Name: mesenchymal stromal cell culture and delivery in autologous conditions: a smart approach for orthopedic applications
Uploaded: 2016-12-08T15:00:00
Duration: 10 min 30 s
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This study was funded by the Tuscany Region (grant number 539999_2014_Petrini_CUCCS). The authors would like to thank Prof. S. Berrettini for authorizing the use of the Otolab laboratory and instruments, and the surgery staff from the Orthopedic Clinic II of the University of Pisa, for the fundamental cooperation in sample harvesting. The support provided by Dr. F. Scatena is gratefully acknowledged. Finally, many thanks are due to Mr. J.G. De La Ossa for his precious contribution to histologic processing.

O presente protocolo foi desenvolvido em conformidade com a Declaração da Associação Médica Mundial de Helsinki sobre a conduta ética de pesquisa envolvendo seres humanos. Ele foi aprovado pelo Comitê de Ética da Azienda Ospedaliero-Universitaria Pisana. NOTA: A medula óssea foi obtida de pacientes submetidos a cirurgia de substituição total do quadril de rotina (de acordo com o passo 1.1) 15; plasma para a preparação do coágulo foi obtido a partir de sangue periférico autólogos 13; soro autólogo, como um suplemento para o meio de cultura, foram coletados a partir de uma aférese de sangue total autólogo. Todos os pacientes receberam informações detalhadas sobre o procedimento e assinaram um termo de consentimento por escrito. 1. Recolha da Amostra de Medula Óssea <ol><li> Recolha de medula óssea do canal medular femoral após uma cirurgia de substituição total do quadril (para estudos de investigação). Resumidamente, durante a preparação cirúrgica do canal medular para house a haste de prótese, recolher o sangue da medula que transborda (cerca de 10 - 15 ml, dependendo do tamanho da prótese) 15. OU </li><li> Recolhe aspirado de medula óssea da crista ilíaca, sob anestesia local, seguindo o procedimento padrão hematológica cerca de 20 - 30 d antecipadamente (para aplicações clínicas) 16. NOTA: Em ambos os casos seringas heparinizadas (para evitar a formação de coágulos) deve ser utilizado para a recuperação de medula óssea. </li></ol> 2. Preparação de autólogo de Plasma <ol><li> Recolha de 20 ml de sangue periférico do paciente em tubos de recolha de sangue de vácuo contendo EDTA K3 (5,4 mg em 3 tubos mL) e centrifugar a 2400 x g durante 15 min. </li><li> Aspirar o componente de plasma num tubo de 15 mL e congelar a -20 ° C até utilização. </li></ol> 3. Preparação do soro autólogo <ol><li> Transferir a unidade de plasma para um saco de transferência usando um pico. Desligue o saco cheio de soldagem e weigh, o saco para calcular o volume de plasma (Figura 1A). </li><li> Coagular o plasma autólogo por injecção de gluconato de cálcio 100 mg / mL a 10% w / v através do conector da porta (Figura 1B). Após a mistura no saco, coloque-o a 4 ° CO / N sem agitação para facilitar a formação do coágulo. </li><li> Centrifuga-se o saco em 4900 × g durante 15 min à temperatura ambiente. Leve o balde centrífuga para fora da centrífuga e retirar o saco com cuidado (siga as orientações do fabricante para a preparação de ligado de plaquetas) (Figura 1C). </li><li> Isolar o coágulo logo acima da braçadeira para facilitar a filtração. Ligue o kit de filtração para o saco de transferência usando um espigão colocado na porta de saída do kit de filtração. </li><li> Pendurar o saco e abra a braçadeira azul para deixar o fluxo de soro por gravidade. Não aplicar pressão para o filtro para evitar a transferência de fibrina dentro do saco. Após filtração, selar o tubo e retirar o saco (siga o fabriorientações do fabri- para preparação de ligado de plaquetas). </li><li> Conecte uma linha dedicada ao soro saco e transferência final em tubos de 50 ml sob uma bancada de fluxo laminar para evitar a contaminação microbiana. </li><li> Tomar uma amostra com uma seringa para testar a ausência de fibrinogénio e executar um teste de esterilidade para culturas de bactérias aeróbicas e anaeróbicas 17. Rotular os tubos de forma apropriada e congelá-los a - 20 ° C até o uso. </li></ol> 4. Preparação do meio de expansão <ol><li> Preparar 500 ml de meio de proliferação completa. Para Dulbecco Modified Eagle Médium - baixo teor de glucose (DMEM-LG), adicionar 10% de soro autólogo (obtida tal como descrito no ponto 3), glutamina 2 mM, solução de antibiótico a 1% e solução antimicótico a 1%. Esterilizada por filtro no meio de proliferação completa. </li></ol> 5. Isolamento de hMSCs da medula óssea <ol><li> Transfira a amostra de medula óssea (5 - 10 ml) da seringa para uma mL cónico 50 TUser e diluir com solução salina estéril (razão 1: 4). Vortex do tubo de 50 mL durante 30 s para desagregar os aglomerados de células. </li><li> Aquecer o gradiente de densidade (densidade de 1,077 g / L; ver Tabela de Materiais) para a TA antes de utilização e a camada de medula óssea diluída cuidadosamente (para evitar a mistura de ambas as camadas) sobre o gradiente de densidade por adição de 20 ml de amostra a 15 ml de densidade gradiente para cada tubo de 50 ml (Figura 2A). </li><li> Centrifuga-se a 400 x g sem travão, a 25 ° C durante 30 min, depois de recolher a fracção mononuclear na interface líquido-líquido e transferi-lo para um novo tubo de 50 ml usando uma pipeta de 5 ml estéril. </li><li> Lava-se a fracção mononuclear reunidos duas vezes com meio completo a proliferação e centrifugar os tubos a 400 × g durante 10 min a 25 ° C para se obter os sedimentos celulares. </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente cada pelete de células em 5 ml de meio de proliferação completa. Dilui-se a uma proporção de 1: 100 para contagem das células. </li><li>Contar as células utilizando um hemocitómetro, após uma diluição de 1: 1 com coloração com azul de tripano para avaliar a viabilidade celular. </li></ol> 6. Cultura de hMSCs na Presença de autólogo Serum <ol><li> Encha dois ou mais frascos (TC) cm2 de cultura de tecido com 75 15 mL de meio completo fresco proliferação e transferi-los para uma incubadora de cultura de células a 37 ° C e 5% de CO2, até utilização. </li><li> semente 0,3 &#160; - 0,5 x 10 6 células / cm2 (37,5 x 10 6 células / 15 ml de meio completo fresco proliferação) e incubar a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 48 h. </li><li> Ao mesmo tempo, as sementes 1 x 10 6 células em um balão de 2 25 centímetros TC com 5 ml de meio completo fresco de proliferação Unidade Formando o Colony - fibroblastos (CFU-M) ensaio. Cultura para 2 semanas (continua na seção 12). </li><li> Descarte a médio e lavar cuidadosamente os frascos do passo 6.2 com meio de proliferação completa para remove células não aderentes e detritos. Adicionar meio fresco aos frascos e substituir metade do que duas vezes por semana, até 70-80% de confluência (cultura primária, da passagem 0 (P0)) (Figura 2B). </li><li> Recuperar as células, utilizando uma protease específica livre animal recombinante (ver tabela de materiais; utilize 3 mL de solução por frasco, tal como recomendado pelo fabricante) e incubar a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 10 min. Adicionar 6 mL de meio de proliferação completa por frasco e recolher em um tubo de 50 mL. Repita o passo 5.6. NOTA: IMPORTANTE: O uso desta protease em vez de tripsina permite a recuperação de algumas células mesodermal progenitores (PPM) presentes na cultura, que é de tripsina resistentes. </li><li> Para uma maior expansão, replate a suspensão de células a 2000 - 3000 células / cm2 em novas 75 centímetros 2 frascos TC (P1) (Figura 2C). </li><li> Utilizar alíquotas de células para avaliar o potencial de diferenciação das MSCsno sentido osteogênico, adipogênica e linhagens condrogênicas. Realizar ensaios de diferenciação seguintes recomendações do fabricante (Figura 2D). NOTA: Diferente métodos de coloração pode ser usada para avaliar a diferenciação multilinhagens. </li></ol> 7. Preparação de um meio osteogênico com suplementos farmacêuticos <ol><li> Dilui-se uma solução de ácido ascórbico (solução 1A:. Ácido ascórbico a 200 mg / mL (ver o quadro de Materiais) a 1:10 com DMEM-LG, para se obter uma solução 20 mg / ml (solução de 1B, a solução de trabalho) aliquotas de Stock de soluções e 1A 1B a -20 ° C até utilização. </li><li> Ressuspender 1 g de hidrocortisona em 10 ml de água estéril (solução 2A: hidrocortisona 100 mg / mL (ver o quadro de Materiais) Solução diluída de 2A a 1:. 1000 com DMEM-LG para se obter uma solução / ml 100 ug (Solução 2B, trabalhando solução). aliquotas de soluções de Stock 2A e 2B, a -20 ° C até utilização. </li><li> Mediante o uso de prepare meio fresco osteogénica como se segue: adicionar DMEM-LG com 10% de soro autólogo, 50? g de ácido ascórbico / mL e 0,4 ug / ml de hidrocortisona. Estéril-filtro do meio osteogênico. </li></ol> 8. Osteogénica pré-indução e recuperação de hMSCs <ol><li> Remover completamente o meio de proliferação e adicionar osteogénicas médias 96 h antes da colheita das células (isto é, 80 - 90% de confluência está geralmente alcançado em 7 d). Fornecer uma osteogênico mudança de meio adicional de 24 h antes da colheita das células. </li><li> Separe as células tal como descrito no passo 6.5 e suavemente ressuspender o sedimento de adição de 2 mL de meio de proliferação completa em um tubo de 50 mL. NOTA: A viabilidade das células pode ser reduzida (cerca de 10%) como um resultado de osteoindução. agregados celulares podem ser observados. </li><li> Após a contagem, lavar as células com meio completo a proliferação e centrifugar a 300 x g durante 5 min. Ressuspender o sedimento suavemente a 1-2 x 10 6 células viáveis / 2mL de plasma autólogo (ver secção 2) por tubo de 50 mL. </li></ol> 9. Preparação de hMSC / coágulo de fibrina Constructos <ol><li> Adicionar 150 ul de gluconato de cálcio a 100 mg / ml a cada tubo 50 mL obtido no passo 8.3. e voltar a suspender as células sob agitação suave. </li><li> Incubar as células a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 15 - 30 minutos para se obter hMSC / fibrina construções coágulo (Figura 3A). Prepara-se uma construção de coágulo de fibrina sem células para ser utilizada como um controlo. NOTA: IMPORTANTE: É recomendável para preparar este coágulo de controle de pelo menos 2 h antes do ensaio de viabilidade celular, que leva 30 minutos ou mais para reticular. </li></ol> 10. Célula ensaio de viabilidade <ol><li> Retirar o líquido dos tubos de 50 ml e adicionar 1 mL de meio de proliferação completo contendo 10% de reagente / viabilidade celular v v (AB; consulte a Tabela de Materiais), de acordo com as orientações do fabricante. </li><li> incubar the tubos a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 3 h. Medir a absorvância a 570 nm com um comprimento de onda de referência de 600 nm (AB no tempo 0; T0). </li><li> Descartar o sobrenadante e adicionar 2 mL de meio de proliferação completo fresco. Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 O / N. No dia seguinte (AB em tempo de 24 h; t24), repita os passos 10,1-10,3 (Figura 3B). </li></ol> 11. histológica avaliação da viabilidade celular e deposição de cálcio no interior do coágulo de fibrina Construções <ol><li> Fixar os / fibrina construções coágulo hMSC em 4% w / v neutra tamponizada de formalina O / N a 4 ° C. Lavar 4x em D-PBS durante 15 min e armazenar em 70% de etanol. </li><li> Desidratar as amostras a 40 ° C numa série de etanol graduada: 80%, uma vez durante 30 min, 95% duas vezes durante 45 min e 3 x 100% durante 1 h. Esclarecer duas vezes em xilol durante 45 minutos a 40 ° C. </li><li> Lavar as amostras em parafina líquida a 60 ° C durante 2 h e incorporá-los. Corte o bloco de parafina com um micrótomo e montar tele secções (5 uM) em lâminas de vidro. </li><li> Manchar as seções desparafinados usando o Eosina (H &amp; E) método (Figura 3C) Hematoxilina padrão e. </li><li> Realização da coloração de von Kossa por tratamento das secções com 1% de nitrato de prata durante 15 minutos, 0,5% Pirogalol durante 2 min, e 5% de tiossulfato de sódio durante 2 min. Contracoloração das secções com 0,1% de vermelho rápido nuclear diluído em uma solução de sulfato de alumínio contendo 5 g durante 5 min e lavá-los com água potável durante 5 min. Montar as seções com um agente de montagem. </li><li> Avaliar a deposição mineral na forma de grânulos pretos sob microscópio de luz (aumento de 400X) (Figura 3D). </li></ol> 12. Ensaio CFU-F <ol><li> Lavar o frasco de 25 cm2 (a partir do passo 6.3.) Com D-PBS. Mancha utilizando o método de May-Grunwald / Giemsa padrão. Visualmente quantificar o número hMSC marcando colónias individuais (Figura 4) sob um microscópio de luz. NOTA: Sea medula óssea é tomado como no passo 1.2. e as seções 2-9 são realizados em Boas Práticas de Fabricação (BPF), com a aprovação regulamentar necessário, os HMSC / fibrina construções coágulo pode ser implantado para aplicações ortopédicas. </li></ol>

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Os autores não têm nada para revelar.

Os passos críticos do presente protocolo de preocupação a utilização de soro humano adulto e de protease, que permitem a obtenção de uma terapia de hMSC biosseguro. Em particular, o soro de um adulto humano permite o isolamento e manutenção, enquanto garante a protease de colheita, de PPM. Estas são células imaturas presentes na medula óssea que podem dar origem a hMSCs fresco, garantindo, assim, um reservatório de hMSCs viáveis ​​ao longo do tempo de cultura. Nem todas as PPM pode ser recolhido, dado que o aumento do tempo de exposição para a actividade de protease é prejudicial para a viabilidade hMSC. Por esta razão, uma protease de incubação de 10 min foi seleccionado como compromisso óptimo entre a recuperação de PPM e a viabilidade das hMSCs. Outro passo fundamental é tempo osteodiferenciação. Com efeito, um grande em osteodiferenciação vitro reduziria consideravelmente a viabilidade celular, afectando, assim, a formação de osso in vivo definitiva. O último passo fundamental consiste em aproveitar de uma armação bioabsorvível autólogo, which é obtida por incorporação das células (hMSCs e PPM) em um gel de fibrina a partir de coagulação do plasma. Um passo chave para melhorar o rendimento de PPM é para semear as células mononucleares em maior concentração. Utilizando procedimentos de aferese para se obter plasma e tratando-o com gluconato de cálcio torna possível alcançar soro autólogo em grandes quantidades. Foi observado que o soro humano como um suplemento de meio é comparável à de Soro Fetal Bovino (FBS) em culturas de hMSC. No entanto, em nossa experiência, um meio completo suplementado com FBS contribui para a senescência mais rápido do que o soro humano adulto. Um passo significativo é o de administrar um osteoindução mínima para hMSCs. De facto, este tratamento leva as células a diferenciar facilmente para a linhagem osteogica, sendo assim útil para evitar a continuação da transformação de células in vivo. Para manter uma boa viabilidade de hMSCs minimamente osteoinduced, recomenda-se seguir cuidadosamente as recomendações descritas nos passos 6.5. ad 8.2., incluindo o manuseamento, centrifugação e quantidades médias a ser adicionado. Se um procedimento de aférese não está disponível, ainda é possível realizar este protocolo através da realização de sangue vários empates para o paciente ou, em alternativa, através da compra de soros AB reunidas. Obviamente, a fim de trazer este protocolo a partir da cabeceira bench-to-, é obrigatório ter fábricas celulares de GMP, ou equivalentes, disponíveis. Limitações à aplicação desta técnica a preocupação anêmica, hematológicas-oncologia e pacientes ortopédicos afetado por osteomielite., Desenho de grandes quantidades de sangue de pacientes anêmicos, devem ser evitados. Em doentes oncológicos, a qualidade das amostras de células é afectado por tratamentos de quimioterapia, enquanto que nos doentes a osteomielite, a infecção pode afectar o resultado final. Em todos os casos em que o soro autólogo é insuficiente ou inadequada, do sexo masculino reunidos AB soros representam uma boa alternativa. Usando células clo / fibrinaconstructos de T para possíveis aplicações clínicas é crucial para libertar uma terapia celular completamente autólogo, o qual pode ser fácil de manusear e de molde durante a cirurgia, resultando em excelentes resultados no tratamento de não uniões ósseas 13. Para fins clínicos, hMSCs geralmente são administrados através de dois procedimentos principais: manipulação mínima e extensa manipulação 9. Para superar os problemas relacionados com uma grande cultura ex vivo, tais como alterações na morfologia e tamanho da célula 18, realizou-se um curto período de tempo a expansão das células ex vivo e osteo-diferenciação (apenas 4 d). O protocolo livre de xeno descrito neste trabalho, juntamente com os tempos de expansão celular e osteodiferenciação curtas, demonstrou ser relevante em clínicas a fim de obter a produção óssea rápida in vivo, sem evidência de crescimento excessivo e transformação do tecido, confirmando assim a sua eficácia e longa segurança -termo na reparação óssea (Figura 5) </strong&gt; 13. A metodologia apresentada neste relatório é destinado a demonstrar a eficácia e segurança de hMSC expansão in vitro em condições autólogas para possível uso em cirurgia ortopédica. Este protocolo emprega hMSCs isoladas a partir de medula óssea e cultivada num meio suplementado com soro autólogo e incorporado no coágulo de fibrina autólogos, garantindo, assim, uma terapia celular completamente autólogo. A indução osteogénico duas vezes, pouco antes da segunda desprendimento, melhora a capacidade hMSC de se diferenciar em osteoblastos. Como resultado, esta técnica é particularmente adequada para aplicações em defeitos ósseos, uma vez que não é limitado a pseudoartrose. aplicações futuras possíveis poderão envolver cisto talus e gestão de perda óssea.

As células estromais mesenquimais humanas (hMSCs) representam uma das melhores fontes de células para uso em engenharia de tecidos para promover a osteogénese 1,2. Eles são facilmente isoladas a partir de medula óssea e outros tecidos adultos e expressam marcadores de superfície típicos, tais como CD90, CD105, CD73 1. Além disso, eles podem diferenciar-se em vários tipos de células, tais como osteoblastos, condrócitos e adipócitos 3. Os seus efeitos terapêuticos são atribuídos a sua regeneração e propriedades tróficas 4. hMSCs poderiam ser utilizados em cirurgia ortopédica, bem como em outras aplicações clínicas regenerativas. Eles são de preferência combinados com andaimes, para melhorar o resultado clínico 5. Em comparação com outros materiais, o gel de fibrina apresenta propriedades interessantes, tais como a adesividade, a reabsorção e o transporte eficiente de nutrientes, que fazem com que seja extremamente útil para uma variedade de aplicações de engenharia de tecidos 6,7. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; O principal desafio na tradução de uma abordagem de engenharia de tecidos para aplicações clínicas é a obtenção de um andaime totalmente biocompatível e biosseguro e um meio de cultura livre de xeno que evita qualquer efeito infeccioso ou reativo. No nosso método, o gel de fibrina, derivado de sangue do próprio paciente, e soro autólogo, para a cultura in vitro de hMSCs, foram empregues como uma solução terapêutica possível no campo ortopédico 8. Para fins clínicos, as hMSCs são geralmente administrados por meio de dois processos principais: (i) o processo de &quot;uma-etapa&quot; (isto é, mínimo de manipulação), que permite a auto transplante de medula óssea, quer total ou concentrados (isto é, células mononucleares), durante a cirurgia; e (ii) o processo &quot;de dois passos&quot; (ou seja, uma extensiva manipulação), que se baseia na expansão ex vivo de hMSCs para aumentar o seu rendimento, antes do implante, e requer LInstalações MP 9. Curiosamente, a cultura de células com soro humano adulto em vez de soro de vitelo permite a recuperação, juntamente com as hMSCs, de um subconjunto de células (1 - 10% em culturas mononucleares), chamadas de células Mesodérmico progenitoras (PPM), capazes de diferenciação in vitro em fresco hMSCs 10,11. Assim, hMPCs pode desempenhar um papel significativo no processo de regeneração quando comparado com as hMSCs sozinho 12,13. Finalmente, a curto prazo osteo-indução empurra hMSCs para começar a sua diferenciação em linhagem osteogênica sem perder o seu potencial proliferativo e viabilidade 12. Esses resultados confirmam os estudos anteriores que têm relatado melhorada na formação do osso in vivo por hMSCs, seguido por uma pré-cultura em meio osteogénico 14. Além disso, um coágulo de plasma autólogo como um andaime para entrega de células pode ser facilmente manipulado pelo cirurgião e moldado para se ajustar à forma da cavidade do osso 13. ºerefore, este método pode ser extremamente útil para os pesquisadores e clínicos que visam traduzir sua base de terapia hMSC da bancada à cabeceira em aplicações ortopédicas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="920">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:235px;">Triple Select (1x)</td>
			<td style="width:301px;">GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td style="width:192px;">12563-029</td>
			<td style="width:193px;">cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypan blue stain&#160;</td>
			<td>GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>15250061</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM-LG, no glut, no phenol red</td>
			<td>GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>11880-028&#160;</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glutamax (100X)</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>35050038</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin Streptomycin sol.</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alamar Blue (AB)</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>DAL1025</td>
			<td>proliferation/viability assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-14440-02</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D-PBS&#160;</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">StemMACS AdipoDiff Media</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-091-677</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">StemMACS ChondroDiff Media</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-091-679</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">hMSC Osteogenicdiff BulletKit</td>
			<td>Euroclone&#160;</td>
			<td>LOPT3002</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vitamin C (ascorbic acid)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>ATC Code: A11GA01</td>
			<td>Pharmaceutical grade drug</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Flebocortid Richter (hydrocortisone)</td>
			<td>Aventis Pharma</td>
			<td>ATC Code: H02AB09</td>
			<td>Pharmaceutical grade drug</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Victor X3, reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2030 multilabel reader</td>
			<td>proliferation/viability assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Silver nitrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>209139</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pyrogallol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>16040</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Thiosulphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8503</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Histoplast LP</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>8332</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>32213</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2860</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nuclear fast red</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>60700</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formalin</td>
			<td>Bio-optica</td>
			<td>05-K01009-X40</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eosin B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>45260</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DPX</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>6522</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Haematoxylin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3136</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Aluminium Sulphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>202614</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xylol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>534056</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microtome</td>
			<td>Leika</td>
			<td></td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">May Grunwald</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>MG1L-1L</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Giemsa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>32884-250ML</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Transfer bag</td>
			<td>Biom&#233;rieux</td>
			<td>BC0300031</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filtration kit</td>
			<td>Macopharma</td>
			<td>BC0800010</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium Gluconate</td>
			<td>Galenica Senese</td>
			<td></td>
			<td>Pharmaceutical grade drug</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bact Alert</td>
			<td>Biom&#233;rieux</td>
			<td>259790 anaerobic&#160;</td>
			<td>microbiological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bact Alert</td>
			<td>Biom&#233;rieux</td>
			<td>259789 aerobic&#160;</td>
			<td>microbiological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Steryle Luer-Lok Syringe 50 ml</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>300865</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heraeus Cryofuge 6000i</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>blood bag centrifuging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SL16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>blood tube centrifuging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mesenchymal stromal cell culture and delivery in autologous conditions: a smart approach for orthopedic applications

As células estromais mesenquimais humanas (hMSCs) são cultivadas in vitro com diferentes meios. Limites à sua utilização em ambientes clínicos, no entanto, dependem principalmente sobre os riscos potenciais de risco biológico e inflamação exercidas pelos nutrientes xenogï¿½icas para sua cultura. derivados humanos ou materiais recombinantes são os primeiros candidatos escolhidos para reduzir estas reacções. Portanto, os suplementos de cultura e materiais de origem autóloga representam os melhores nutrientes e os produtos mais seguros. Aqui, descrevemos um novo protocolo para o isolamento e cultura de hMSCs de medula óssea em condições autólogo - ou seja, soro derivadas de pacientes como um suplemento para o meio de cultura e de fibrina como um andaime para administração hMSC. Com efeito, hMSC construções / coágulo de fibrina poderia ser extremamente útil para várias aplicações clínicas. Em particular, vamos nos concentrar na sua utilização em cirurgia ortopédica, onde o coágulo de fibrina derivada do próprio sangue do doador permitidotrocas de entrega de células eficaz e de nutrientes / resíduos. Para garantir condições óptimas de segurança, é de extrema importância para evitar os riscos de transformação hMSC e crescimento excessivo do tecido. Por estas razões, a abordagem descrita no presente documento também indica um vivo hMSC expansão minimamente ex, para reduzir a senescência celular e alterações morfológicas e de curto prazo osteo-diferenciação antes da implantação, para induzir a especificação das linhagens osteogênica, diminuindo assim o risco de descontrolada subsequente proliferação.

Preparação de soro autólogo coagulação do plasma, realizada por adição de gluconato de cálcio para o saco de transferência, permite a recuperação de soro autólogo em grandes quantidades, como necessário para a cultura de hMSC. Com efeito, com esta técnica, é possível alcançar-se a 200 ml de soro (Figura 1). HMSC isolamento, cultura e diferenciação usando soro autólogo As células mononucleares de medula óssea são isoladas utilizando um gradiente de densidade, que dá origem a uma camada anular intermédia (Figura 2A). Por plaqueamento estas células e removendo os não-aderentes com a lavagem, que é possível isolar as hMSCs (Figura 2B). Sob condições de cultura autólogas, um subconjunto de células, chamadas PPM, são detectados em P0 e em percentagens acima tO 10%, dependendo da variabilidade de paciente (Figura 2B). PPM estão ainda presentes após replating (isto é, P1), se a protease é utilizada para passagem em células (Figura 2C). hMSCs isoladas e cultivadas num ambiente autólogo manterem a sua capacidade de se diferenciar em relação aos três linhagens mesodermal bem conhecidos (osteogénico, adipogênica, e condrogénicas). Os ensaios de diferenciação foram realizadas para comparar a identidade população hMSC com os resultados obtidos utilizando (não autólogos) condições padrão de cultura. Como ensaios de funcionalidade para este protocolo, a coloração de von Kossa, tetróxido de coloração de ósmio e coloração Alcian Blue no pH 1 foram escolhidos em lugar daqueles sugerido pelo fabricante meios de diferenciação (ver Tabela de Materiais) (Figura 2D). Preparação, viabilidade e caracterização histológica da MSC / fibrina construções coágulo <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; As hMSCs são dispersas no plasma, a qual é reticulada por gluconato de cálcio num tubo de 50 ml, levando à formação de um disco de gelatina rodeado por sua sobrenadante (Figura 3A). Dentro destes coágulos de plasma, as hMSCs são viáveis, como demonstrado pela mudança de cor do corante t24 viabilidade celular de azul (controlo sem células) para rosa (coágulo celularizado) (Figura 3B). A viabilidade das células no interior do coágulo é confirmada por coloração H &amp; E, mostrando uma morfologia celular bem conservada (Figura 3C). Além disso, a osteoindução mínima pouco antes da segunda colheita de células dá origem à deposição preliminar de cálcio por hMSCs estimuladas (Figura 3D). Unidade formadoras de colónias A presença de colónias de hMSC após 2 semanas em cultura, estão indicadas pelo ensaio de CFU-M (Figura 4). s = &quot;jove_step&quot; fo: manter-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Aplicação da MSC / coágulo de fibrina construir na não-união óssea Construtos HMSC / coágulo de fibrina obtida como descrito no presente método (passo 1.1) foram aplicadas com sucesso no tratamento de graves pseudartroses dos membros superiores em 8 casos compassivo 13. De longo prazo de avaliação (máximo de 7,6 meses) confirmou os resultados clínicos e funcionais de sucesso para todos os pacientes, sem evidência de crescimento excessivo de tecido ou a formação de tumores. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54845/54845fig1.jpg" /> Figura 1. Preparação de soro autólogo. (A) A unidade de plasma é transferido em um saco de transferência usando o espigão; (B) O plasma é coagulada por injecção de gluconato de cálcio, através do conector da porta; (C) Uma centrifugadora-bolsa de sangue é usado para separar o soro./files/ftp_upload/54845/54845fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54845/54845fig2.jpg" /> Figura 2. Isolamento de hMSC, cultura e diferenciação utilizando soro autólogo. (A) A camada de células mononucleares (na janela linha azul), obtido após a centrifugação da medula óssea com um gradiente de densidade; (B) A cultura de células, tal como aparece na P1; (C) de cultura de células, tal como aparece no P0 (cultura primária); (B - C) As setas mostram presença de PPM na cultura MSC. barra de escala é de 100 mm; (D) os resultados histoquímicos de ensaios de diferenciação multilinhagem. diferenciação osteogênica é avaliada através de coloração de von Kossa para deposição de matriz mineral em preto diferenciação, adipogênica é mostrado pela presença de vacúolos gordos, manchado de preto por tetroxi de ósmiode, e diferenciação condrogénica é exibido pela presença de glicosaminoglicanos sulfatados, que são corados em ciano por coloração com azul Alcian a pH 1. A barra de escala representa 50 um. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54845/54845fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54845/54845fig3.jpg" /> Figura 3. Preparação, viabilidade e histológica Caracterização da MSC / coágulo de fibrina Construções. (A) O hMSC / coágulo de fibrina construir, uma vez que aparece depois de reticulação; (B) Resultados do ensaio de AB: o MSC são viáveis dentro do coágulo de fibrina, tal como demonstrado pela mudança de cor do corante de viabilidade celular (T24), de azul (controlo sem células, à direita) para rosa (coágulo celularizado, na esquerda). (C - D) resultados histoquímicos de HMSC / fibrina construções coágulo. barra de escala é50? M. (C) de hematoxilina e eosina mostrando células viáveis incorporados na matriz de fibrina; Deposição (D) da matriz mineral manchado de negro pela coloração de von Kossa, o que confirma uma osteogênese inicial. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54845/54845fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54845/54845fig4.jpg" /> Figura 4. Ensaio CFU-F. Imagem de um frasco de cultura com hMSCs corado pelo método de May-Grunwald / Giemsa. A área de zoom-in é uma luz-micrografia mostrando a morfologia de uma colônia hMSC. Barra de escala é de 100 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54845/54845fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Figura 5. Aplicação de hMSC / coágulo de fibrina Construir em Bone Nonunion. (A) de raios-X do membro superior de um paciente afetado por pseudoartrose; (B) construção coágulo hMSC / fibrina apenas antes da implantação; (C) a aplicação cirúrgica da construção coágulo hMSC / fibrina; (D) de raios-X do membro superior do mesmo paciente após 5 anos. Este valor é republicado de Giannotti S. et al. 13 com modificações mínimas. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54845/54845fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Mesenchymal Stromal Cell Culture and Delivery in Autologous Conditions: A Smart Approach for Orthopedic Applications

A cultura de células estromais mesenquimais humanas (hMSCs) com soro autólogo, reduz os riscos de rejeição por material de xenogénico e outros efeitos negativos. Também permite a recuperação de um subconjunto de células progenitoras mesodérmica, que pode fornecer as hMSCs frescos. Incorporação hMSCs em um coágulo de fibrina autóloga permite fácil manuseio e implantação cirúrgica eficaz.

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