в части путем создания дополнительных ингибирование ретинобластомы белка и p5323,24. Этот метод трансдукции ЕС позволило несколько лабораторий для выявления ключевых изменений в принимающей ячейки экспрессии генов, вызванных KSHV инфекции и что, как представляется, облегчения KS ячейку выживания и распространения25,26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. протоколы, описанные здесь, являются простыми и высокую воспроизводимость и приведет к генерации соответствует возрасту и проход KSHV-инфицированных EC и инфицированных макет элементов управления, которые могут быть культивировали гораздо дольше, чем первичные элементы и будет возможность для расследования онкогенных механизмов, используемых KSHV. Хотя протокол включает метод для производства дикого типа KSHV от первичного выпота Лимфома клетки линии BCBL-1, Е6, Е7 увековечено EC также очень восприимчивы к инфекции с рекомбинантным BACmid производные KSHV-BAC1630. Протоколы для приготовления BAC16 описаны в других местах33,34.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BCBL-1 cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>3233</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PA317 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2203</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neonatal dermal microvascular endothelial cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2505</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 Basal Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3156</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KSHV LANA/ORF 73</td>
			<td>Advanced Biotechnologies</td>
			<td>13-210-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLETMExpress, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12604013</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS with calcium and magnesium</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro model for studying cellular transformation by kaposi sarcoma herpesvirus

Саркома Капоши (KS) является необычным опухоли, состоящий из пролиферирующих клеток шпинделя, инициируется инфекции эндотелиальных клеток (EC) с KSHV и чаще всего развивается в параметре иммуносупрессии. Несмотря на десятилетия исследований оптимальное лечение KS остается плохо определены и клинические исходы, особенно неблагоприятных в условиях ограниченных ресурсов. KS поражения движет патологический ангиогенез, хроническое воспаление и онкогенеза, и были разработаны различные в пробирке клеток культуры модели для изучения этих процессов. KS возникает от KSHV-инфицированных клеток эндотелия происхождения, поэтому EC-линии клетки обеспечивают наиболее подходящим в vitro суррогаты шпинделя клеток прекурсора. Однако, потому что ЕС имеют срок действия ограниченной в пробирке , и как онкогенных механизмов, используемых KSHV менее эффективны, чем другие онкогенной вирусов, это было трудно оценить процессы трансформации в начальной или Теломераза увековечен EC. Таким образом, что легко поддерживает преобразование после инфекции с KSHV была разработана модель Роман культуры, основанной на ЕС. Эктопическая выражение генов E6 и E7 вирусом папилломы человека типа 16 позволяет расширенный культуры из соответствует возрасту и проход макета и KSHV инфицированных - EC и поддерживает развитие действительно превращается (т.е. онкогенной) фенотип в зараженных клеточных культур . Эта шансов справиться с возникающими и высокую воспроизводимость модель KS способствовало открытие нескольких основных сигнальных путей с высоким потенциалом для перевода на клинических параметров.

Морфология первичных EC классически описал как «булыжник камень», и этот морфология не изменено выражением папилломы E6 и E7 генов (рис. 1A). Экспрессии генов E6 и E7, только не побудить преобразованной фенотип; Таким образом клетки подвержены связаться торможение и...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus at JoVE.com

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Саркома Капоши (KS) представляет собой опухоль, вызванных инфекцией с онкогенный вирус герпеса человека герпеса-8/KS (HHV-8/KSHV). Описанная здесь модель культуры эндотелиальных клеток однозначно подходит для изучения механизмов, которыми KSHV трансформирует клетки хозяина.

В Vitro модель для изучения клеточных трансформации, саркома Капоши герпеса

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

Research

JoVE Journal

Biology

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis Interview

Кристофер Хьюз: в пробирке модель для изучения ангиогенеза (Интервью)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that ...

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

Микрожидкостных устройств с Groove Шаблоны для изучения Сотовая Поведение

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Микроинъекция методы для изучения митоза в Дрозофилы Синцитиальный эмбрионов

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

Высокая пропускная метод для криоконсервации спермы и данио рерио In Vitro Оплодотворение

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Поколение трансгенных С. Элеганс По Biolistic преобразования

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Зажим Patch и перфузии Методы изучения ионных каналов, выраженные в Xenopus Ооцитов

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

В Vivo 4-мерном Tracking гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников в взрослой мыши свода черепа костного мозга

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Adenofection: A Method for Studying the Role of Molecular Chaperones in Cellular Morphodynamics by Depletion-Rescue Experiments

Adenofection: метод изучения роли молекулярных шаперонов в клеточных морфодинамики истощением-спасательных экспериментов

Cellular processes such as mitosis and cell differentiation are governed by changes in cell shape that largely rely on proper remodeling of the cell ...

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

Эффективным в Vitro транспонирования метод транскрипционно регулируемых Спящая красоты системой упакованы в дефектных лентивирусные вектор интеграции

The Sleeping Beauty (SB) transposon is a non-viral integrating system with proven efficacy for gene transfer and functional genomics. To optimize the SB ...

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Количественные подходы для изучения клеточных структур и органеллы морфологии в Caenorhabditis elegans

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these ...