Name: an in vitro model for studying cellular transformation by kaposi sarcoma herpesvirus
Uploaded: 2017-08-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus at JoVE.com

Este trabajo fue financiado por el HD068322 K12 (SCM); CA179921 r01 y P51 OD011092 (AVM); y 14PRE20320014 de la Asociación America del corazón (SB).

Nota: todos los procedimientos descritos en este protocolo deben realizarse bajo condiciones BSL-2.
 1. preparación de Stock de KSHV <ol><li>buffer de TNE de preparar: disolver 292,24 mg EDTA en ddH 2 O traer a 225 mL y ajustar a pH 8. Disolver mg 605,7 Tris en ddH 2 O traer a 225 mL y ajustar a pH 8. Combinar soluciones de EDTA, Tris, añadir 4,38 g de NaCl, ajustar el volumen final a 500 mL, filtro de esterilizar y almacenar a 4 ° C .</li>
	<li>De la cul...

Oncogénesis es un proceso multietapa que eluda la seguridad dentro de un organismo36. Como lesiones KS existen a lo largo de un espectro de inflamación crónica a los verdaderos sarcomas, la aclaración de ciertos procesos fisiopatológicos mediados por KSHV requiere algunos estudios en modelos de cultivo celular que apoyan transformación9. Cabe señalar que no fácilmente se desarrollan pérdida de la inhibición de contacto y crecimiento dependiente de anclaje, fenotip...

Sarcoma de Kaposi (KS) es un tumor angioproliferative multi-focales que afectan sitios cutáneos, mucosos y viscerales que se desarrolla más comúnmente en el ajuste de inmunosupresión avanzado1. Se han descrito cuatro formas epidemiológicas: clásico, una forma indolente que típicamente afecta a las personas mayores del patrimonio mediterráneo y de Oriente; yatrogénica, resultantes del tratamiento con fármacos inmunosupresores después del trasplante de órganos; epidemia, un definición de SIDA cáncer; y, una forma independiente de VIH común en los niños en las regiones endémicas en África. Con el advenimiento de los regímenes de medicamentos anti-retrovirales eficaz combinación para el tratamiento del VIH, mucho menos comúnmente se diagnostica la KS epidémicas en los países en desarrollo. Sin embargo, las formas endémicas y epidémicas clínicamente agresivas permanecen entre los más comúnmente diagnosticado cáncer en muchos países africanos2,3,4. Por lo tanto, la identificación de drogas orientada a patogenesia eficaces para el tratamiento del KS es una prioridad de investigación.
Histológico, las lesiones de KS son caracterizadas por neovascularización extensa pero anormal, por el que las células del huso de origen CE forma discontinua redes vasculares5. Estos vasos anormales ("hendiduras vasculares") permiten la extravasación de los eritrocitos, que lesiones su color característico. Además, las lesiones contienen numerosos leucocitos que caracterizan a la inflamación crónica (es decir, linfocitos, macrófagos y células plasmáticas). Se ha descrito regresión de las lesiones de KS después de reconstitución inmune, sugiriendo que el KS tiene características de una lesión hiper-proliferativa y un verdadero tumor6,7,8,9.
Herpesvirus de KS (KSHV), el agente causativo de KS, fue identificado en 199410. Desde entonces muchos en vitro cultura de célula han desarrollado modelos para permitir estudios de patogénesis, incluyendo las células explantados de material de biopsia de tumor y primario o CE expresan telomerasa infectados con KSHV en vitro11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18. ninguno de los modelos disponibles en la actualidad totalmente recapitula el microambiente tumoral de KS, pero todos han aportado conocimientos valiosos al conocimiento de la Patobiología de la infección de KSHV. A diferencia de lo otros conocido tumorigenic herpesvirus humano virus de Epstein - Barr (EBV), KSHV no fácilmente transformar células en cultivo después de novo infección19,20,21, 22. sin embargo, esta limitación ha sido superada por transducción primaria CE humano de cualquier origen microvascular o linfática de mezclado con la E6 y E7 genes de virus del papiloma humano tipo 16 antes de la infección con KSHV23,24 . Expresión de los oncogenes exógenos aumenta dramáticamente el potencial transformador de KSHV en vitro en parte facilitando aún más la inhibición de la retinoblastoma proteína y p5323,24. Este método de transducción de la CE ha permitido múltiples laboratorios para identificar alteraciones claves en host de expresión génica de la célula que son inducidos por infección de KSHV y que parecen facilitar el KS de la célula proliferación y supervivencia25,26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. los protocolos descritos son simple y altamente reproducible y resultará en la generación de pareados por edad y paso CE KSHV-infectados y controles mock-infectados que pueden cultivarse para mucho más que las pilas primarias y permiten la investigación de mecanismos oncogénicos de KSHV. Aunque el protocolo incluye un método para la producción de tipo salvaje KSHV desde la línea de célula de efusión primaria en linfoma BCBL-1, CE E6/E7-inmortalizado también son altamente susceptibles a la infección con BACmid recombinante derivado KSHV-BAC1630. Protocolos para preparación de BAC16 se describen en otra parte33,34.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BCBL-1 cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>3233</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PA317 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2203</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neonatal dermal microvascular endothelial cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2505</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 Basal Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3156</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KSHV LANA/ORF 73</td>
			<td>Advanced Biotechnologies</td>
			<td>13-210-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLETMExpress, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12604013</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS with calcium and magnesium</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro model for studying cellular transformation by kaposi sarcoma herpesvirus

Sarcoma de Kaposi (KS) es un tumor inusual compuesto por proliferación de las células del huso que se inicia por la infección de células endoteliales (CE) con KSHV y se desarrolla más a menudo en el ajuste de la immunosupresión. A pesar de décadas de investigación, un tratamiento óptimo de KS permanece pobremente definido y los resultados clínicos son especialmente desfavorables en contextos con recursos limitados. Las lesiones de KS son conducidas por angiogénesis patológica, inflamación crónica y oncogénesis, y varios en vitro modelos celulares de cultura se han desarrollado para estudiar estos procesos. KS surge de las células infectadas de KSHV de origen endotelial, por lo que las células de linaje CE proporcionan el más apropiado en vitro sustitutos del precursor de la célula del huso. Sin embargo, porque CE tienen una vida útil limitada en vitro , y los mecanismos oncogénicos de KSHV son menos eficientes que los de otros virus tumorigenic, ha sido difícil de evaluar los procesos de transformación primaria o telomerasa inmortalizó EC Por lo tanto, se desarrolló un modelo de la nueva cultura basada en la EC que soporta fácilmente la transformación después de la infección con KSHV. Expresión ectópica de los genes E6 y E7 del virus del papiloma humano tipo 16 permite la extendida cultura de pareados por edad y paso mock y KSHV infectadas - CE y apoya el desarrollo de una verdadera transformación (es decir, tumorígeno) fenotipo en cultivos de células infectadas . Este modelo manejable y altamente reproducible de KS ha facilitado el descubrimiento de varias vías de señalización esenciales con alto potencial para la traducción en ajustes clínicos.

La morfología de la primaria CE se describe clásicamente como "piedra del adoquín", y esta morfología no se altera con expresión de los papillomavirus E6 y E7 genes (figura 1A). Expresión de los genes E6 y E7 solo no induce un fenotipo transformado; así, las células son susceptibles a la inhibición de contacto y dejan de dividir al llegar a la confluencia en la cultura. Las células sin embargo proliferar y crecer hasta confluencia tripsinización y replating en ...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus at JoVE.com

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Sarcoma de Kaposi (KS) es un tumor inducido por infección con el virus oncogénico herpesvirus-8/KS el herpesvirus humano (HHV-8/KSHV). El modelo de cultura de célula endotelial descrito aquí está especialmente preparado para el estudio de los mecanismos por los cuales KSHV transforma las células del huésped.

Un modelo In Vitro para el estudio de transformación celular por Herpesvirus del Sarcoma de Kaposi

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

Research

JoVE Journal

Biology

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis Interview

Christopher Hughes: un modelo in vitro para el estudio de la angiogénesis (Entrevista)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that ...

Investigación

Biología

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

Un dispositivo de microfluidos con los patrones de Surco para el estudio del comportamiento celular

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Técnicas de microinyección para el estudio de la mitosis en el Drosophila melanogaster Embrión sincitial

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

Un método de alto rendimiento para la crioconservación de esperma de pez cebra y In Vitro Fertilización

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generación de transgénicos C. elegans Por la transformación biolística

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch clamp y técnicas de perfusión para el estudio de los canales iónicos expresados ​​en Xenopus Ovocitos

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Adenofection: A Method for Studying the Role of Molecular Chaperones in Cellular Morphodynamics by Depletion-Rescue Experiments

Adenofection: Un método para estudiar el papel de las chaperonas moleculares en Morfodinámica celular mediante experimentos de reducción-Rescate

Cellular processes such as mitosis and cell differentiation are governed by changes in cell shape that largely rely on proper remodeling of the cell ...

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

Un método de transposición eficiente In Vitro por un sistema de belleza durmiente transcripcionalmente regulada en un Vector lentivirales defectuosa integración

The Sleeping Beauty (SB) transposon is a non-viral integrating system with proven efficacy for gene transfer and functional genomics. To optimize the SB ...

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Enfoques cuantitativos para el estudio de las estructuras celulares y la morfología de los organélilos en Los cenoheman

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these ...