Name: mesenchymal stromal cell culture and delivery in autologous conditions: a smart approach for orthopedic applications
Uploaded: 2016-12-08T15:00:00
Duration: 10 min 30 s
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This study was funded by the Tuscany Region (grant number 539999_2014_Petrini_CUCCS). The authors would like to thank Prof. S. Berrettini for authorizing the use of the Otolab laboratory and instruments, and the surgery staff from the Orthopedic Clinic II of the University of Pisa, for the fundamental cooperation in sample harvesting. The support provided by Dr. F. Scatena is gratefully acknowledged. Finally, many thanks are due to Mr. J.G. De La Ossa for his precious contribution to histologic processing.

現在のプロトコルは、人間が関与する研究の倫理に関するヘルシンキの世界医師会の宣言に基づいて開発されました。これは、AziendaメールOspedaliero-Universitàriaにピサーナの倫理委員会によって承認されました。 注意： 骨髄は、15（ステップ1.1に記載の）ルーチン股関節全置換術を受けた患者から入手しました。血餅を調製するためのプラズマは、自己末梢血13から得られました。自己血清は、培養培地のためのサプリメントとして、自己全血アフェレーシスから収集しました。すべての患者は、手順に関する詳細な情報を受信し、書面による同意書に署名しました。 骨髄試料の1コレクション<ol><li> （調査研究のための）人工股関節全置換手術後に大腿骨髄管から骨髄を収集します。 hまで髄管の外科的準備中に簡単に説明すると、（ -人工器官の大きさに応じて15 mLを、約10）15を補綴ステムをウーズ、オーバーフロー骨髄血を集めます。 OR </li><li> （臨床応用のために）事前に30 D 16から20程度の標準的な血液学的手順に従って、局所麻酔下での腸骨稜から骨髄吸引液を収集します。 注：両方の場合において（血餅形成を防止する）ヘパリン処理シリンジは、骨髄回復のために使用されなければなりません。 </li></ol>自己血漿の調製<ol><li> 15分間、2400×gでK3 EDTA（3 mLチューブで5.4 mg）を、遠心分離を含む真空採血管で患者からの末梢血20mLのを収集します。 </li><li> 15 mLチューブ中の血漿成分を吸引し、使用まで-20℃で凍結します。 </li></ol>自己血清の調製<ol><li>スパイクを使用して転送バッグにプラズマの単位を転送します。溶接とweigによって満たされた袋を外します血漿（ 図1A）の体積を計算する時間のバッグ。 </li><li>ポートコネクタ（ 図1B）を介しw / vの 10％で100ミリグラム/ mLのグルコン酸カルシウムを注入することにより自己血漿を凝固。袋を混合した後、血栓形成を促進するために、振とうせずに4°CO / Nでそれを配置します。 </li><li> RTで15分間、4900×gでバッグを遠心分離します。遠心分離機のうち、遠心分離バケツを取り、慎重に袋を取り外します（血小板溶解物の調製のために、製造元のガイドラインに従ってください）（ 図1C）。 </li><li>ろ過を容易にするためだけでクランプの上に凝血塊を分離します。ろ過キットの出口ポートに配置されたスパイクを使用して転送バッグにろ過キットを接続します。 </li><li>バッグを掛けると、重力によって血清の流れをできるように、青色クランプを開きます。袋にフィブリンの転送を回避するために、フィルタに圧力をかけないでください。濾過後、チューブを密封し、バッグを削除（manufacに従ってください血小板溶解物の調製のための造業者のガイドライン）。 </li><li>微生物汚染を避けるために層流ベンチ下、50 mLの試験管に最終バッグや転送血清に専用回線を接続します。 </li><li>フィブリノゲンが存在しないことをテストし、好気性と嫌気性細菌培養物17のための無菌試験を行うためにシリンジでサンプルを取ります。適切チューブにラベルを付け、でそれらを凍結 - 20°Cまで使用。 </li></ol>拡張中の4準備<ol><li>完全増殖培地の500ミリリットルを準備します。ダルベッコ改変イーグル培地に - 低グルコース（DMEM-LG）、（セクション3で説明したようにして得られた）10％自己血清、2mMグルタミン、1％抗生物質溶液と1％の抗真菌剤溶液を添加します。滅菌フィルタの完全増殖培地。 </li></ol>骨髄からのhMSCの5の単離<ol><li> 50 mLコニカルTUシリンジから - （10 mLの5）骨髄サンプルを移しよく、滅菌生理食塩水でそれを希釈（比1：4）。 30秒は、細胞塊を脱凝集するための50 mLチューブをボルテックス。 </li><li>密度の15 mLにサンプルを20mLを加えることによって、使用前に室温に、静かに希釈された骨髄を層（両層を混合を防ぐために）密度勾配上に、密度勾配（ 材料の表を参照してください密度1.077グラム/ L）を温めます各50 mLチューブ用の勾配（ 図2A）。 </li><li> 30分間25℃でブレーキなしで400×gで遠心分離し、液 - 液界面での単核画分を回収し、滅菌5mLのピペットを使用して、新しい50 mLチューブに移します。 </li><li>完全増殖培地で2回採取し、単核画分を洗浄し、細胞ペレットを得るために、25℃で10分間、400×gでチューブを遠心します。 </li><li>上清を捨て、軽く完全増殖培地5mLに、各細胞ペレットを再懸濁します。細胞計数のために100：1の比率で希釈します。 </li><li>細胞生存率を評価するためにトリパンブルー染色で1希釈：1の後に血球計数器を用いて細胞を数えます。 </li></ol>自家血清の存在下でのhMSCの6.文化<ol><li>二つ以上の75cm 2の組織培養（TC）を満たす使用するまでCO 2新鮮な完全増殖培地の15 mLのフラスコ、37℃で細胞培養インキュベーターに転送し、5％。 </li><li>シード0.3 &#160; - X 10 0.5 6細胞/ cm 2（37.5×10 6細胞/新鮮な完全増殖培地の15 mL）中、37℃でインキュベートし、5％CO 2で48時間インキュベートしました。 </li><li>同時に、コロニー形成単位のための新鮮な完全増殖培地5mlで25cm 2のTCフラスコ中の種子1×10 6細胞-線維芽細胞（CFU-F）アッセイ。 2週間の培養は、（セクション12で継続されます）。 </li><li>培地を捨て、軽くレムへの完全増殖培地でステップ6.2からフラスコを洗います非付着細胞および破片をOVE。フラスコに新鮮な培地を追加し、70まで、1週間に2回、それの半分を交換- 80％の集密度（初代培養、継代0（P0））（ 図2B）。 </li><li> 10分間、37℃でインキュベートし、5％CO 2、特定の組換え動物無料のプロテアーゼを使用して細胞を回収（製造業者により推奨されるように、フラスコあたり3mLの溶液を使用する材料の表を参照してください）。フラスコ当たりの完全増殖培地6 mLと1 50mLのチューブに収集します。繰り返し手順5.6。 注：重要：代わりに、トリプシンのこのプロテアーゼの使用が耐性トリプシンされ、培養物中に存在するいくつかの中胚葉前駆細胞の細胞（MPCは）、の回収を可能にします。 </li><li>新しい75cm 2のTCフラスコ（P1）中/ cm 2と（ 図2C）3000細胞-さらなる拡大のため、2000で細胞懸濁液をreplate。 </li><li> MSCの分化能を評価するために、細胞のアリコートを使用し骨形成、脂肪生成および軟骨形成系列に向けて。メーカーの推奨（ 図2D）は、次の分化アッセイを行います。 注：異なる染色方法は、多分化を評価するために使用することができます。 </li></ol>製薬サプリメントと骨形成培地の7の準備<ol><li>アスコルビン酸溶液（希釈溶液1A：アスコルビン酸を200mg / mlの（）は、20ミリグラム/ mL溶液（溶液1Bを得るために、DMEM-LGでの作業溶液を材料表 ）1:10参照溶液1Aのストックのアリコートおよび使用するまで-20℃で1B。 </li><li>滅菌水10mLで再懸濁1グラムのヒドロコルチゾン（解決策2A：ヒドロコルチゾン100 mg / mlで（ 材料の表を参照してください）希薄溶液2A 1：千DMEM-LGと100μg/ mLの溶液を得（解決策2B、作業溶液）。使用まで-20℃でのソリューション2A、2Bの株価アリコート。 </li><li>使用目的Pの際次のように新鮮な骨形成培地をrepare：10％自己血清、50μg/ mlのアスコルビン酸および0.4μgの/ mLのヒドロコルチゾンを含むDMEM-LGを追加します。滅菌フィルター骨形成培地。 </li></ol> 8.骨形成誘導前とのhMSCの回復<ol><li>完全増殖培地を除去し、細胞収穫前に骨形成培地96時間を追加する（ すなわち、百分の80から90までの集密度は、通常7（d）に達しました）。追加の骨形成培地変化を細胞収穫前に24時間を提供します。 </li><li>ステップ6.5で説明した、軽く50 mLの試験管に完全増殖培地2mlを追加するペレットを再懸濁として細胞を切り離します。 注：細胞生存率は、骨誘導の結果（約10％）減少させることができます。細胞凝集体を観察することができます。 </li><li>カウントした後、5分間300×gで、完全増殖培地と遠心で細胞を洗浄。 2×10 6生細胞/ 2から1に静かにペレットを再懸濁自己血漿のmLを50 mLチューブあたり（セクション2を参照します）。 </li></ol> hMSC /フィブリンクロット構築物の9準備<ol><li>ステップ8.3から得られた各50mLのチューブに100ミリグラム/ mLでグルコン酸カルシウムの150μLを加えます。そして、穏やかに振盪下で細胞を再懸濁。 </li><li> （ 図3A）のhMSC /フィブリン塊構築物を得るために30分- 15 37℃で細胞を、5％CO 2でインキュベートします。対照として使用する細胞を含まないフィブリン塊構築物を調製します。 注：重要：架橋する30分以上を要するように、細胞生存率アッセイの前に、この制御血餅少なくとも2時間を調製することが推奨されます。 </li></ol> 10.細胞生存率アッセイ<ol><li> 50 mLチューブから液体を除去し、10％（v / v）の細胞生存率の試薬を含む完全増殖培地の1 mLを加え（ABを、 材料の表を参照）、製造業者のガイドラインに従って。 </li><li>目をインキュベート3時間37℃、5％CO 2でEチューブ。 （時間0でAB; T0）600nmでの参照波長570 nmの吸光度を測定します。 </li><li>上清を捨て、新鮮な完全増殖培地2mlを追加します。 37℃、5％CO 2、O / Nでインキュベートします。次の日（AB時で24時間; T24）は、リピートは10.3（ 図3B）に10.1を繰り返します。 </li></ol>フィブリンクロット構築内部の細胞生存率およびカルシウム沈着の11組織学的評価<ol><li> 4°Cでのw / vの中性緩衝ホルマリンO / N 4％のhMSC /フィブリン塊の構造を修正しました。 70％エタノール中で15分間、店舗用のD-PBSで洗浄4倍。 </li><li> 45分間、二回30分間に一度、80％、95％、1時間に100％を3倍：段階的エタノールシリーズで、40℃でサンプルを脱水します。 40℃で45分間、キシレンで二度明確にします。 </li><li> 2時間、60℃で液体パラフィン中にサンプルを洗浄し、それらを組み込みます。トンミクロトームでパラフィンブロックをカットし、マウントガラススライド上の彼のセクション（5ミクロン）。 </li><li>標準的なヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）法（ 図3C）を使用して脱パラフィン化セクションを染色します。 </li><li> 2分間0.5％ピロガロール、15分間、1％硝酸銀で切片を処理することにより、フォン・コッサ染色を行い、そして2分間5％チオ硫酸ナトリウム。 5分間5gの硫酸アルミニウムを含有する溶液中で希釈した0.1％核ファーストレッドで切片を対比染色し、5分間水道水でそれらをすすぎます。封入剤でセクションをマウントします。 </li><li>光顕微鏡（400X倍率）（ 図3D）の下に黒い顆粒などのミネラル沈着を評価します。 </li></ol> 12. CFU-Fアッセイ<ol><li> D-PBSで（ステップ6.3から）25cm 2のフラスコを洗います。標準メイグリュンワルド/ギムザ法を用いて染色します。視覚的、光学顕微鏡下で個々のコロニー（ 図4）をスコアリングすることによりhMSCの数を定量化します。 注：もし骨髄は、ステップ1.2と同様に行われます。そして、セクション2から9までは、必要な規制当局の承認を得て適正製造基準（GMP）で行われ、hMSCの/フィブリン塊構築物は、整形外科用途のために移植することができます。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。

このプロトコルの懸念の重要なステップBIOSAFE hMSCの治療を得ることを可能にするヒト成人血清およびプロテアーゼの使用。プロテアーゼはのMPCの、収穫を確保しながら、具体的には、ヒト成人血清は、単離および保守を可能にします。従って、これらは、培養時間に沿って実行可能なのhMSCの貯水池を確保し、新鮮なのhMSCを生じさせることができ、骨髄に存在する未成熟な細胞です。プロテアーゼ活性に露出時間を増加させることのhMSCの生存度に有害であるので、全てのMPCは、回収することができます。この理由のために、10分間プロテアーゼインキュベーションのMPCの回復とのhMSCの生存率との間の最適な妥協点として選択しました。もう一つの重要なステップは、osteodifferentiation時間です。実際、 インビトロ osteodifferentiation で広範囲にかなり従って、インビボでの最終的な骨形成に影響を与え、細胞の生存率を減少させるであろう。最後の重要なステップは、自己の生体吸収性スキャフォールドの役に立つで構成され、whichは血漿凝固からフィブリンゲル中の細胞（hMSCがとのMPC）を埋め込むことにより得られます。 MPCの収量を高めるための重要なステップは、高濃度で単核細胞を播種するためです。プラズマを得るためにアフェレーシス手順を使用し、グルコン酸カルシウムで処理することにより、大量に自己血清を実現することができます。培地補充ヒト血清のhMSC培養においてウシ胎児血清（FBS）に匹敵することが観察されました。しかし、我々の経験では、FBSを補充した完全培地は、ヒト成人血清よりも早く老化に貢献しています。重要なステップは、hMSCのに最小限の骨誘導を投与することです。実際、この治療法は、このように、in vivoでさらに細胞形質転換を回避するのに有用である、簡単に骨形成系列に分化する細胞をリードしています。最小限osteoinducedたhMSCの良好な生存率を維持するためには、慎重にステップ6.5で説明した推奨事項に従うことをお勧めします。 AND 8.2。、ハンドリング、遠心分離し、培地量を含めて追加します。アフェレーシス手順が利用できない場合、それをプールAB血清を購入することによって、代替的に、患者に描画または複数の血液を実行することによって、このプロトコルを実行することが可能です。明らかに、ベンチツーベッドサイドからこのプロトコルをもたらすために、利用可能、GMPの細胞工場、または同等物を持つことが必須です。 骨髄炎の影響を受け、この技術の懸念貧血、血液学、腫瘍学および整形外科の患者のアプリケーションに制限。、貧血患者から血液を大量に描画は、避けるべきです。骨髄炎患者における感染は、最終結果に影響を与えることができ、一方、腫瘍学的患者において、細胞サンプルの品質は、化学療法によって影響されます。自己血清が不十分または不適切であるすべての場合において、プールされた男性AB血清は良い代替手段を表します。 細胞/フィブリンCLOを使用して、可能な臨床応用のためのトン構築物は、骨の非組合13を治療するための優れた成果が得られ、手術中の取り扱いやカビやすい可能性が完全に自己細胞療法を、解放することが重要です。最小限の操作と豊富な操作9：臨床目的のために、hMSCは、通常、二つの主な手順を介して投与されています。このような細胞形態およびサイズ18の異常などの大規模なex vivoでの文化に関連する問題を克服するために、我々は短時間ex vivoでの細胞の増殖および骨分化（わずか4 d）を行いました。 実証ショートセルの拡大とosteodifferentiation回と一緒に、本論文で述べた異種非含有プロトコルは、組織の異常増殖および形質転換の証拠なしに、in vivoでの高速骨生産を得るために診療所で関連性があると、このように確認し、その有効性と長いです骨の修復における-term安全性（図5） </stroNG&gt; 13。 このレポートに表示される方法論は、整形外科手術で可能な使用のための自己の条件in vitroでの増殖中のhMSCの有効性と安全性を実証することを目的としています。このプロトコルは、媒体自己血清を補充し、したがって、完全に自己由来細胞療法を確実に、自己フィブリン塊に埋め込ま骨髄培養から単離されたhMSCを用います。 2倍の骨形成誘導は、ちょうど第二剥離する前に、骨芽細胞に分化するhMSCの能力を向上させます。それは偽関節に限定されるものではないので、結果として、この技術は、骨欠損への応用に特に適しています。可能な将来のアプリケーションは、距骨の嚢胞および骨損失管理を必要とする可能性があります。

ヒト間葉系間質細胞（hMSCが）は、骨形成1,2を促進するための組織工学に使用するための最良のセルソースのいずれかを表します。彼らは簡単に骨髄および他の成体組織から単離し、そのようなCD90、CD105、CD73 1のような典型的な表面マーカーを発現しています。さらに、それらは、骨芽細胞、軟骨細胞および脂肪細胞3などのいくつかの細胞型に分化することができます。その治療効果は、その回生と栄養特性4に起因しています。 hMSCは、整形外科手術中だけでなく、他の回生臨床応用で使用することができます。それらは、好ましくは、臨床転帰5を改善するために、足場と組み合わされます。 他の材料に比べて、フィブリンゲルは、組織工学アプリケーション6,7の様々な、それは非常に有用なものにするような接着性、再吸収と栄養素の効率的な輸送など興味深い特性を示しています。 私たちの患者自身の血液由来方法、フィブリンゲル、および自己血清では、in vitroでのhMSC培養のために、整形外科分野8で可能な治療ソリューションとして採用されました。 臨床目的のために、hMSCは、通常、二つの主な手続きを経て投与される：（I）のいずれかまたは全部（ すなわち 、単核細胞）を濃縮、骨髄の自動移植を可能にする「ワンステップ」の手順（ すなわち 、最小限の操作）、手術中;および（ii）「二段階」の手順（ すなわち、大規模な操作）、移植前に彼らの収量を増加させるためのhMSCのex vivoでの拡大に基づいて、およびGを必要としていますMP施設9。新鮮にin vitroで分化できる、 - （単核球培養中の10％1）と呼ばれる中胚葉前駆細胞（MPCは）興味深いことに、代わりにウシ胎児血清のヒト成人血清で培養した細胞は、細胞のサブセットで、一緒にしたhMSCで、回収を可能にしますhMSCは10,11。したがって、hMPCsは、hMSCを単独12,13と比較した場合、再生過程において重要な役割を果たし得ます。最後に、短期的な骨誘導は、その増殖能を失うと12の生存率をせずに骨形成系列への分化を開始するためのhMSCをプッシュします。これらの結果は、骨形成培地14で予備培養に続いたhMSC、ことにより、in vivo骨形成を高め報告した以前の研究を確認します。また、細胞送達のための足場としての自己血漿凝固を容易に外科医によって操作および骨キャビティ13の形状に適合するように成形することができます。 目erefore、この方法は、整形外科用途で枕元にベンチから自分のhMSCに基づく治療を翻訳することを目指したもの研究者や臨床医のために非常に役立ちます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="920">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:235px;">Triple Select (1x)</td>
			<td style="width:301px;">GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td style="width:192px;">12563-029</td>
			<td style="width:193px;">cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypan blue stain&#160;</td>
			<td>GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>15250061</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM-LG, no glut, no phenol red</td>
			<td>GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>11880-028&#160;</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glutamax (100X)</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>35050038</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin Streptomycin sol.</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alamar Blue (AB)</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>DAL1025</td>
			<td>proliferation/viability assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-14440-02</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D-PBS&#160;</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">StemMACS AdipoDiff Media</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-091-677</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">StemMACS ChondroDiff Media</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-091-679</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">hMSC Osteogenicdiff BulletKit</td>
			<td>Euroclone&#160;</td>
			<td>LOPT3002</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vitamin C (ascorbic acid)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>ATC Code: A11GA01</td>
			<td>Pharmaceutical grade drug</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Flebocortid Richter (hydrocortisone)</td>
			<td>Aventis Pharma</td>
			<td>ATC Code: H02AB09</td>
			<td>Pharmaceutical grade drug</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Victor X3, reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2030 multilabel reader</td>
			<td>proliferation/viability assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Silver nitrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>209139</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pyrogallol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>16040</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Thiosulphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8503</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Histoplast LP</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>8332</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>32213</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2860</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nuclear fast red</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>60700</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formalin</td>
			<td>Bio-optica</td>
			<td>05-K01009-X40</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eosin B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>45260</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DPX</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>6522</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Haematoxylin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3136</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Aluminium Sulphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>202614</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xylol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>534056</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microtome</td>
			<td>Leika</td>
			<td></td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">May Grunwald</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>MG1L-1L</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Giemsa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>32884-250ML</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Transfer bag</td>
			<td>Biom&#233;rieux</td>
			<td>BC0300031</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filtration kit</td>
			<td>Macopharma</td>
			<td>BC0800010</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium Gluconate</td>
			<td>Galenica Senese</td>
			<td></td>
			<td>Pharmaceutical grade drug</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bact Alert</td>
			<td>Biom&#233;rieux</td>
			<td>259790 anaerobic&#160;</td>
			<td>microbiological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bact Alert</td>
			<td>Biom&#233;rieux</td>
			<td>259789 aerobic&#160;</td>
			<td>microbiological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Steryle Luer-Lok Syringe 50 ml</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>300865</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heraeus Cryofuge 6000i</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>blood bag centrifuging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SL16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>blood tube centrifuging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mesenchymal stromal cell culture and delivery in autologous conditions: a smart approach for orthopedic applications

ヒト間葉系幹細胞（hMSCが）は、異なるメディアを用いたin vitroで培養されます。臨床現場での使用の制限は、しかし、主に彼らの文化のための異種の栄養素によって発揮される潜在的なバイオハザードや炎症のリスクに依存します。ヒト誘導体または組換え物質は、これらの反応を低減するための最初の選択肢の候補です。そのため、自家由来の培養サプリメントや材料は最高の栄養と最も安全な製品を表します。 ここでは、自己の条件で分離し、骨髄のhMSCの培養のための新しいプロトコルを記述 - すなわち、患者由来の血清をしたhMSCの投与のための足場として、培養培地およびフィブリンのためのサプリメントとして。確かに、のhMSC /フィブリン塊構築物は、いくつかの臨床応用のために非常に有用である可能性があります。特に、我々は、ドナー自身の血液由来フィブリン塊が許可された整形外科手術での使用に焦点を当て効果的な細胞送達および栄養/廃棄物交換。最適な安全条件を確保するためには、hMSCの形質転換および組織の異常増殖の危険性を避けるために最も重要です。これらの理由から、このホワイトペーパーで説明するアプローチは、このように、後続の制御不能のリスクを減少、骨形成系列の仕様を誘導するために、移植前に細胞老化および形態学的変化、および短期の骨分化を低減するために、最小限のex vivoでのhMSCの拡大を示し、増殖。

自己血清の調製 hMSCの培養に必要な転送バッグにグルコン酸カルシウムを添加することにより実施血漿凝固は、大量に自己血清の回収を可能にします。実際、この手法では、血清中の200mLの（ 図1）まで達成することが可能です。 自己血清を用いたHMSCの分離、培養及び分化骨髄単核細胞を、中間リング層（ 図2A）を生じる密度勾配を使用して単離されます。これらの細胞をプレーティングし、洗浄して非接着性のものを除去することにより、hMSCが（ 図2B）を単離することが可能です。自家培養条件下でのMPCと呼ばれる細胞のサブセットは、P0であり、tまでパーセントで検出され患者の変動（ 図2B）に応じて、10％O。プロテアーゼは、細胞継代（ 図2C）のために使用される場合のMPC（ すなわち、P1）に再播種した後、まだ存在しています。自家設定で単離し、培養したhMSCは、3よく知られている中胚葉系統（骨形成、脂肪生成、および軟骨形成）に分化する能力を維持します。分化アッセイは、標準（非自己）培養条件を用いて得られたものとのhMSC集団の同一性を比較するために行きました。このプロトコルの機能アッセイとしては、フォン・コッサ染色、四酸化オスミウム染色、およびpH 1でのアルシアンブルー染色は、（ 材料の表を参照）（ 図2D）分化培地メーカーによって示唆されるものの代わりに選ばれました。 MSC /フィブリン塊の構築物の調製、生存率および組織学的特性評価図3A）で囲まれたゼリーディスクの形成につながる、50 mLチューブにグルコン酸カルシウムにより架橋されたプラズマ中に分散されています。これらのプラズマの塊の内部に、hMSCはは（細胞化血塊）（ 図3B）をピンク色に青（細胞を含まない対照）からの細胞生存率染料T24の色の変化によって示されるように、生存可能です。血餅内部の細胞生存率は、よく保存された細胞の形態（ 図3C）を示し、H＆E染色によって確認されます。また、ちょうど第二の細胞収穫前の最小限の骨誘導を刺激したhMSC（ 図3D）による予備カルシウム沈着を生じさせます。 コロニー形成単位培養2週間後のhMSCのコロニーの存在は、CFU-Fアッセイ（ 図4）によって示されています。 S = &quot;jove_step&quot;のfo：MSC /フィブリン塊のキープtogether.withinページ= &quot;1&quot;&gt;アプリケーションの骨非組合に構築この方法（ステップ1.1）に記載のようにして得られたHMSC /フィブリン塊の構築物は、正常8思いやりケース13に重度上肢癒着不能を治療するために適用しました。長期（最大7.6ヶ月）の評価は、組織の異常増殖または腫瘍形成の証拠なしに、すべての患者のための成功した臨床的および機能的転帰を確認しました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54845/54845fig1.jpg" /> 自己血清の調製図。 （A）は、プラズマ装置は、スパイクを使用して転送バッグに移送されます。 （B）プラズマがポートコネクタを介して、グルコン酸カルシウムを注入して凝固させ、 （C）血液バッグ遠心分離機は、血清を分離するために使用されます。/files/ftp_upload/54845/54845fig1large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54845/54845fig2.jpg" /> 自己血清を用いて、図2のhMSCの単離、培養および分化。 骨髄は、密度勾配で遠心分離後に得られた（A）（ブルーラインウィンドウで）単核細胞層; （B）細胞培養物がP1に表示されます。 （C）細胞培養はP0（初代培養）で表示されます。 （B - C）の矢印は、MSC培養物中のMPCの存在を示します。スケールバーは100μmです。 （D）多分化アッセイの組織化学的結果。黒、脂肪細胞への分化中のミネラルマトリックスの沈着のためのフォン・コッサ染色を用いて評価される骨形成分化は、オスミウムtetroxiにより黒色に染色し、脂肪空胞の存在によって示されていますド、および軟骨形成分化は、pHでアルシアンブルー染色によってシアンに染色されている硫酸化グリコサミノグリカン、1スケールバーは50μmであるの存在によって表示されます。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54845/54845fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54845/54845fig3.jpg" /> 図3.準備、MSC /フィブリンクロット構築物の生存率および組織学的特性評価。 それは、架橋後に表示されるように（A）のhMSC /フィブリン塊を構築します。 ABアッセイの（B）成果：MSCが上に、（細胞化血餅をピンクにブルー（右の細胞を含まない対照）から、細胞生存率色素（T24）の色の変化によって示されるように、フィブリン塊の内部生存しています左）。 （C - D）のhMSC /フィブリン塊構築物の組織化学的結果。スケールバーは、50μmです。 （C）ヘマトキシリンおよびフィブリンマトリックス中に埋め込まれた生細胞を示すエオシン染色。初期の骨形成を確認フォン・コッサ染色により、黒色に染色された（D）ミネラルマトリックスの沈着。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54845/54845fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54845/54845fig4.jpg" /> 4. CFU-Fアッセイ図。 メイグリュンワルド/ギムザ法で染色したhMSCを用いて培養フラスコの写真。ズームインエリアは、hMSCのコロニーの形態を示す光顕微鏡写真です。スケールバーは100μmです。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54845/54845fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> hMSC /フィブリン塊の図5.アプリケーションは、骨偽関節に構築します。 偽関節によって影響を受ける患者の上肢の（A）のX線; （B）ちょうど着床前のhMSC /フィブリン塊コンストラクト; （C）のhMSC /フィブリン塊構築物の外科的応用; 5年後の同じ患者の上肢の（D）X線。この図は、ジャンノッティS. らから再発行されます。最小限の変更13と。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54845/54845fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Mesenchymal Stromal Cell Culture and Delivery in Autologous Conditions: A Smart Approach for Orthopedic Applications

自己血清を用いたヒト間葉系幹細胞（hMSCが）を培養し、異種材料と他の負の効果により拒絶反応のリスクを低減します。また、新鮮なのhMSCを配信することができ、中胚葉前駆細胞のサブセットを回収することができます。自家フィブリン塊でのhMSCの埋め込みは、取り扱いが容易で効果的な外科的移植を可能にします。

自家条件で間葉系幹細胞の培養および配信：整形外科アプリケーションのためのスマートなアプローチ

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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