Name: mesenchymal stromal cell culture and delivery in autologous conditions: a smart approach for orthopedic applications
Uploaded: 2016-12-08T15:00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mesenchymal Stromal Cell Culture and Delivery in Autologous Conditions: A Smart Approach for Orthopedic Applications at JoVE.com

This study was funded by the Tuscany Region (grant number 539999_2014_Petrini_CUCCS). The authors would like to thank Prof. S. Berrettini for authorizing the use of the Otolab laboratory and instruments, and the surgery staff from the Orthopedic Clinic II of the University of Pisa, for the fundamental cooperation in sample harvesting. The support provided by Dr. F. Scatena is gratefully acknowledged. Finally, many thanks are due to Mr. J.G. De La Ossa for his precious contribution to histologic processing.

<ol>
	<li>Horwitz, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarification+of+the+nomenclature+for+MSC:+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement.">Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 7, 393-395 (2005).</li><li>Kassem, M., Abdallah, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells:+biological+characteristics+and+potential+role+in+therapy+of+degenerative+diseases.">Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells: biological characteristics and potential role in therapy of degenerative diseases.</a> Cell Tissue Res. 331, 157-163 (2008).</li><li>Pittenger, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+potential+of+adult+human+mesenchymal+stem+cells.">Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.</a> Science. 284, 143-147 (1999).</li><li>Bonfield, T. L., Nolan Koloze, M. T., Lennon, D. P., Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+human+mesenchymal+stem+cells+efficacy+in+vivo.">Defining human mesenchymal stem cells efficacy in vivo.</a> J Inflamm. (Lond). 25 (7), 51 (2010).</li><li>Pneumaticos, S. G., Triantafyllopoulos, G. K., Chatziioannou, S., Basdra, E. K., Papavassiliou, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+strategies+of+bone+augmentation+in+spinal+surgery.">Biomolecular strategies of bone augmentation in spinal surgery.</a> Trends Mol. Med. 17 (4), 215-222 (2011).</li><li>Amhed, T. A. E., Dare, E. V., Hincke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin:+A+versatile+scaffold+for+tissue+engineering+applications.">Fibrin: A versatile scaffold for tissue engineering applications.</a> Tissue Engineering Part B. 14 (2), 199-215 (2008).</li><li>Silbertein, L. E., Williams, L. J., Huglett, M. A., Magee, D. A., Weisman, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+autologous+fibrinogen-based+adhesive+for+use+in+oncologic+surgery.">An autologous fibrinogen-based adhesive for use in oncologic surgery.</a> Transfusion. 28 (4), 319-321 (1988).</li><li>Jockenhoevel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+gel+advantages+of+a+new+scaffold+in+cardiovascular+tissue+engineering.">Fibrin gel advantages of a new scaffold in cardiovascular tissue engineering.</a> Eur. J. Cardiothorac Surg. 19 (4), 424-430 (2001).</li><li>Veronesi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+use+of+bone+marrow,+bone+marrow+concentrate,+and+expanded+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+in+cartilage+disease.">Clinical use of bone marrow, bone marrow concentrate, and expanded bone marrow mesenchymal stem cells in cartilage disease.</a> Stem Cells Dev. 22 (2), 181-192 (2013).</li><li>Petrini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+purification+of+mesodermal+progenitor+cells+from+human+adult+bone+marrow.">Identification and purification of mesodermal progenitor cells from human adult bone marrow.</a> Stem Cells Dev. 18 (6), 857-866 (2009).</li><li>Trombi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+culture+of+mesodermal+progenitor+cells.">Selective culture of mesodermal progenitor cells.</a> Stem Cells Dev. 18 (8), 1227-1234 (2009).</li><li>Trombi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+autologous+plasma-derived+clot+as+a+biological+scaffold+for+mesenchymal+stem+cells+in+treatment+of+orthopedic+healing.">Human autologous plasma-derived clot as a biological scaffold for mesenchymal stem cells in treatment of orthopedic healing.</a> J. Orthop. Res. 26 (2), 176-183 (2008).</li><li>Giannotti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+autologous+human+mesenchymal+stromal+cell/fibrin+clot+constructs+in+upper+limb+non-unions:+long+term+assessment.">Use of autologous human mesenchymal stromal cell/fibrin clot constructs in upper limb non-unions: long term assessment.</a> PlosOne. 8 (8), 73893 (2013).</li><li>Castano-Izquierdo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-culture+period+of+mesenchymal+stem+cells+in+osteogenic+media+influences+their+in+vivo+bone+forming+potential.">Pre-culture period of mesenchymal stem cells in osteogenic media influences their in vivo bone forming potential.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 82 (1), 129-138 (2007).</li><li>Malkani, A. L., Fitzgerald, R. H., Kaufer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Orthopaedics. , (2002).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICSH+guidelines+for+the+standardization+of+bone+marrow+specimens+and+reports.">ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports.</a> Int J Lab Hematol. 30 (5), 349-364 (2008).</li><li>Bugno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+BacT/ALERTR+3D+system+for+sterility+testingof+injectable+products.">Application of the BacT/ALERTR 3D system for sterility testingof injectable products.</a> Braz J Microbiol. 46 (3), 743-747 (2015).</li><li>Bonab, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+of+mesenchymal+stem+cells+in+vitro.">Aging of mesenchymal stem cells in vitro.</a> BMC Cell Biology. 7, 14 (2006).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

الخطوات الحاسمة من هذا القلق البروتوكول استخدام مصل الكبار البشري والبروتيني، والتي تسمح للحصول على BIOSAFE hMSC العلاج. على وجه الخصوص، ومصل الكبار البشري يمكن العزلة والصيانة، في حين البروتيني يضمن الحصاد، من البلدان المتوسطية الشريكة. هذه هي خلايا غير ناضجة الموجودة في نخاع العظام التي يمكن أن تؤدي إلى hMSCs جديدة، وبالتالي ضمان خزان hMSCs قابلة للحياة على طول الوقت ثقافة. ليست كل البلدان المتوسطية الشريكة التي يمكن جمعها، لأن زيادة فترة التعرض لنشاط الأنزيم البروتيني غير ضارة لبقاء hMSC. لهذا السبب، تم اختيار البروتيني حضانة 10 دقيقة كما سطا الأمثل بين الانتعاش من البلدان المتوسطية الشريكة وصلاحية hMSCs. خطوة حاسمة أخرى هي المرة osteodifferentiation. في الواقع، فإن وجود واسعة النطاق في osteodifferentiation المختبر لحد كبير بقاء الخلية، مما يؤثر على تكوين العظام النهائي في الجسم الحي. الخطوة الأخيرة الفاصلة تتمثل في النفع من سقالة bioresorbable ذاتي، حركتييتم الحصول على ساعة عن طريق دمج الخلايا (hMSCs والبلدان المتوسطية الشريكة) في جل الليفين من تخثر البلازما. خطوة رئيسية لتعزيز العائد من البلدان المتوسطية الشريكة هي البذور خلايا وحيدة النواة في التركيز العالي. باستخدام إجراءات فصل مكونات الدم للحصول على البلازما والتعامل معها مع غلوكونات الكالسيوم يجعل من الممكن لتحقيق مصل ذاتي في كميات كبيرة. وقد لوحظ أن المصل البشري كمكمل المتوسط ​​يماثل الجنين مصل بقري (FBS) في الثقافات hMSC. ومع ذلك، في تجربتنا، والمتوسطة كاملة تستكمل مع FBS يساهم في الشيخوخة أسرع من مصل الكبار البشري. خطوة هامة هي أن المتمثلة في إدارة osteoinduction الحد الأدنى لhMSCs. في الواقع، وهذا العلاج يؤدي الخلايا التفريق بسهولة نحو النسب عظمي المنشأ، وبالتالي كونها مفيدة لتجنب المزيد من تحول الخلايا في الجسم الحي. للحفاظ على استمرارية جيدة من hMSCs osteoinduced الحد الأدنى، فمن المستحسن أن تتبع بدقة توصيات موضح في الخطوات 6.5. لد 8.2، بما في ذلك التعامل، الطرد المركزي وكميات متوسطة إلى أن تضاف. إذا كان الإجراء فصادة غير متوفر، فإنه لا يزال من الممكن تنفيذ هذا البروتوكول عن طريق أداء الدم عدة مرات توجه للمريض، أو في البديل، من خلال شراء المجمعة AB الأمصال. من الواضح، من أجل تحقيق هذا البروتوكول من السرير مقاعد البدلاء ل، وهو إلزامي لدينا مصانع خلية برنامج الرصد العالمي، أو ما يعادلها، والمتاحة. قيود على تطبيق هذه التقنية القلق فقر الدم، أمراض الدم، الأورام ومرضى العظام المتضررة من التهاب العظم والنقي.، رسم كميات كبيرة من الدم من مرضى فقر الدم، وينبغي تجنبها. في المرضى الذين يعانون الأورام، ونوعية العينات خلية تتأثر العلاج الكيماوي، بينما في المرضى الذين يعانون التهاب العظم والنقي العدوى يمكن أن تؤثر على النتيجة النهائية. في جميع الحالات التي يكون فيها المصل ذاتي غير كاف أو غير مناسب، ذكر المجمعة AB الأمصال تمثل بديلا جيدا. باستخدام خلية / الفيبرين اومهر يبني لالتطبيقات السريرية المحتملة هي حاسمة للافراج عن العلاج بالخلايا ذاتي تماما، والتي يمكن أن يكون من السهل التعامل معها والعفن أثناء الجراحة، مما أدى إلى نتائج ممتازة لعلاج العظام غير النقابات-13. لأغراض السريرية، وعادة ما تدار hMSCs عبر إجراءين رئيسيين: الحد الأدنى من التلاعب والتلاعب واسعة النطاق 9. للتغلب على المشاكل المتعلقة ثقافة واسعة خارج الجسم، مثل تشوهات في شكل الخلية وحجم 18، أجرينا وقت قصير فيفو السابقين توسيع الخلايا وأستيو تمايز (4 د فقط). بروتوكول خالية من XENO صفها في هذه الورقة، جنبا إلى جنب مع توسيع الخلية وosteodifferentiation أوقات قصيرة، أثبتت أن تكون ذات صلة في العيادات من أجل الحصول على إنتاج العظام سريع في الجسم الحي، دون وجود أدلة من فرط الأنسجة والتحول، مما يؤكد فعالية ومنذ فترة طويلة سلامة الاجل في إصلاح العظام (الشكل 5) </stroنانوغرام&gt; 13. وتهدف هذه المنهجية الواردة في هذا التقرير في مما يدل على فعالية وسلامة hMSC في توسيع المختبر في ظروف ذاتي لاستخدامها المحتمل في جراحة العظام. يستخدم هذا البروتوكول hMSCs معزولة عن نخاع العظام والمثقف في المتوسط ​​تستكمل مع مصل ذاتي وجزءا لا يتجزأ من جلطة الفيبرين ذاتي، وبالتالي ضمان العلاج بالخلايا ذاتي تماما. تحريض عظمي المنشأ شقين، قبل مفرزة الثانية، ويحسن hMSC القدرة على التمايز إلى خلايا بناء العظم. ونتيجة لذلك، فإن هذا الأسلوب هو مناسبة خاصة للتطبيقات في عيوب العظام، لأنه لا يقتصر على المفصل الموهم. يمكن أن تشمل التطبيقات المستقبلية المحتملة الكيس الكاحل وإدارة فقدان العظام.

<html> خلايا الإنسان الجذعية الوسيطة اللحمية (hMSCs) تمثل واحدة من أفضل مصادر الخلايا لاستخدامها في هندسة الأنسجة لتعزيز تكون العظم 1،2. يتم عزل أنهم بسهولة من نخاع العظام والأنسجة الكبار الآخرين، والتعبير عن علامات سطح نموذجية مثل CD90، CD105، CD73 1. وعلاوة على ذلك، فإنها يمكن أن تفرق في عدة أنواع الخلايا، مثل بانيات، غضروفية والخلايا الشحمية 3. وتعزى الآثار العلاجية لالتجدد وممتلكاتهم الغذائية (4). ويمكن استخدام hMSCs في جراحة العظام، وكذلك في التطبيقات السريرية التجدد أخرى. وقد تم الجمع بينها ويفضل مع السقالات، من أجل تحسين النتائج السريرية 5. بالمقارنة مع غيرها من المواد، ويظهر هلام الليفين العقارات المميزة مثل الإلتصاق، ارتشاف ونقل فعالة من المواد المغذية، مما يجعلها مفيدة للغاية لمجموعة متنوعة من التطبيقات هندسة الأنسجة 6،7. معشوقة = &quot;jove_content&quot;&gt; ويتمثل التحدي الرئيسي في ترجمة نهج هندسة الأنسجة في التطبيقات السريرية والحصول على سقالة بالكامل حيويا وBIOSAFE والمتوسطة ثقافة خالية من XENO أن يتجنب أي تأثير عدوى أو رد الفعل. في أسلوبنا، هلام الليفين، والمستمدة من دم المريض نفسه، ومصل ذاتي، لفي المختبر hMSCs الثقافة، كانوا يعملون كحل علاجي ممكن في مجال جراحة العظام 8. لأغراض السريرية، وتدار hMSCs عادة عن طريق إجراءين رئيسيين: (ط) &quot;خطوة واحدة&quot; الإجراء (أي الحد الأدنى التلاعب)، الذي يسمح للزرع السيارات من نخاع العظم، إما كليا أو مركزة (أي الخلايا وحيدات النوى)، أثناء الجراحة. و (ثانيا) &quot;خطوتين&quot; الإجراء (أي تلاعب واسع)، والتي تقوم على التوسع المجراة سابقا من hMSCs لزيادة انتاجها قبل الزرع، ويتطلب Gمرافق النائب 9. ومن المثير للاهتمام، زراعة الخلايا مع المصل الكبار البشري بدلا من مصل العجل البقري يسمح للانتعاش، جنبا إلى جنب مع hMSCs، من مجموعة فرعية من الخلايا (1-10٪ في الثقافات وحيدات النوى) تسمى خلايا أرومية متوسطة السلف (البلدان المتوسطية الشريكة)، قادرة على التمايز في المختبر إلى طازجة hMSCs 10،11. وبالتالي، قد hMPCs تلعب دورا هاما في عملية التجدد بالمقارنة مع hMSCs وحدها 12،13. وأخيرا، على المدى القصير أستيو الاستقراء يدفع hMSCs لبدء المفاضلة الخاصة بهم في النسب عظمي المنشأ دون أن تفقد التكاثري إمكاناتهم وقدرتها على البقاء 12. هذه النتائج تؤكد الدراسات السابقة التي أبلغت المعززة في تكوين العظام المجراة من قبل hMSCs، تليها preculture في المتوسط عظمي المنشأ 14. وعلاوة على ذلك، وهو تجلط البلازما ذاتي كما سقالة لتسليم خلية يمكن التلاعب بها بسهولة من قبل الجراح ومصبوب لتناسب شكل العظام تجويف 13. عشرerefore، يمكن أن يكون هذا الأسلوب مفيدا للغاية بالنسبة لأولئك الباحثين والأطباء الذين يهدفون إلى ترجمة علاجهم استنادا hMSC-من مقاعد البدلاء إلى السرير في تطبيقات العظام.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="920">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:235px;">Triple Select (1x)</td>
			<td style="width:301px;">GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td style="width:192px;">12563-029</td>
			<td style="width:193px;">cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypan blue stain&#160;</td>
			<td>GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>15250061</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM-LG, no glut, no phenol red</td>
			<td>GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>11880-028&#160;</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glutamax (100X)</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>35050038</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin Streptomycin sol.</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alamar Blue (AB)</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>DAL1025</td>
			<td>proliferation/viability assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-14440-02</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D-PBS&#160;</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">StemMACS AdipoDiff Media</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-091-677</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">StemMACS ChondroDiff Media</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-091-679</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">hMSC Osteogenicdiff BulletKit</td>
			<td>Euroclone&#160;</td>
			<td>LOPT3002</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vitamin C (ascorbic acid)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>ATC Code: A11GA01</td>
			<td>Pharmaceutical grade drug</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Flebocortid Richter (hydrocortisone)</td>
			<td>Aventis Pharma</td>
			<td>ATC Code: H02AB09</td>
			<td>Pharmaceutical grade drug</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Victor X3, reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2030 multilabel reader</td>
			<td>proliferation/viability assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Silver nitrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>209139</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pyrogallol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>16040</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Thiosulphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8503</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Histoplast LP</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>8332</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>32213</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2860</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nuclear fast red</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>60700</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formalin</td>
			<td>Bio-optica</td>
			<td>05-K01009-X40</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eosin B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>45260</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DPX</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>6522</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Haematoxylin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3136</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Aluminium Sulphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>202614</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xylol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>534056</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microtome</td>
			<td>Leika</td>
			<td></td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">May Grunwald</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>MG1L-1L</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Giemsa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>32884-250ML</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Transfer bag</td>
			<td>Biom&#233;rieux</td>
			<td>BC0300031</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filtration kit</td>
			<td>Macopharma</td>
			<td>BC0800010</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium Gluconate</td>
			<td>Galenica Senese</td>
			<td></td>
			<td>Pharmaceutical grade drug</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bact Alert</td>
			<td>Biom&#233;rieux</td>
			<td>259790 anaerobic&#160;</td>
			<td>microbiological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bact Alert</td>
			<td>Biom&#233;rieux</td>
			<td>259789 aerobic&#160;</td>
			<td>microbiological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Steryle Luer-Lok Syringe 50 ml</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>300865</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heraeus Cryofuge 6000i</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>blood bag centrifuging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SL16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>blood tube centrifuging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mesenchymal stromal cell culture and delivery in autologous conditions: a smart approach for orthopedic applications

الخلايا الجذعية الوسيطة اللحمية الإنسان (hMSCs) يتم تربيتها في المختبر مع وسائل الإعلام المختلفة. قيود على استخدامها في المرافق الصحية، ومع ذلك، تعتمد أساسا على مخاطر بيولوجية والتهاب محتملة من قبل العناصر الغذائية xenogeneic لثقافتهم المبذولة. المشتقات الإنسان أو مواد المؤتلفة هي المرشحين الخيار الأول للحد من هذه التفاعلات. لذلك، وملاحق والمواد من أصل ذاتي الثقافة تمثل أفضل المواد الغذائية والمنتجات الأكثر أمانا. هنا، نحن تصف بروتوكول جديد للعزلة وثقافة hMSCs نخاع العظام في ظروف ذاتي - أي مصل المستمدة من المريض بمثابة تكملة لمستنبت والفيبرين بمثابة سقالة لإدارة hMSC. في الواقع، يمكن أن يكون hMSC بنيات / الفيبرين تجلط مفيد للغاية في العديد من التطبيقات السريرية. على وجه الخصوص، ونحن نركز على استخدامها في جراحة العظام، حيث جلطة الفيبرين المشتقة من الدم المتبرع نفسه سمحتتسليم خلية فعالة والمغذيات / النفايات التبادلات. لضمان شروط السلامة المثلى، فإنه من الأهمية بمكان لتجنب مخاطر hMSC التحول وفرط الأنسجة. لهذه الأسباب، فإن النهج الوارد وصفها في هذه الورقة يشير أيضا خارج الحي hMSC التوسع الحد الأدنى، للحد من الشيخوخة الخلوية والتغييرات الشكلية، وعلى المدى القصير أستيو تمايز قبل الزرع، للحث على مواصفات النسب المكونة للعظم، مما يخفض من خطر الإصابة اللاحقة غير المنضبط تكاثر.

إعداد مصل ذاتي البلازما تجلط الدم، التي يؤديها مضيفا غلوكونات الكالسيوم لحقيبة النقل، يسمح للانتعاش من مصل ذاتي بكميات كبيرة، كما هو مطلوب للثقافة hMSC. في الواقع، مع هذه التقنية، فمن الممكن لتحقيق ما يصل إلى 200 مل من مصل الدم (الشكل 1). HMSC العزلة والثقافة والتمايز باستخدام مصل ذاتي يتم عزل العظم خلايا نخاع وحيدات النوى باستخدام التدرج الكثافة، والذي يؤدي إلى طبقة حلقة وسيطة (الشكل 2A). بواسطة طلاء هذه الخلايا وإزالة تلك غير ملتصق مع الغسيل، فمن الممكن لعزل hMSCs (الشكل 2B). في ظل ظروف ثقافة ذاتي، تم الكشف عن مجموعة فرعية من الخلايا، ودعا البلدان المتوسطية الشريكة، في P0 وبنسب تصل ر<html> س 10٪، حسب تقلب المريض (الشكل 2B). البلدان المتوسطية الشريكة لا تزال موجودة بعد replating (أي P1) إذا تم استخدام البروتيني للخلية الركض (الشكل 2C). hMSCs معزولة ومثقف في جو ذاتي الحفاظ على قدرتها على تمييز تجاه الأنساب أرومية متوسطة معروفة ثلاثة (المكونة للعظم، مكون الشحم، ومكون للغضروف). وأجريت فحوصات التمايز مقارنة هوية السكان hMSC مع تلك التي تم الحصول عليها باستخدام معيار (nonautologous) الظروف والثقافة. كما تم اختيار وظيفة المقايسات لهذا البروتوكول، فون كوسا تلطيخ، الأوسيميوم رباعي أكسيد تلطيخ، وتلطيخ الألسيان الأزرق في درجة الحموضة 1 بدلا من تلك المقترحة من قبل الشركة المصنعة وسائل الإعلام التمايز (انظر الجدول المواد) (الشكل 2D). إعداد، والسلامة وتوصيف نسيجية من MSC / الليفين يبني تجلط <html> together.within الصفحات = &quot;1&quot;&gt; وفرقت hMSCs في البلازما، وهو عبر ربط بواسطة غلوكونات الكالسيوم في أنبوب 50 مل، مما يؤدي إلى تشكيل القرص هلام محاطة طاف بها (الشكل 3A). داخل هذه الجلطات البلازما، وhMSCs قابلة للبقاء، كما يدل على ذلك تغيير لون الصبغة T24 بقاء الخلية من الزرقاء (السيطرة من دون الخلايا) إلى الوردي (جلطة cellularized) (الشكل 3B). ويؤكد بقاء الخلية داخل الجلطة عن طريق تلطيخ H &amp; E، مما يدل على خلية التشكل الحفاظ عليها جيدا (الشكل 3C). علاوة على ذلك، osteoinduction الحد الأدنى فقط قبل موسم الحصاد خلية الثاني يثير ترسب الكالسيوم الأولي التي كتبها hMSCs حفز (الشكل 3D). وحدة تشكيل مستعمرة ويظهر وجود المستعمرات hMSC بعد 2 أسابيع في الثقافة عن طريق فحص كفو-F (الشكل 4). <html> الصورة = &quot;jove_step&quot; FO: المحافظة على together.within الصفحات = &quot;1&quot;&gt; تطبيق MSC / تجلط الليفين بناء في غير الاتحاد العظام طبقت يبني HMSC / الفيبرين الجلطة التي تم الحصول عليها كما هو موضح في هذه الطريقة (الخطوة 1.1) بنجاح لعلاج شديدة nonunions الطرف العلوي في 8 حالات إنسانية (13). على المدى الطويل (بحد أقصى 7.6 أشهر) تقييم أكدت النتائج السريرية وظيفية ناجحة لجميع المرضى، دون وجود أدلة من فرط الأنسجة أو تشكيل الورم. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54845/54845fig1.jpg" /> الشكل 1. إعداد ذاتي المصل. ونقلت (A) وحدة بلازما في كيس النقل باستخدام مسمار. (ب) ومتخثر البلازما عن طريق حقن غلوكونات الكالسيوم من خلال موصل منفذ. يستخدم (ج) وأجهزة الطرد المركزي الدم حقيبة لفصل المصل./files/ftp_upload/54845/54845fig1large.jpg &quot;الهدف =&quot; _ فارغة &quot;&gt; الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54845/54845fig2.jpg" /> الشكل 2. hMSC العزلة والثقافة والتمايز باستخدام ذاتي المصل. (A) وطبقة الخلايا وحيدة النواة (في إطار الخط الأزرق) تم الحصول عليها بعد نخاع العظام الطرد المركزي مع التدرج الكثافة. (ب) زراعة الخلايا كما يظهر في P1. (ج) خلية ثقافة كما يظهر في P0 (ثقافة الأولية)؛ (B - C) السهام تبين وجود البلدان المتوسطية الشريكة في الثقافة MSC. شريط المقياس هو 100 ميكرون. (D) عن نتائج هستوكيميائيه من المقايسات التمايز multilineage. يظهر التمايز المكونة للعظم وتقييمها باستخدام فون كوسا تلطيخ لترسب مصفوفة المعدنية في الأسود، والتمايز مكون الشحم التي كتبها جود فجوات الدهنية، ملطخة باللون الأسود من قبل tetroxi الأوسيميوميتم عرض دي، والتمايز المولدة للغضروف من خلال وجود الجليكوسامينوجليكان مكبرت، التي هي ملطخة في السماوي من تلطيخ الأزرق الألسيان في درجة الحموضة 1. مقياس شريط 50 ميكرون. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54845/54845fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/54845/54845fig3.jpg" /> الشكل 3. إعداد والجدوى ونسيجية توصيف MSC / الفيبرين الجلطة التركيبات. (أ) hMSC / تجلط الليفين بناء كما يبدو بعد عبر ربط. (ب) نتائج AB الفحص: في اللجان الدائمة قابلة للحياة داخل جلطة الفيبرين، كما يدل على ذلك تغيير لون الصبغة بقاء الخلية (T24)، من الأزرق (السيطرة من دون الخلايا، على اليمين) إلى الوردي (جلطة cellularized، على اليسار). (C - D) النتائج هستوكيميائيه من hMSC / الليفين يبني تجلط. شريط المقياس هو<html> 50 ميكرون. (C) الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ تظهر خلايا قابلة للحياة جزءا لا يتجزأ من مصفوفة الفيبرين. (D) المصفوفة المعدنية ترسب ملطخة باللون الأسود بواسطة فون كوسا تلطيخ، مما يؤكد على تكون العظم الأولي. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54845/54845fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/54845/54845fig4.jpg" /> الرقم 4. كفو-F الفحص. صورة لقارورة مثقف مع hMSCs الملون بطريقة مايو جرونوالد / بالغيمزا. منطقة التكبير في على بعد مجهرية ضوئية تبين مورفولوجية مستعمرة hMSC. شريط المقياس هو 100 ميكرون. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54845/54845fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> = &quot;1&quot;&gt; <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/54845/54845fig5.jpg" /> الشكل 5. تطبيق hMSC / الفيبرين الجلطة بناء في العظام غير النقابيين. (أ) الأشعة السينية من الطرف العلوي للمريض يتأثر المفصل الموهم. (ب) hMSC / تجلط الليفين بناء قبل الزرع. (ج) تطبيق الجراحي للتجلط بناء hMSC / الفيبرين. (D) الأشعة السينية من الطرف العلوي من نفس المريض بعد 5 سنوات. ونشر هذا الرقم من Giannotti S. وآخرون. مع الحد الأدنى من التعديلات 13. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54845/54845fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Mesenchymal Stromal Cell Culture and Delivery in Autologous Conditions: A Smart Approach for Orthopedic Applications at JoVE.com

Mesenchymal Stromal Cell Culture and Delivery in Autologous Conditions: A Smart Approach for Orthopedic Applications

زراعة الخلايا الجذعية الوسيطة اللحمية الإنسان (hMSCs) مع مصل ذاتي، ويقلل من مخاطر رفض المواد xenogeneic والآثار السلبية الأخرى. كما يسمح لاسترداد مجموعة فرعية من الأسلاف أرومية متوسطة، الذي يمكن أن يحقق hMSCs جديدة. تضمين hMSCs في تجلط الليفين ذاتي يتيح سهولة التعامل وغرس الجراحي الفعال.

الوسيطة اللحمية خلية الثقافة و التوصيل في حالة ذاتي: مقاربة ذكية لتطبيقات العظام

Human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) are cultured in vitro with different media. Limits on their use in clinical settings, however, mainly depend on ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Autologous Endothelial Progenitor Cell-Seeding Technology and Biocompatibility Testing For Cardiovascular Devices in Large Animal Model

غشائي ذاتي السلف الخلوي البذر التكنولوجيا واختبار توافق مع الحياة للحصول على أجهزة القلب والأوعية الدموية في نموذج حيواني كبير

Implantable cardiovascular devices are manufactured from artificial materials (e.g. titanium (Ti), expanded polytetrafluoroethylene), which pose the risk ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

نظم الدورية الثقافة خلية خلية للثقافة الإنسان : خلايا الأرومة الغاذية الإنسان نموذجا

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

إعداد الفايبرين 3D السقالات لتطبيقات الجذعية زراعة الخلايا

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

الجلد الوشم ونهجا جديدا للتسليم اللقاحات DNA

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

سقالات الإبلاغ الذاتي للخلية ثقافة 3 الأبعاد

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

A منصة رواية تمتد للتطبيقات في الخلايا والأنسجة Mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

تشكيل الضوء بوساطة والزخرفة من الهلاميات المائية للتطبيقات خلية ثقافة

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

تطبيقات تصنيع وتسليم المخدرات من النانوية الحرير

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

تحسين 3D المائية الثقافات من الخلايا الدبقية الأولية لنمذجة في المختبر نيوروينفلاميشن

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

بناء ورقة الطبقات الوسيطة من الخلايا الجذعية مع نظام 3D دينامية الثقافة

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...