Name: a platform of anti-biofilm assays suited to the exploration of natural compound libraries
Uploaded: 2016-12-27T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Platform of Anti-biofilm Assays Suited to the Exploration of Natural Compound Libraries at JoVE.com

המחברים מודים פרופסור פול קוס ו LMPH, אוניברסיטת אנטוורפן, בלגיה על תמיכתו בתהליך הצילומים במעבדתו. עבודה זו מומנה על ידי האקדמיה פרויקטים פינלנד (פרויקטי 272,266 ו 282,981) ו Svenska Tekniska Vetenskapsakademien אני פינלנד. התרומות הטכניות של MSc יאני Kujala מוכרים.

1. גידול החיידקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום התרבות חיידקים לילה במרק סויה tryptic (TSB) על 37 מעלות צלזיוס עם 220 סל&quot;ד רועד (16-18 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את התרבות מראש 100-1,000 פעמים (תלוי בקצב הצמיחה של החיידקים; כאן, 1,000 פעמים משמשות ...

<ol>
	<li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+biofilms:+a+common+cause+of+persistent+infections.">Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li><li>Dufour, D., Leung, V., L&#233;vesque, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+biofilm:+structure,+fuction,+and+antimicrobial+resistance.">Bacterial biofilm: structure, fuction, and antimicrobial resistance.</a> Endodontic Topics. 22, 2-16 (2012).</li><li>Donne, J., Dewilde, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Challenging+World+of+Biofilm+Physiology.">The Challenging World of Biofilm Physiology.</a> Adv. Microb. Physiol. 67, 235-292 (2015).</li><li>Otto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+infections:+mechanisms+of+biofilm+maturation+and+detachment+as+critical+determinants+of+pathogenicity.">Staphylococcal infections: mechanisms of biofilm maturation and detachment as critical determinants of pathogenicity.</a> Annu. Rev. Med. 64, 175-188 (2013).</li><li>Cos, P., Tote, K., Horemans, T., Maes, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+an+extra+hurdle+for+effective+antimicrobial.">Biofilms: an extra hurdle for effective antimicrobial.</a> Curr. Pharm. Des. 16, 2279-2295 (2010).</li><li>Bjarnsholt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+biofilm.">The in vivo biofilm.</a> Trends Microbiol. 21, 466-474 (2013).</li><li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+cells.">Persister cells.</a> Annu. Rev. Microbiol. 64, 357-372 (2010).</li><li>Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+Pseudomonas+aeruginosa+strains+producing+high+levels+of+persister+cells+in+patients+with+cystic+fibrosis.">Emergence of Pseudomonas aeruginosa strains producing high levels of persister cells in patients with cystic fibrosis.</a> J. Bacteriol. 192, 6191-6199 (2010).</li><li>Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M., Hamilton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+biofilm+disinfectant+efficacy+tests.">Comparative evaluation of biofilm disinfectant efficacy tests.</a> J. Microbiol. Methods. 70, 236-244 (2007).</li><li>Goeres, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+growing+a+biofilm+under+low+shear+at+the+air-liquid+interface+using+the+drip+flow+biofilm+reactor.">A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor.</a> Nat. Protoc. 4, 783-788 (2009).</li><li>Goeres, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+assessment+of+a+laboratory+method+for+growing+biofilms.">Statistical assessment of a laboratory method for growing biofilms.</a> Microbiology. 151, 757-762 (2005).</li><li>Parker, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ruggedness+and+reproducibility+of+the+MBEC+biofilm+disinfectant+efficacy+test.">Ruggedness and reproducibility of the MBEC biofilm disinfectant efficacy test.</a> J. Microbiol. Methods. 102, 55-64 (2014).</li><li>Ceri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Calgary+Biofilm+Device:+new+technology+for+rapid+determination+of+antibiotic+susceptibilities+of+bacterial+biofilms.">The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms.</a> J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).</li><li>Harrison, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtiter+susceptibility+testing+of+microbes+growing+on+peg+lids:+a+miniaturized+biofilm+model+for+high-throughput+screening.">Microtiter susceptibility testing of microbes growing on peg lids: a miniaturized biofilm model for high-throughput screening.</a> Nat. Protoc. 5, 1236-1254 (2010).</li><li>Konrat, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bead+Assay+for+Biofilms:+A+Quick,+Easy+and+Robust+Method+for+Testing+Disinfectants.">The Bead Assay for Biofilms: A Quick, Easy and Robust Method for Testing Disinfectants.</a> PLoS One. 11, e0157663 (2016).</li><li>Cragg, G. M., Newman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+products:+A+continuing+source+of+novel+drug+leads.">Natural products: A continuing source of novel drug leads.</a> Biochim Biophys Acta. 1830, 3670-3695 (2013).</li><li>Sandberg, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pros+and+cons+of+using+resazurin+staining+for+quantification+of+viable+Staphylococcus+aureus+biofilms+in+a+screening+assay.">Pros and cons of using resazurin staining for quantification of viable Staphylococcus aureus biofilms in a screening assay.</a> J. Microbiol. Methods. 78, 104-106 (2009).</li><li>Mariscal, A., Lopez-Gigosos, R., Carnero-Varo, M., Fernandez-Crehuet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+assay+based+on+resazurin+for+detection+of+activity+of+disinfectants+against+bacterial+biofilm.">Fluorescent assay based on resazurin for detection of activity of disinfectants against bacterial biofilm.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 82, 773-783 (2009).</li><li>Peeters, E., Nelis, H., Coenye, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+multiple+methods+for+quantification+of+microbial+biofilms+grown+in+microtiter+plates.">Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates.</a> J. Microbiol. Methods. 72, 157-165 (2008).</li><li>Pettit, R., Weber, C., Pettit, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+high+throughput+Alamar+blue+biofilm+susceptibility+assay+to+Staphylococcus+aureus+biofilms.">Application of a high throughput Alamar blue biofilm susceptibility assay to Staphylococcus aureus biofilms.</a> Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. 8 (28), (2009).</li><li>Stepanovic, S., Vukovic, D., Dakic, I., Savic, B., Svabic-Vlahovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+microtiter-plate+test+for+quantification+of+staphylococcal+biofilm+formation.">A modified microtiter-plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation.</a> J. Microbiol. Methods. 40, 175-179 (2000).</li><li>Stiefel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+biofilm+removal+properly+assessed?+Comparison+of+different+quantification+methods+in+a+96-well+plate+system.">Is biofilm removal properly assessed? Comparison of different quantification methods in a 96-well plate system.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. , (2016).</li><li>Sandberg, M., M&#228;&#228;tt&#228;nen, A., Peltonen, J., Vuorela, P. M., Fallarero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automating+a+96-well+microtitre+plate+model+for+Staphylococcus+aureus+biofilms:+an+approach+to+screening+of+natural+antimicrobial+compounds.">Automating a 96-well microtitre plate model for Staphylococcus aureus biofilms: an approach to screening of natural antimicrobial compounds.</a> Int. J. Antimicrob. Agents. 32, 233-240 (2008).</li><li>Thomas, V. L., Sanford, B. A., Moreno, R., Ramsay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-linked+lectinsorbent+assay+measures+N-acetyl-D-glucosamine+in+matrix+of+biofilm+produced+by+Staphylococcus+epidermidis.">Enzyme-linked lectinsorbent assay measures N-acetyl-D-glucosamine in matrix of biofilm produced by Staphylococcus epidermidis.</a> Curr. Microbiol. 35, 249-254 (1997).</li><li>Burton, E., Yakandawala, N., LoVetri, K., Madhyastha, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microplate+spectrofluorometric+assay+for+bacterial+biofilms.">A microplate spectrofluorometric assay for bacterial biofilms.</a> J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 34, 1-4 (2007).</li><li>Skogman, M. E., Vuorela, P. M., Fallarero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+biofilm+matrix+measurements+with+biomass+and+viability+assays+in+susceptibility+assessments+of+antimicrobials+against+Staphylococcus+aureus+biofilms.">Combining biofilm matrix measurements with biomass and viability assays in susceptibility assessments of antimicrobials against Staphylococcus aureus biofilms.</a> J. Antibiot. Tokyo. 65, 453-459 (2012).</li><li>Skogman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+antibacterial+and+anti-biofilm+activities+of+cinchona+alkaloid+derivatives+against+Staphylococcus+aureus).">Evaluation of antibacterial and anti-biofilm activities of cinchona alkaloid derivatives against Staphylococcus aureus).</a> Nat. Prod. Commun. 7, 1173-1176 (2012).</li><li>Fallarero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(+)-+Dehydroabietic+Acid,+an+Abietane-Type+Diterpene,+Inhibits+Staphylococcus+aureus+Biofilms+in+Vitro.">(+)- Dehydroabietic Acid, an Abietane-Type Diterpene, Inhibits Staphylococcus aureus Biofilms in Vitro.</a> Int J Mol Sci. 14, 12054-12072 (2013).</li><li>Manner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+derivatives+of+dehydroabietic+acid+target+planktonic+and+biofilm+bacteria+in+Staphylococcusaureus+and+effectively+disrupt+bacterial+membrane+integrity.">New derivatives of dehydroabietic acid target planktonic and biofilm bacteria in Staphylococcusaureus and effectively disrupt bacterial membrane integrity.</a> Eur. J. Med. Chem. 102, 68-79 (2015).</li><li>Muller, G., Kramer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatibility+index+of+antiseptic+agents+by+parallel+assessment+of+antimicrobial+activity+and+cellular+cytotoxicity.">Biocompatibility index of antiseptic agents by parallel assessment of antimicrobial activity and cellular cytotoxicity.</a> J. Antimicrob. Chemother. 61, 1281-1287 (2008).</li><li>Tot&#233;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+efficacy+of+various+antibiotics+on+matrix+and+viable+mass+of+Staphylococcus+aureus+and+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Inhibitory efficacy of various antibiotics on matrix and viable mass of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Int. J. Antimicrob. Agents. 33, 525-531 (2009).</li><li>Djordjevic, D., Wiedmann, M., McLandsborough, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtiter+plate+assay+for+assessment+of+Listeria+monocytogenes+biofilm+formation.">Microtiter plate assay for assessment of Listeria monocytogenes biofilm formation.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 2950-2958 (2002).</li><li>Li, X., Yan, Z., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+variation+of+biofilms+among+strains+in+natural+populations+of+Candida+albicans.">Quantitative variation of biofilms among strains in natural populations of Candida albicans.</a> Microbiolog. 149, 353-362 (2003).</li><li>Barbosa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+and+simple+micro+assay+for+sulfated+glycosaminoglycans+quantification+in+biological+extracts+and+its+use+in+skin+and+muscle+tissue+studies.">Improved and simple micro assay for sulfated glycosaminoglycans quantification in biological extracts and its use in skin and muscle tissue studies.</a> Glycobiology. 13, 647-653 (2003).</li><li>Tot&#233;, K., Vanden Berghe, D., Maes, L., Cos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+colorimetric+microtitre+model+for+the+detection+of+Staphylococcus+aureus+biofilms.">A new colorimetric microtitre model for the detection of Staphylococcus aureus biofilms.</a> Lett. Appl. Microbiol. 46, 249-254 (2008).</li><li>Arciola, C. R., Campoccia, D., Ravaioli, S., Montanaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysaccharide+intercellular+adhesin+in+biofilm:+structural+and+regulatory+aspects.">Polysaccharide intercellular adhesin in biofilm: structural and regulatory aspects.</a> Front Cell Infect Microbiol. 5 (7), (2015).</li><li>Ausbacher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+biofilm+susceptibility+to+small+and+potent+beta(2,2)-amino+acid+derivatives.">Staphylococcus aureus biofilm susceptibility to small and potent beta(2,2)-amino acid derivatives.</a> Biofouling. 30, 81-93 (2014).</li></ol>

אין שיטה אחת שניתן למדוד את ההשפעה זמנית של תרכובת על הכדאיות, ביומסה, ומטריקס ביופילם. לכן, יש צורך לשלב מבחנים כדי לזהות השפעה על שלוש נקודות הקצה, רצוי בשלב סינון ראשוני. Resazurin הוא פרוטוקול מכתים מאוד פשוט המורכבת רק התוספת של חל...

חיידקים יכולים לעבור בין שני סגנונות חיים שונים מאוד, planktonic ו נייחים, מתוכם ביופילם היא הדוגמה הנפוצה ביותר. ב biofilms, חיידקים ליצור קהילות מובנהיות משוקעות בתוך הגוש בהפקה עצמית 1. מטריקס בהפקה עצמית זו הוא חסם בין חיידקי הסביבה החיצונית שלהם, והוא מגן על תאי חיידקים, שמירה על אותם בקרבת המקום. הרכב של מטריקס ביופילם משתנה בין ואף בתוך מינים, אבל זה מורכב בעיקר רשת הדוקה של lipopolysaccharides, DNA התאי, וחלבונים. המטריצה משמשת כמחסום פיזי עיכוב הכניסה של סוכנים מזיקים, אבל זה גם מגן על ביופילם מהתייבשות ומונע הזנה לברוח התא 2. Biofilms נחשב אחד הנושאים המאתגרים ביותר של רפואה המודרנית, והם כביכול אחראים על 80% של זיהומים אנטיביוטיים סובלני 3. הם חד פעמייםשכב סובלנות גבוהה מטבעם מפני איומים חיצוניים: לחות, לחץ האוסמוטי, לחץ מכאני 4, חום, קרינת UV 5, חומרי חיטוי, סוכני מיקרוביאלית, ומערכת החיסון של פונדקאי 1. לדוגמה, ריכוז סוכן מיקרוביאלית נדרש נדרש להרוג biofilm הוכח להיות עד 1,000 פעמים גבוה בהשוואה לזה הנדרש כדי להרוג חיידקים planktonic. הסבר סובלנות גבוהה יותר זה נראה מולטיפקטוריאלית. המטריצה ​​מספקת מכשול פיזי מקטין את חדירת אנטיביוטיקה לתוך ביופילם. כמו כן, תאים בתוך biofilms הם phenotypically מגוונים; שהם מעבר בין מדינות שונות מטבולית בשל שיפוע הקיים של חמצן, חומרי הזנה, מטבוליטים בין החלקים הפנימיים והחיצוניים של ביופילם 6. לפיכך, באזורים מסוימים ביופילם, כגון הליבה, חיידקים ללא חמצן וחומרים מזינים חיים פעילים מבחינה מטבולית פחות או במצב רדום לחלוטין <sup&gt; 7. התאים הרדומים לחלוטין מכונים תאי persister כמו, והם אינם רגישים 8 טיפולים קונבנציונליים מיקרוביאלית. לפיכך, סביר להניח כי החוסן ביופילם נובע משילוב של הציעו כיום ואחרים, עדיין לא ידוע, מנגנונים. Spp Staphylococcus. הם עדיין בין חיידקים גראם-חיוביים הבעייתי ביותר, גרימת 4 חמורים, לעיתים קרובות הקשורים biofilm, זיהומים. הוא הציע כי עד 99% מכלל החיידקים קשורים בתוך biofilms, מה שהופך אותו אורח חי חיידקי שולט 3. עם זאת, כל האנטיביוטיקה הקיימים כיום פותחו נגד חיידקים חד תאיים (planktonic). עד כה, רפרטואר מצומצם מאוד של מולקולות קיים שיכול לפעול באופן סלקטיבי על biofilms הבוגרת. מצב זה מונע שינוי פרדיגמה מתקדם לגילוי תרופות, שבה מחפש-biofilms אנטי כבר דחק לתפוס מקום בולט יותר. מנקודת methodologפרספקטיבת iCal, אתגרים נוספים קיימות, כמו שרק מספר מצומצם של שיטות ביופילם פותח על ידי ארגונים תקינים, במיוחד לאלו החלימו על הקרנת התפוקה הגבוהה של ספריות כימיות. כל המבחנים הסטנדרטיים (עם רק חריג אחד) מבוססים על כורי biofilm, ושיטות אלה דורשים כמויות עבודה גדולות וכמויות גדולות של תרכובות להיבדק, אשר בדרך כלל אינן זמינים בשלב המחקר מוקדם 9-12. ההקרנה ניתן ליישמן הסטנדרטי הקיימים רק assay הוא ההתקן שנקרא קלגרי Biofilm, שממנו ריכוז ביטול biofilm מינימום הזמין המסחרי (MBEC) המערכת פותחה 13-15. עם זאת, המגבלה של assay זה היא כי biofilms גדל על יתדות, ולא כל מיני החיידקים או אפילו זנים בתוך אותו המין מסוגלים ליצור biofilms במכשיר זה. יתר על כן, שיטות שניתן ליישם במיוחד למשימות של תרכובות טבעיות הןנָחוּץ. מוצרים טבעיים היו המקור העיקרי בזכות חדשנותה בתחום גילוי תרופות מיקרוביאלית במאה השנים האחרונות 16. הם יכולים לספק תרכובות אנטי biofilm רומן עם מנגנוני פעולה ייחודיים כי גם יכול להיות יעיל נגד תאי persister. לפיכך, החקר של ספריות טבעיות ובאופן טבעי השראה שקיים הסתברות גבוהה של ייצור ידיעה אנטי biofilm מבטיחה וייחודית. כאן, אנו מציגים את הפרטים הניסיונות של פלטפורמה של מבחנים אשר פותחה עבור ההקרנה הכימית של תרכובות אנטי biofilm באמצעות שלושה מבחנים למדוד את ההשפעות על הכדאיות, ביומסה מוחלטת, מטריצה של biofilms Staphylococcus aureus. את assay הראשון מודד כדאיות ביופילם, והיא מבוססת על מכתים resazurin. Resazurin היא כתם חיזור כי הוא כחול ללא ניאון במצב מחומצן שלה והופך ורוד, resorufin פלורסנט מאוד כאשר מופחת על ידי פעילות מטבולית של חיידקים. זהו מ &#39;מאוד פשוטים ומהיריםethod המתאים וניפוי ראשוני 17-20. את assay השני, המבוסס על מכתים סגול קריסטל, מודד את המסה ביופילם הכולל. סגול קריסטל הוא כתם בשימוש נרחב ללימוד חיידקים וחיידקים biofilms 19,21-23. Assay הוא מבוסס על חומרים כימיים זולים ויש לו קריאת סיום הספיג פשוטה. לבסוף, assay השלישי מתמקד חומר פולימרי תאיים (EPS) -matrix של ביופילם באמצעות נבט חיטה agglutinin (WGA), הנקשר באופן פולי N שאריות -acetyl-גלוקוזאמין (PNAG) הנוכחי במטריצה של biofilms staphylococcal 24. של WGA היא מצומדת עם fluorophore כי ניתן לאתר באמצעות קוראי עוצמת הקרינה 25. אנו מציגים כאן את הרציונל ופרטים של הפלטפורמה שפתחנו, כולל דוגמאות של יישומים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Resazurin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R7017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HT90132&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>W11261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD BacLight&#160;</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>L7012</td>
			<td>SYTO 9 for staining viable cells green and propidium iodide for staining dead cells red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone soy agar</td>
			<td>Lab M, Neogen</td>
			<td>LAB011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptine soy broth</td>
			<td>Lab M, Neogen</td>
			<td>LAB004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F96 Well Plate Polystyrene Sterile Clear Flat bottom</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>161093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND caps, strips of 8</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>BR781413-300EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson CPX series ultrasonic bath</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z769428-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipipette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multidrop dispenser</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomek 3000</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varioskan Flash Multiplate reader</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staphylococcus aureus</td>
			<td>ATCC&#160;</td>
			<td>25923</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a platform of anti-biofilm assays suited to the exploration of natural compound libraries

Biofilms נחשב אחד הנושאים המאתגרים ביותר של רפואה המודרנית, והם בעלי פוטנציאל אחראים על 80% של זיהומים אנטיביוטיים סובלנית. Biofilms הפגין סובלנות גבוהה במיוחד עבור כימותרפיה, אשר נחשבה מולטיפקטוריאלית. למשל, המטריצה ​​מספקת מכשול פיזי מקטין את חדירת אנטיביוטיקה לתוך ביופילם. כמו כן, תאים בתוך biofilms הם phenotypically מגוונים. סביר, החוסן ביופילם נובע משילוב של אלה ואחרים, עדיין לא ידועים, מנגנונים. כל האנטיביוטיקה הקיימים כיום פותחו נגד חיידקים חד תאיים (planktonic). לכן, עד כה, רפרטואר מצומצם מאוד של מולקולות קיים שיכול לפעול באופן סלקטיבי על biofilms הבוגרת. מצב זה מונע שינוי פרדיגמה מתקדם לגילוי תרופות, שבה מחפש-biofilms אנטי כבר דחק לתפוס מקום בולט יותר. אתגר נוסף הוא כי ישמאוד מוגבל במספר השיטות הסטנדרטיות למחקר ביופילם, במיוחד אלה שיכולים לשמש הקרנה גדולה תפוקה של ספריות כימיות. הנה, פלטפורמה אנטי biofilm ניסיון להקרנה כימית מוצגת. היא משתמשת שלושה מבחנים למדוד כדאיות ביופילם (עם מכתים resazurin), ביומסה הכולל (עם מכתים סגול קריסטל), מטריצת ביופילם (באמצעות agglutinin ניבט חיטה, מכתים WGA-קרינה מבוססת של N -acetyl-גלוקוזאמין פולי, PNAG , שבריר). כל המבחנים פותחו באמצעות Staphylococcus aureus כמו חיידקי המודל. דוגמאות לאופן שבו הפלטפורמה יכולה לשמש לסינון ראשוני וכן אפיון פונקציונלי של להיטים אנטי biofilm המזוהים מוצגות. רצף ניסיוני זה מאפשר נוסף לסיווג הלהיטים המבוססים על נקודות קצה הנמדדות. הוא גם מספק מידע על אופן הפעולה שלהם, במיוחד על לטווח ארוך בניגוד לתופעות כימותרפיות לטווח קצר. לכן, זה מאוד אדוהntageous לזיהוי המהיר של תרכובות להיט באיכות גבוהה שיכול לשמש נקודות התחלה עבור יישומים ביו שונים.

בשנת הפלטפורמה המוצעת, את ההשפעות על הכדאיות, ביומסה, ומטריקס ביופילם הן לכמת. בסיקוונס העבודה (איור 1), צלחת דגימה אחת מוכתמת resazurin ובהמשך עם סגול קריסטל כדי להעריך את ההשפעות זמנית על הכדאיות biofilm חיידקים על ביומסה biofilm הכולל. מבחני שניהם יכ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Platform of Anti-biofilm Assays Suited to the Exploration of Natural Compound Libraries at JoVE.com

A Platform of Anti-biofilm Assays Suited to the Exploration of Natural Compound Libraries

Biofilm infections show high tolerance towards chemotherapy. No single assay captures the complexity of biofilms. Instead, complementary assays are needed. We present a screening platform (developed for S. aureus) that combines assays for viability, biomass, and biofilm matrix. It allows anti-biofilm drug discovery, including the assessment of long-term chemotherapeutic effects.

פלטפורמה של מבחנים אנטי biofilm המתאים לחקירת ספריות תרכובת טבעיות

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

הכנה ושימוש של HIV-1 CD4 ראשי מאשרום + T-תאים כמו תאים היעד של טבע Cell מבחני Killer ציטוטוקסיות

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

גבוהה Scalable תפוקה בחירה מספריות נוגדן סינטטיים-מוצג הפאג

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

מבחנים איכותיים וכמוני עבור זיהוי ואפיון של antimicrobials החלבון

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

ניתוח תזרים Cytometric של תא הטבעי Killer ממס פעילות דם מלא אנוש

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

הקרנת מבחני לאפיין הרגולטורים אנדותל הרומן מעורבים בתגובה דלקתית

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression וטיהור האדם<em&gt; Cis</em&gt; פרנליטרונפרפרז ב<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers

בניית פלטפורמה תפוקה גבוהה ההקרנה כדי להעריך את הטרוגניות של HER2 הגברה ג'ין סרטן שד

Targeted therapies against the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) have radically changed the outcome of patients with HER2-positive breast ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

הרומן מזין ללא מערכת לייצור המוני של תאים רוצח טבעי מאתר במבחנה

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

שילוב ניתוח של דנ א ב מיצוי Virion גולמי עם הניתוח של RNA של עלים נגועים לגלות הגנום וירוס חדש

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

פלטפורמה תפוקה גבוהה להקרנה של סלמונלה spp /שיגלה spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...