Name: high-throughput robotically assisted isolation of temperature-sensitive lethal mutants in chlamydomonas reinhardtii
Uploaded: 2016-12-05T14:00:00
Duration: 10 min 51 s
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हम सलाह और उपयोगी चर्चा के लिए क्रॉस प्रयोगशाला सदस्यों को धन्यवाद। इस काम PHS 5RO1-GM078153 द्वारा और द्वारा समर्थित किया गया सिमंस फाउंडेशन मीकल Breker करने से एक जूनियर फेलो अवार्ड।

<ol>
	<li>Tulin, F., Cross, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microbial+avenue+to+cell+cycle+control+in+the+plant+superkingdom.">A microbial avenue to cell cycle control in the plant superkingdom.</a> Plant Cell. 26, 4019-4038 (2014).</li><li>Cross, F. R., Umen, J. 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Phys. 17, 11933-11949 (2015).</li><li>Francis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+control+and+plant+development.+Annual+Plant+Reviews,+Volume+32.">Cell cycle control and plant development. Annual Plant Reviews, Volume 32.</a> Ann. Bot. 101, 1049-1050 (2008).</li><li>Zachariae, W., Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whose+end+is+destruction:+cell+division+and+the+anaphase-promoting+complex.">Whose end is destruction: cell division and the anaphase-promoting complex.</a> Genes Dev. 13, 2039-2058 (1999).</li><li>Merchant, S. 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Cell. 30, 248-258 (2008).</li><li>Mnaimneh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploration+of+essential+gene+functions+via+titratable+promoter+alleles.">Exploration of essential gene functions via titratable promoter alleles.</a> Cell. 118, 31-44 (2004).</li><li>Schuldiner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploration+of+the+function+and+organization+of+the+yeast+early+secretory+pathway+through+an+epistatic+miniarray+profile.">Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile.</a> Cell. 123, 507-519 (2005).</li><li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases.">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat. Biotechnol. 31, 827-832 (2013).</li><li>Jiang, W., Brueggeman, A. J., Horken, K. M., Plucinak, T. M., Weeks, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+transient+expression+of+Cas9+and+single+guide+RNA+genes+in+Chlamydomonas+reinhardtii.">Successful transient expression of Cas9 and single guide RNA genes in Chlamydomonas reinhardtii.</a> Eukaryot. Cell. 13, 1465-1469 (2014).</li></ol>

लेखकों कोई महत्वपूर्ण वित्तीय हितों की घोषणा।

मॉडल जीवों के व्यवस्थित उत्परिवर्ती संग्रह की प्ररूपी लक्षण वर्णन सेलुलर जटिलता विदारक के लिए एक सिद्ध दृष्टिकोण है। अगुणित कोशिकीय हरी शैवाल Chlamydomonas reinhardtii एक संयंत्र की तरह जीन सेट है, लेकिन यह भूमि संयंत्र 2 वंश में कई जीनोम दोहराव से पहले भूमि पौधों से अलग हुए। सिद्धांत रूप में, जीन दोहराव और एक मुख्य रूप से अगुणित जीवन चक्र की कमी बहुत हानि के समारोह आनुवंशिक दृष्टिकोण की सुविधा। हालांकि, ब्याज की जीन की लक्षित व्यवधान कुशल मुताबिक़ जीनोमिक एकीकरण की कमी के कारण लगभग असंभव है। एक यादृच्छिक इन्सर्शनल व्यवधान पुस्तकालय का निर्माण किया जा रहा है, बाधित साइट की पहचान के साथ संयुक्त, अब तक 1935 मैप किया 1,562 जीन 3 का प्रतिनिधित्व करने वाले अवरोधों का एक arrayed सेट उपज। हालांकि, इस दृष्टिकोण (सामान्य में उम्मीद अशक्त म्यूटेशन का उत्पादन करने के लिए) आवश्यक जीनों के लिए लागू नहीं है। तापमान के प्रति संवेदनशील (टीएस) म्यूटेशन recovere जा सकती हैआवश्यक जीन में डी, और हाल के तरीकों उत्परिवर्तित जीन और प्रेरणा का घाव के कुशल पहचान देते हैं। उच्च तापमान पर प्ररूपी विश्लेषण तो उत्परिवर्तित जीन के समारोह के बारे में तत्काल जानकारी प्रदान करता है। हम अलगाव और ~ 70 Chlamydomonas में आवश्यक जीन में म्यूटेशन टीएस घातक के लक्षण वर्णन पर सूचना दी, कोशिका चक्र प्रगति में शामिल जीनों पर विशेष रूप से ध्यान केंद्रित है और 1,4 नियंत्रित करते हैं। टीएस घातक स्क्रीन दशकों 5,6 के लिए सूक्ष्मजीवों में आनुवांशिक विश्लेषण का एक मुख्य आधार किया गया है। सिद्धांत रूप में, एक वांछनीय विशेषता &quot;संतृप्ति,&quot; जिसका अर्थ है कि सभी मारक टीएस करने के लिए परिवर्तनशील में सक्षम जीन, कम से कम एक उत्परिवर्ती द्वारा पहचाने जाते हैं एक पूरा विश्लेषण की अनुमति दृष्टिकोण है। हालाँकि, व्यवहार में, कई कारकों संतृप्ति के लिए दृष्टिकोण की सीमा। सबसे पहले, जबकि लगभग सभी जीनों उच्च तापमान पर गतिविधि के नुकसान के लिए उत्परिवर्तित जा सकता है, इस तरह के म्यूटेंट की वसूली की दक्षता भर में कम से कम बदलता हैपरिमाण 7.8 के एक आदेश। इसलिए, एक यादृच्छिक स्क्रीन &quot;अक्सर यात्रियों&quot; लंबे समय से पहले संतृप्ति संपर्क किया है में आवर्तक हिट लेने के लिए शुरू होता है। दूसरा, जबकि टीएस म्यूटेशन आमतौर पर समारोह की कमी का परिणाम है, वे नहीं एक प्रतिबंधक तापमान पर सच nulls हो सकता है (इसके विपरीत और, अक्सर एक अनुमोदक के तापमान पर पूरी तरह से कार्य नहीं कर रहे हैं)। यह समस्या कई alleles की तुलना द्वारा कुछ हद तक निपटा जा सकता; अगर वे सब एक आम लक्षण प्रारूप का हिस्सा है, यह अधिक जीन की साधारण निष्क्रियता का परिणाम को प्रतिबिंबित करने की संभावना है। एकाधिक alleles भी प्रेरणा का घाव 1 की निश्चित आणविक पहचान के लिए बहुत उपयोगी हैं। हालांकि, &quot;लगातार उड़ाका&quot; समस्या का मतलब शायद ही कभी मारा जीन में कई alleles ठीक करने के लिए मुश्किल हो सकता है। इन कारणों के लिए, हम अलग और phenotypically टीएस म्यूटेंट को चिह्नित करने के लिए एक बढ़ाया पाइप लाइन विकसित किया गया है। हम 3,000 से अधिक टीएस म्यूटेंट एकत्र किया है अब तक, मैंके बारे में 200 नए उम्मीदवार कोशिका चक्र म्यूटेशन ncluding। इस संग्रह है, जो पहले से ही होने की संभावना सबसे अधिक या सभी सेल आवश्यक रास्ते में परिवर्तन भी शामिल है, की आणविक और प्ररूपी विश्लेषण संयंत्र कोशिका जीव विज्ञान में नए अंतर्दृष्टि और परिकल्पना प्रदान करना चाहिए। महत्वपूर्ण बात, इस पाइप लाइन के किसी भी सूक्ष्मजीव कि अगर पर बढ़ता कुशलता टीएस उत्परिवर्ती संग्रह का निर्माण करने के लिए लागू किया जा सकता है। उपकरण पर ध्यान दें: दो रोबोटों इस प्रक्रिया (एक कॉलोनी बीनने और एक संयोजन प्रतिकृति plater / चेरी बीनने) में दक्षता के लिए बहुत महत्वपूर्ण हैं। Pickers आम तौर पर धातु पिन है। उठाया कालोनियों कुछ अवधि के लिए इन पिन पर हवा में आयोजित की जाती हैं (मिनट के लिए सेकंड, मॉडल पर निर्भर करता है)। Chlamydomonas हवा में एक धातु पिन पर के बारे में 20 सेकंड में मर जाता है। इस जीव के लिए मॉडल पसंद प्रतिबंधित। सटीकता मायने रखती है। हमारी कॉलोनी बीनने हद तक सही है; हालांकि, यह अपनी कार्रवाई में कुछ हद तक हिंसक है और स्प्रे आधारित पार संदूषण के लिए कुछ संभावना है। यह उच्च पर इस्तेमाल नहीं किया हैएर से 384 घनत्व (4.5 मिमी केंद्र-केंद्र रिक्ति); इस घनत्व, सटीकता पूरी तरह से स्वीकार्य है। प्रतिकृति चढ़ाना / चेरी उठा रोबोट (विभिन्न इन अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल संलग्नक) उठा पर बहुत धीमी है, लेकिन 1,536 घनत्व के लिए काफी सटीक (6,144 एक चुनौती है, यहां तक ​​कि यह बहुत ही सटीक रोबोट के लिए है, हम इस घनत्व का मूल्यांकन किया लेकिन नहीं चुने गए हैं इसकी वजह यह अपने विभिन्न कठिनाइयों का उपयोग करने के लिए)। रोबोट में अच्छी तरह से काम नहीं करेंगे, तो प्लेटें, असमान लोड कर रहे हैं आदि। यह यकीन है कि सही बातें हो रही हैं होने की स्पॉट जाँच करने के लिए महत्वपूर्ण है; बेशक, रोबोट पहुंच से बाहर चला जाएगा और सामान्य में, सब कुछ ठीक है, तो पहले कुछ प्लेटों सही थे जाना होगा।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="672">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:293px;">Equipment:</td>
			<td style="width:144px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hudson RapidPick colony picker</td>
			<td>Hudson Robotics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MultiDrop Combi Reagent Dispenser</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5840300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Small tube metal tip cassette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>24073295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Singer RotoR replica-plating robot</td>
			<td>Singer Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Very essential for the process. For lower scale screenings you can use an in-house manual tool</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Singer single-colony picking attachment (&#8216;Stinger&#8217;)</td>
			<td>Singer Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Can be picked manually, however for large scales it is nearly impossible</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Materials:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYTOX Green Nucleic Acid Stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S7020</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput robotically assisted isolation of temperature-sensitive lethal mutants in chlamydomonas reinhardtii

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the conventional approaches of permanent gene deletion cannot be applied to essential genes. We have pioneered a unique collection of ~70 temperature-sensitive (ts) lethal mutants for studying cell cycle regulation in the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii1. These mutations identify essential genes, and the ts alleles can be conditionally inactivated by temperature shift, providing valuable tools to identify and analyze essential functions. Mutant collections are much more valuable if they are close to comprehensive, since scattershot collections can miss important components. However, this requires the efficient collection of a large number of mutants, especially in a wide-target screen. Here, we describe a robotics-based pipeline for generating ts lethal mutants and analyzing their phenotype in Chlamydomonas. This technique can be applied to any microorganism that grows on agar. We have collected over 3000 ts mutants, probably including mutations in most or all cell-essential pathways, including about 200 new candidate cell cycle mutations. Subsequent molecular and cellular characterization of these mutants should provide new insights in plant cell biology; a comprehensive mutant collection is an essential prerequisite to ensure coverage of a broad range of biological pathways. These methods are integrated with downstream genetics and bioinformatics procedures for efficient mapping and identification of the causative mutations that are beyond the scope of this manuscript.

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High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Temperature-sensitive (ts) lethal mutants are valuable tools to identify and analyze essential functions. Here we describe methods to generate and classify ts lethal mutants in high throughput.

उच्च throughput रोबोट-समर्थित में तापमान के प्रति संवेदनशील घातक म्यूटेंट के अलगाव<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

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