Name: mesenchymal stromal cell culture and delivery in autologous conditions: a smart approach for orthopedic applications
Uploaded: 2016-12-08T15:00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mesenchymal Stromal Cell Culture and Delivery in Autologous Conditions: A Smart Approach for Orthopedic Applications at JoVE.com

This study was funded by the Tuscany Region (grant number 539999_2014_Petrini_CUCCS). The authors would like to thank Prof. S. Berrettini for authorizing the use of the Otolab laboratory and instruments, and the surgery staff from the Orthopedic Clinic II of the University of Pisa, for the fundamental cooperation in sample harvesting. The support provided by Dr. F. Scatena is gratefully acknowledged. Finally, many thanks are due to Mr. J.G. De La Ossa for his precious contribution to histologic processing.

<ol>
	<li>Horwitz, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarification+of+the+nomenclature+for+MSC:+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement.">Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 7, 393-395 (2005).</li><li>Kassem, M., Abdallah, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells:+biological+characteristics+and+potential+role+in+therapy+of+degenerative+diseases.">Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells: biological characteristics and potential role in therapy of degenerative diseases.</a> Cell Tissue Res. 331, 157-163 (2008).</li><li>Pittenger, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+potential+of+adult+human+mesenchymal+stem+cells.">Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.</a> Science. 284, 143-147 (1999).</li><li>Bonfield, T. L., Nolan Koloze, M. T., Lennon, D. P., Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+human+mesenchymal+stem+cells+efficacy+in+vivo.">Defining human mesenchymal stem cells efficacy in vivo.</a> J Inflamm. (Lond). 25 (7), 51 (2010).</li><li>Pneumaticos, S. G., Triantafyllopoulos, G. K., Chatziioannou, S., Basdra, E. K., Papavassiliou, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+strategies+of+bone+augmentation+in+spinal+surgery.">Biomolecular strategies of bone augmentation in spinal surgery.</a> Trends Mol. Med. 17 (4), 215-222 (2011).</li><li>Amhed, T. A. E., Dare, E. V., Hincke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin:+A+versatile+scaffold+for+tissue+engineering+applications.">Fibrin: A versatile scaffold for tissue engineering applications.</a> Tissue Engineering Part B. 14 (2), 199-215 (2008).</li><li>Silbertein, L. E., Williams, L. J., Huglett, M. A., Magee, D. A., Weisman, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+autologous+fibrinogen-based+adhesive+for+use+in+oncologic+surgery.">An autologous fibrinogen-based adhesive for use in oncologic surgery.</a> Transfusion. 28 (4), 319-321 (1988).</li><li>Jockenhoevel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+gel+advantages+of+a+new+scaffold+in+cardiovascular+tissue+engineering.">Fibrin gel advantages of a new scaffold in cardiovascular tissue engineering.</a> Eur. J. Cardiothorac Surg. 19 (4), 424-430 (2001).</li><li>Veronesi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+use+of+bone+marrow,+bone+marrow+concentrate,+and+expanded+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+in+cartilage+disease.">Clinical use of bone marrow, bone marrow concentrate, and expanded bone marrow mesenchymal stem cells in cartilage disease.</a> Stem Cells Dev. 22 (2), 181-192 (2013).</li><li>Petrini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+purification+of+mesodermal+progenitor+cells+from+human+adult+bone+marrow.">Identification and purification of mesodermal progenitor cells from human adult bone marrow.</a> Stem Cells Dev. 18 (6), 857-866 (2009).</li><li>Trombi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+culture+of+mesodermal+progenitor+cells.">Selective culture of mesodermal progenitor cells.</a> Stem Cells Dev. 18 (8), 1227-1234 (2009).</li><li>Trombi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+autologous+plasma-derived+clot+as+a+biological+scaffold+for+mesenchymal+stem+cells+in+treatment+of+orthopedic+healing.">Human autologous plasma-derived clot as a biological scaffold for mesenchymal stem cells in treatment of orthopedic healing.</a> J. Orthop. Res. 26 (2), 176-183 (2008).</li><li>Giannotti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+autologous+human+mesenchymal+stromal+cell/fibrin+clot+constructs+in+upper+limb+non-unions:+long+term+assessment.">Use of autologous human mesenchymal stromal cell/fibrin clot constructs in upper limb non-unions: long term assessment.</a> PlosOne. 8 (8), 73893 (2013).</li><li>Castano-Izquierdo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-culture+period+of+mesenchymal+stem+cells+in+osteogenic+media+influences+their+in+vivo+bone+forming+potential.">Pre-culture period of mesenchymal stem cells in osteogenic media influences their in vivo bone forming potential.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 82 (1), 129-138 (2007).</li><li>Malkani, A. L., Fitzgerald, R. H., Kaufer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Orthopaedics. , (2002).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICSH+guidelines+for+the+standardization+of+bone+marrow+specimens+and+reports.">ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports.</a> Int J Lab Hematol. 30 (5), 349-364 (2008).</li><li>Bugno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+BacT/ALERTR+3D+system+for+sterility+testingof+injectable+products.">Application of the BacT/ALERTR 3D system for sterility testingof injectable products.</a> Braz J Microbiol. 46 (3), 743-747 (2015).</li><li>Bonab, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+of+mesenchymal+stem+cells+in+vitro.">Aging of mesenchymal stem cells in vitro.</a> BMC Cell Biology. 7, 14 (2006).</li></ol>

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Критические шаги этого протокола касаются использования взрослого сыворотки человека и протеазы, которые позволяют получить BIOSAFE hMSC терапию. В частности, взрослого человека в сыворотке крови позволяет изоляции и технического обслуживания, в то время как протеаза обеспечивает урожай, ПДК. Эти незрелые клетки, присутствующие в костном мозге, которые могут привести к новым hMSCs, обеспечивая тем самым резервуар жизнеспособных hMSCs по времени культивирования. Не все ПДКп можно собирать, так как увеличение времени экспозиции к активности протеаз отрицательно сказывается на жизнеспособности hMSC. По этой причине инкубации протеазы в 10 мин был выбран в качестве оптимального компромисса между восстановлением и MPCs жизнеспособности hMSCs. Другим важным шагом является время osteodifferentiation. Действительно, обширная в пробирке osteodifferentiation бы значительно снизить жизнеспособность клеток, влияя таким образом на окончательное формирование костной ткани в естественных условиях. Последний важный шаг заключается в том, пользующимися из аутологичных биорезорбируемого эшафот, whicч получают путем встраивания клеток (hMSCs и MPCs) в виде геля фибрина из плазмы свертываемости. Ключевым шагом для повышения урожайности MPCs является семян мононуклеарных клеток при более высокой концентрации. С помощью процедуры Аферезная для получения плазмы и обработки его глюконата кальция позволяет достичь аутологичной сыворотки в больших количествах. Было установлено, что сыворотка крови человека в качестве среды добавка сопоставима с фетальной бычьей сыворотки (FBS) в hMSC культурах. Тем не менее, по нашему опыту, полная среда с добавлением FBS способствует более быстрому старению, чем у взрослого человека сыворотки. Важным шагом является то, что введение минимальной остеоиндукция к hMSCs. На самом деле, это лечение приводит клетки легко дифференцировать к остеогенной линии, таким образом , быть полезным , чтобы избежать дальнейшей трансформации клеток в живом организме . Для того, чтобы поддерживать хорошую жизнеспособность минимально osteoinduced hMSCs, рекомендуется тщательно соблюдать рекомендации, описанные в шагах 6.5.d 8.2., в том числе обработка, центрифугирование и средние суммы, которые будут добавлены. Если процедура афереза ​​недоступна, это все еще возможно осуществить этот протокол, выполняя несколько кровь привлекает к пациенту или, в качестве альтернативы, при покупке Pooled AB сывороток. Очевидно, что для того, чтобы довести этот протокол от скамьи к постели больного, обязательно иметь фабрики клеток GMP, или их эквиваленты, освобождена. Ограничения к применению этой методики касаются анемией, гематологического-онкология и ортопедических больных, пострадавших от остеомиелита., Drawing большое количество крови от пациентов с анемией, следует избегать. В онкологических больных, качество образцов клеток зависит от химиотерапии, в то время как у пациентов, остеомиелит инфекция может повлиять на конечный результат. Во всех случаях, в которых аутологичной сыворотки является недостаточным или неподходящим, объединяли мужчины AB сывороток представляют собой хорошую альтернативу. Использование клеток / фибрина CLOт конструкции для возможных клинических применений важно , чтобы выпустить полностью аутологичных клеточную терапию, которая может быть простой в обращении и плесени во время операции, что приводит к отличным результатам для лечения костей , не являющиеся союзам 13. Для клинических целей hMSCs обычно вводят с помощью двух основных процедур: минимальные манипуляции и обширные манипуляции 9. Для преодоления проблем , связанных с обширной экс естественных условиях культуры, такие как аномалии в морфологии и размера 18 клеток, мы провели некоторое время экс расширения естественных клеток и костно-дифференцировки (только 4 г). Протокол Зенона бесплатно описанный в этой статье, наряду с короткими расширения клеток и osteodifferentiation раз продемонстрировал свою актуальность в клиниках для того , чтобы получить быстрое производство костной ткани в естественных условиях, без признаков разрастания ткани и трансформации, подтвердив тем самым его эффективность и длительный -term безопасности в ремонте кости (рисунок 5) </stroнг&gt; 13. Методология , представленная в настоящем докладе , направлен на демонстрацию эффективности и безопасности hMSC в пробирке расширения в аутологичных условиях для возможного использования в ортопедической хирургии. Этот протокол использует hMSCs, выделенные из костного мозга и культивировали в среде, дополненной аутологичной сыворотки и заливали в аутологичной фибринового сгустка, обеспечивая тем самым полностью аутологичной клеточной терапии. Два раза остеогенной индукции, как раз перед вторым отрядом, улучшает способность hMSC дифференцироваться в остеобласты. В результате, этот способ особенно подходит для применения в костных дефектов, так как оно не ограничивается псевдоартрозов. Возможные будущие приложения могут включать в себя Talus кисту и управление потерей костной массы.

Человек мезенхимальных стромальных клеток (hMSCs) представляют собой один из лучших источников клеток для использования в тканевой инженерии для содействия остеогенез 1,2. Они легко выделены из костного мозга и других тканей взрослого, и выражают типичные поверхностные маркеры , такие как CD90, CD105, CD73 1. Более того, они могут дифференцироваться в несколько типов клеток, таких как остеобласты, хондроциты и адипоциты 3. Их терапевтический эффект объясняется их регенеративных и трофических свойств 4. hMSCs можно было бы использовать в ортопедической хирургии, а также в других регенеративных клинических применений. Их предпочтительно в сочетании с подмостей, чтобы улучшить клинический исход 5. По сравнению с другими материалами, гель - фибрин показывает интересные свойства , такие как липкостью, резорбции и эффективной транспортировки питательных веществ, что делает его чрезвычайно полезным для различных тканевой инженерии 6,7. <p cдеваха = &quot;jove_content&quot;&gt; Основной задачей в переводе инженерный подход ткани в клинических применений является получение полностью биосовместимого и BIOSAFE эшафот и Xeno свободной культуральной среде, которая позволяет избежать любой инфекционный или реактивную эффект. В нашем методе фибринового геля, полученного из собственной крови пациента, и аутологичной сыворотки, для культивирования в пробирке hMSCs, были использованы в качестве возможного терапевтического раствора в ортопедической области 8. Для клинических целей hMSCs, как правило , управляются с помощью двух основных процедур: (I) процедуры &quot;одностадийного&quot; (т.е. минимальное манипуляции), что позволяет автоматическое пересадка костного мозга, либо полностью или концентрированные (т.е. мононуклеары), во время операции; и (II) , процедура &quot;двухстадийный&quot; (то есть, обширные манипуляции), который основан на экс виво расширения hMSCs , чтобы увеличить их урожайность до имплантации, и требует GMP 9 объектов. Интересно отметить , что культивированием клеток с взрослого человека сыворотки вместо коровьей сыворотки теленка позволяет извлекать вместе с hMSCs, подмножества клеток (1 - 10% в мононуклеарных культурах) , называемые Мезодерма клетки - предшественники (ПДК), которые способны дифференцироваться в пробирке в пресную hMSCs 10,11. Таким образом, hMPCs может играть существенную роль в восстановительном процессе, по сравнению с только 12,13 hMSCs. И, наконец, краткосрочные костно-индукционная толкает hMSCs , чтобы начать их дифференцировки в остеогенной линии без потери их пролиферативный потенциал и жизнеспособность 12. Эти результаты подтверждают предыдущие исследования, которые сообщили усиливается в естественных условиях формирования костной ткани с помощью hMSCs, а затем с помощью предкультурой в остеогенной среде 14. К тому же , аутологичной сгустка плазмы , как помост для доставки клеток можно легко манипулировать с помощью хирурга и формованные , чтобы соответствовать форме кости полости 13. Therefore, этот метод может быть очень полезным для тех исследователей и врачей, которые направлены на перевод их hMSC терапии на основе от скамьи к постели больного в ортопедической практике.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="920">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:235px;">Triple Select (1x)</td>
			<td style="width:301px;">GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td style="width:192px;">12563-029</td>
			<td style="width:193px;">cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypan blue stain&#160;</td>
			<td>GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>15250061</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM-LG, no glut, no phenol red</td>
			<td>GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>11880-028&#160;</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glutamax (100X)</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>35050038</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin Streptomycin sol.</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alamar Blue (AB)</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>DAL1025</td>
			<td>proliferation/viability assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-14440-02</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D-PBS&#160;</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">StemMACS AdipoDiff Media</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-091-677</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">StemMACS ChondroDiff Media</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-091-679</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">hMSC Osteogenicdiff BulletKit</td>
			<td>Euroclone&#160;</td>
			<td>LOPT3002</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vitamin C (ascorbic acid)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>ATC Code: A11GA01</td>
			<td>Pharmaceutical grade drug</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Flebocortid Richter (hydrocortisone)</td>
			<td>Aventis Pharma</td>
			<td>ATC Code: H02AB09</td>
			<td>Pharmaceutical grade drug</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Victor X3, reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2030 multilabel reader</td>
			<td>proliferation/viability assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Silver nitrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>209139</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pyrogallol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>16040</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Thiosulphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8503</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Histoplast LP</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>8332</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>32213</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2860</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nuclear fast red</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>60700</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formalin</td>
			<td>Bio-optica</td>
			<td>05-K01009-X40</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eosin B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>45260</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DPX</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>6522</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Haematoxylin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3136</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Aluminium Sulphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>202614</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xylol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>534056</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microtome</td>
			<td>Leika</td>
			<td></td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">May Grunwald</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>MG1L-1L</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Giemsa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>32884-250ML</td>
			<td>histological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Transfer bag</td>
			<td>Biom&#233;rieux</td>
			<td>BC0300031</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filtration kit</td>
			<td>Macopharma</td>
			<td>BC0800010</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium Gluconate</td>
			<td>Galenica Senese</td>
			<td></td>
			<td>Pharmaceutical grade drug</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bact Alert</td>
			<td>Biom&#233;rieux</td>
			<td>259790 anaerobic&#160;</td>
			<td>microbiological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bact Alert</td>
			<td>Biom&#233;rieux</td>
			<td>259789 aerobic&#160;</td>
			<td>microbiological assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Steryle Luer-Lok Syringe 50 ml</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>300865</td>
			<td>cell processing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heraeus Cryofuge 6000i</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>blood bag centrifuging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SL16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>blood tube centrifuging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mesenchymal stromal cell culture and delivery in autologous conditions: a smart approach for orthopedic applications

Человеческие клетки мезенхимальных стромальных (hMSCs) культивировали в пробирке с различными средами. Ограничения на их использование в клинических условиях, однако, в основном зависит от потенциальных биологически опасных и воспаление рисков, оказываемого ксеногенных питательными веществами для их культуры. Человеческие производные или рекомбинантные материалы являются первыми кандидатами выбор, чтобы уменьшить эти реакции. Таким образом, культура добавки и материалы аутологичных происхождения представляют лучшие питательные вещества и безопасные продукты. Здесь мы опишем новый протокол для изоляции и культуры hMSCs костного мозга в аутологичных условиях, а именно - пациента происхождения сыворотки в качестве дополнения для культуральной среды и фибрина в качестве каркаса для введения hMSC. В самом деле, hMSC / фибринового сгустка конструкции могут быть чрезвычайно полезны для нескольких клинических применений. В частности, мы ориентируемся на их использование в ортопедической хирургии, где тромб фибрина происходит от собственной крови донора разрешеноэффективной доставки клеток и питательных веществ / отходов обмены. Для обеспечения оптимальных условий безопасности, это крайне важно, чтобы избежать риска трансформации hMSC и разрастание ткани. По этим причинам подход , описанный в этой статье также указывает на минимально ех естественных условиях hMSC расширения, для уменьшения клеточного старения и морфологические изменения, а также краткосрочный костно-дифференциацию перед имплантацией, чтобы побудить остеогенной спецификации клонов, тем самым снижая риск последующего неконтролируемого пролиферации.

Получение аутологичной сыворотки Коагуляция, осуществляется путем добавления кальция глюконат в передаточное мешок, позволяет извлекать аутологичной сыворотки в больших количествах, как это требуется для культуры hMSC. В самом деле, с этой техникой, можно достичь до 200 мл сыворотки (рисунок 1). HMSC изоляция, культура и дифференциации с использованием аутологичной сыворотки Костные мононуклеарные клетки костного мозга выделяют с использованием градиента плотности, что приводит к промежуточному слою кольцевого (фиг.2А). Путем покрывать эти клетки и удаления прилипших них с промывкой, то можно изолировать hMSCs (рис 2б). При аутологичных условиях культивирования, подмножество клеток, называемых ПДКп, обнаруживаются при P0 и в процентах до тO 10%, в зависимости от вариабельности пациентов (Фигура 2В). ПДКп все еще присутствуют после replating (т.е. P1) , если протеаза используется для клеточного пассирования (фиг.2с). hMSCs выделяют и культивируют в аутологической обстановке поддерживать их способность дифференцироваться в направлении трех хорошо известных мезодермальных клонов (остеогенной, липогенный и хондрогенными). Дифференцирования анализы проводили для сравнения идентичности населения hMSC с результатами, полученными с использованием стандартных (nonautologous) условий культивирования. Как были выбраны функциональные анализы для этого протокола, фон Косса окрашивания, четырехокиси осми окрашивания и Альциановый Синей окрашивания при рН 1 вместо предложенным производителем дифференцировки (таблица материалов) (рис 2D). Подготовка, жизнеспособность и гистологическое характеристика MSC / фибринового сгустка конструкций <p class="jove_content" fo:keep-together.within-страница = &quot;1&quot;&gt; В hMSCs диспергируют в плазме, который сшивают глюконата кальция в 50 мл трубки, что приводит к образованию желе диска , окруженного его надосадочной жидкости (рис 3 , а ). Внутри этих плазменных сгустков, что hMSCs жизнеспособны, о чем свидетельствует изменение цвета Т24 красителя жизнеспособность клеток от синего (управления без клеток) до розового (cellularized тромб) (рис 3B). Жизнеспособность клеток внутри сгустка подтверждается с помощью окрашивания H &amp; E, показывая хорошо сохранившийся морфологии клеток (рис 3C). Кроме того, минимальный остеоиндукция как раз перед второй урожай клеток приводит к предварительным депонированием кальция Стимулируемой hMSCs (рис 3D). Колониеобразующих Unit Присутствие hMSC колоний через 2 недели в культуре показано с помощью анализа КОЕ-F (рисунок 4). s = &quot;jove_step&quot; ВОК: Keep-together.within-страницу = &quot;1&quot;&gt; Применение MSC / фибринового сгустка построить в костном несращения HMSC / фибринового сгустка конструкции , полученные , как описано в этом методе (этап 1.1) были успешно применены для лечения тяжелых верхних конечностей несращения в 8 сострадательных случаях 13. Долгосрочный (максимум 7,6 мес) оценки подтвердили успешные клинические и функциональные результаты для всех пациентов, без признаков разрастания ткани или образования опухоли. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/54845/54845fig1.jpg" /> Рисунок 1. Получение аутологичной сыворотки. (А) Устройство плазма переносится в сумке переноса с использованием шип; (В) Плазма коагулируют путем введения кальция глюконат через разъем порта; (C) гематоэнцефалический мешок центрифуга используется для отделения сыворотки./files/ftp_upload/54845/54845fig1large.jpg &quot;целевых =&quot; _blank &quot;&gt; Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. <img alt="фигура 2" src="/files/ftp_upload/54845/54845fig2.jpg" /> Рисунок 2. hMSC Изоляция, культуры и дифференцировка с использованием аутологичной сыворотки. (A) мононуклеарных клеток слой (в окне синей линии) , полученные после того, как костный мозг центрифугирование с градиентом плотности; (В) культуры клеток , как представляется , в P1; (С) клеточной культуре , как это кажется на P0 (первичная культура); (B - C) Стрелки показывают наличие MPCs в культуре MSC. Шкала бар составляет 100 мкм; (D) Гистохимические результаты мультилинейной дифференциации анализов. Остеогенная дифференциация оценивается с использованием фон Косса окрашивания для нанесения минеральной матрицы в черном, адипогенной дифференциации проявляется наличием жировых вакуолей, окрашенных в черный цвет с помощью осмия tetroxiде, и хондрогенный дифференциация отображается наличием гликозаминогликанов, которые окрашивают в голубой цвет по альциановым голубым окрашиванием при рН 1. Шкала бар составляет 50 мкм. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54845/54845fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54845/54845fig2large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54845/54845fig2large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/54845/54845fig3.jpg" /> Рисунок 3. Подготовка, Жизнеспособность и гистологические Характеристика MSC / фибринового сгустка конструктов. (A) / фибринового сгустка hMSC построить , как он появляется после сшивания; (B) Результаты AB - анализ: MSCs являются жизнеспособными внутри фибринового сгустка, о чем свидетельствует изменение цвета жизнеспособность клеток красителя (T24), от синего (контроль без клеток, справа) до розового (cellularized тромб, на оставил). (C - D) Гистохимические результаты hMSC / фибринового сгустка конструкций. Шкала бар50 мкм. (С) гематоксилином и эозином окрашивания показывая жизнеспособных клеток , внедренных в матрицу фибринового; (D) Минеральная матрица осаждения окрашенных в черный цвет на фон Косса окрашивания, что подтверждает первоначальную остеогенез. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54845/54845fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54845/54845fig3large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54845/54845fig3large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 4" src="/files/ftp_upload/54845/54845fig4.jpg" /> Рисунок 4. CFU-F анализа. Изображение колбе культивировали с hMSCs окрашивали методом May-Grunwald / Гимза. Увеличиваемую область представляет собой светло-микрофотография, показывающая морфологии колонии hMSC. Шкала бар составляет 100 мкм. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54845/54845fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54845/54845fig4large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54845/54845fig4large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> Рисунок 5. Применение hMSC / фибринового сгустка Построить в костном несращением. (A) рентгенография верхней конечности пациента , пострадавших от псевдоартрозов; (B) hMSC / фибринового сгустка конструкцию непосредственно перед имплантацией; (C) Хирургический применение hMSC / фибринового сгустка конструкции; (D) рентгенография верхней конечности одного и того же пациента через 5 лет. Эта цифра переиздана из Джианнотти С. и др. с минимальными изменениями 13. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54845/54845fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54845/54845fig5large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54845/54845fig5large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Mesenchymal Stromal Cell Culture and Delivery in Autologous Conditions: A Smart Approach for Orthopedic Applications at JoVE.com

Mesenchymal Stromal Cell Culture and Delivery in Autologous Conditions: A Smart Approach for Orthopedic Applications

Культивирование человеческих клеток мезенхимальных стромальных (hMSCs) с аутологичной сыворотки, снижает риск отторжения от ксеногенного материала и других негативных последствий. Она также позволяет для восстановления подмножества мезодермальных предшественниках, которые могут доставить свежие hMSCs. Встраивание hMSCs в аутологичных фибринового сгустка обеспечивает простой и эффективной хирургической имплантации.

Мезенхимальных стромальных Культура клеток и доставки в аутологичных условиях: Интеллектуальный подход для протезных применений

Human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) are cultured in vitro with different media. Limits on their use in clinical settings, however, mainly depend on ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Autologous Endothelial Progenitor Cell-Seeding Technology and Biocompatibility Testing For Cardiovascular Devices in Large Animal Model

Аутологичных эндотелиальных клеток-предшественников-Посев Технология и Биосовместимость Тестирование Для сердечно-сосудистой устройства в Большой Модель животных

Implantable cardiovascular devices are manufactured from artificial materials (e.g. titanium (Ti), expanded polytetrafluoroethylene), which pose the risk ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

Вращающийся культуре клеток системы по правам культуры клеток: Человеческие клетки трофобласта в качестве модели

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Подготовка 3D фибрина лесов для стволовых Приложения культуре клеток

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

Кожа Татуировка как новый подход для доставки ДНК-вакцин

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Строительные леса Self-отчетности для 3-Dimensional культуре клеток

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

Роман Растяжка Платформа для приложений в клеточной и тканевой Mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Свет-опосредованной Формирование и структурирование гидрогелей для клеточных культур

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Производство и поставка снадобья Применение шелкового наночастицами

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Улучшение 3D гидрогеля культур первичных глиальных клеток In Vitro моделирования Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Строительство многослойных мезенхимальных стволовых клеток листа с системой 3D динамичной культуры

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...