Name: an in vitro model for studying cellular transformation by kaposi sarcoma herpesvirus
Uploaded: 2017-08-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus at JoVE.com

Detta arbete fick stöd av K12 HD068322 (SCM); R01 CA179921 och P51 OD011092 (AVM); och belöna 14PRE20320014 från Amerika hjärtat Association (SB).

Obs: alla förfaranden som beskrivs i detta protokoll bör utföras under BSL-2 villkor.
 1. KSHV lager förberedelse <ol><li>förbereda TNE buffert: lös 292.24 mg EDTA i ddH 2 O, föra till 225 mL och justera till pH 8. Lös 605.7 mg Tris i ddH 2 O, föra till 225 mL och justera till pH 8. Kombinera EDTA och Tris lösningar, tillsätt 4,38 g NaCl, anpassa den slutliga volymen till 500 mL, filtrera sterilisera och förvaras vid 4 ° C .</li>
	<li>Kultur de ...

Onkogenes är en process som kringgår viktiga garantier inom en organism36. Som KS lesioner finns längs ett spektrum av kronisk inflammation till sann sarkom, kräver klargörande av vissa patofysiologiska processer som medieras av KSHV att vissa studier utföras i cell kultur-modeller som stöder omvandling9. Det bör noteras att förlust av kontakt hämning och anchorage-beroende tillväxt, fenotyper vägledande av cellulära omvandling, inte lätt utvecklas efter infek...

Kaposis sarkom (KS) är en multi fokala angioproliferative tumör som drabbar huden, slemhinnor och viscerala platser som utvecklar oftast i fastställandet av avancerade immunsystemet1. Fyra epidemiologiska former har beskrivits: classic, en indolent form som vanligtvis drabbar äldre människor i Medelhavsområdet och Mellanöstern arv. iatrogen, följd av behandling med Immunosuppressiva läkemedel efter organtransplantation; epidemi, en AIDS-relaterad cancer; och endemiska, en HIV-oberoende form vanligt hos barn i endemiska områden i Afrika. Med tillkomsten av effektiva kombinationsregimer antiretrovirala läkemedel för behandling av HIV diagnostiseras epidemisk KS mycket mindre vanligt i utvecklingsländerna. De kliniskt aggressiv endemiska och epidemiska formerna dock bland de vanligaste diagnosen cancer i många afrikanska länder2,3,4. Identifiering av effektiva patogenes-riktade läkemedel för behandling av KS är därför prioriteras forskning.
Histologiskt, kännetecknas KS lesioner av omfattande men onormal kärlnybildning whereby spindel celler av EG ursprung bilda diskontinuerligt vaskulär nätverk5. Dessa onormala fartyg (”vaskulär slitsar”) tillåta extravasation av erytrocyter, som ger lesioner deras karakteristiska färg. Dessutom innehålla lesioner talrika leukocyter som kännetecknar kronisk inflammation (dvs, lymfocyter, makrofager och plasmaceller). Regression av KS lesioner efter immun beredning har beskrivits, vilket tyder på att KS har drag av både en hyper-proliferativ lesion och en sann tumör6,7,8,9.
KS herpesvirus (KSHV), vilka smittämnen av KS, identifierades 199410. Sedan då många i vitro cellkultur modeller har utvecklats för att aktivera patogenes studier, inklusive celler explanterad från tumör biopsi material och primär eller telomeras-uttryckande EG angripits KSHV in vitro-11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18. ingen av de för närvarande tillgängliga modellerna helt recapitulates KS tumör mikromiljö, men alla har bidragit med värdefull kunskap till vår förståelse av patobiologi KSHV infektion. Till skillnad från de andra kända tumörframkallande människa herpesvirus Epstein - Barr virus (EBV), KSHV inte lätt förvandla celler i kultur efter de novo infektion19,20,21, 22. men denna begränsning har övervunnits av transducing primära mänskliga EG av antingen blandat mikrovaskulära eller lymfatiska ursprung med E6 och E7 gener från humant papillomvirus typ 16 före infektion med KSHV23,24 . Uttryck för dessa exogena onkogener ökar dramatiskt omvandlande potential KSHV in vitro- delvis genom att tillhandahålla ytterligare hämning av retinoblastom protein och p5323,24. Denna EG transduktion metod har tillåtit flera laboratorier att identifiera viktiga förändringar i mottagande cell genuttryck som induceras av KSHV infektion och som tycks underlätta KS cell överlevnad och spridning25,26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. de protokoll som beskrivs häri är okomplicerad och mycket reproducerbara, och kommer att resultera i generationen och passage-åldersmatchade KSHV-infekterade EG och mock-infekterade kontroller som kan vara odlade långt längre än primära celler och kommer Tillåt för utredning av onkogena mekanismer anställd av KSHV. Även om protokollet innehåller en metod för framställning av vildtyp KSHV från den primära utgjutning lymfom cellinje BCBL-1, E6/E7-förevigade EG också är mycket mottagliga för härrör infektion med rekombinant BACmid KSHV-BAC1630. Protokoll för beredning av BAC16 beskrivs någon annanstans33,34.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BCBL-1 cells</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>3233</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PA317 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2203</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neonatal dermal microvascular endothelial cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2505</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 Basal Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3156</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-KSHV LANA/ORF 73</td>
			<td>Advanced Biotechnologies</td>
			<td>13-210-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLETMExpress, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12604013</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS with calcium and magnesium</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro model for studying cellular transformation by kaposi sarcoma herpesvirus

Kaposis sarkom (KS) är en ovanlig tumör bestående av prolifererande spindel celler som initieras av infektion av endotelceller (EG) med KSHV, och utvecklar oftast i fastställandet av immunsuppression. Trots decennier av forskning, optimal behandling av KS fortfarande dåligt definierade och kliniska resultat är särskilt ogynnsamma i begränsade resurser inställningar. KS lesioner drivs av patologisk angiogenes, kronisk inflammation och Onkogenes, och olika in vitro- cell kultur modeller har utvecklats för att studera dessa processer. KS uppkommer KSHV-infekterade celler av endotel ursprung, så EG-lineage celler ger de mest lämpliga in vitro- ersättningar av spindeln cell föregångaren. Men eftersom EG har en begränsad i vitro livslängd, och som de onkogena mekanismer som anställd av KSHV är mindre effektiva än de andra tumörframkallande virus, det har varit svårt att utvärdera processerna för omvandling i primär eller telomeras-förevigade EC. Därför utvecklades en ny EG-baserade kultur modell som lätt stöder omvandling efter infektion med KSHV. Ektopisk uttryck av E6 och E7 generna av humant papillomvirus typ 16 möjliggör utökade kultur och passage-åldersmatchade mock - och KSHV-smittade EG och stöder utvecklingen av en verkligt transformerade (dvs tumörframkallande) fenotyp i infekterade cellkulturer . Denna eftertraktansvärda och mycket reproducerbara modell av KS har underlättat upptäckten av flera viktiga signalvägar med hög potential för översättning till kliniska inställningar.

Morfologi av primära EG beskrivs klassiskt som ”kullersten”, och denna morfologi ändras inte av uttryck av papillomvirus E6 och E7 gener (figur 1A). Uttryck av E6 och E7 generna ensam inducerar inte en transformerade fenotyp; Således, celler är mottagliga för kontakta hämning och upphör att dela när den når sammanflödet i kultur. Cellerna kommer emellertid föröka och återföds till sammanflödet på trypsinization och replating på en lägre densitet, vil...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus at JoVE.com

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposis sarkom (KS) är en tumör som induceras av infektion med de onkogena virus människa herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV). Endotelcell kultur modellen beskrivs här är unikt lämpade för att studera de mekanismer genom vilka KSHV förvandlar värdceller.

En In Vitro -modell för att studera cellulära omvandling av Kaposis sarkom Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

Research

JoVE Journal

Biology

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis Interview

Christopher Hughes: En in vitro modell för studier av angiogenes (intervju)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that ...

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

En mikroflödessystem enhet med Groove Mönster till Studera Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Mikroinjektion Tekniker för att studera Mitos i Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

En hög genomströmning Metod för Zebrafish Spermier Frysförvaring och In Vitro Befruktning

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generering av Transgena C. elegans Genom Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp och tekniker perfusion för att studera jonkanaler Uttryckt i Xenopus Oocyter

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Spårning av Hematopoietic Stem och stamceller i vuxen mus calvarial Benmärg

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Adenofection: A Method for Studying the Role of Molecular Chaperones in Cellular Morphodynamics by Depletion-Rescue Experiments

Adenofection: En metod för att studera rollen av Molecular Följeslagare i Cellular morfodynamiska av Depletion-Räddnings Experiment

Cellular processes such as mitosis and cell differentiation are governed by changes in cell shape that largely rely on proper remodeling of the cell ...

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

En effektiv In Vitro införlivande metod av en Transcriptionally reglerade Sleeping Beauty System paketeras i en Integration defekta Lentiviral Vector

The Sleeping Beauty (SB) transposon is a non-viral integrating system with proven efficacy for gene transfer and functional genomics. To optimize the SB ...

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Kvantitativa metoder för att studera cellulära strukturer och organell morfologi i Caenorhabditis elegans

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these ...