Name: evaluation of bioenergetic function in cerebral vascular endothelial cells
Uploaded: 2016-11-19T15:00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells at JoVE.com

This work was supported by the following grants: AHA 16SDG31170008 to X.R. and NIH P20 GM109098, P01 AG027956, and U54 GM104942 to J.W.S.

BEMÆRK: Ordningen af protokollen er vist i figur 1, herunder en tidslinje af procedurerne. 1. Kultur og Passage af CVE Cells <ol><li> Kultur CVE celler (bEnd.3 celler) i komplet vækstmedium (høj glucose Dulbeccos modificerede Eagles medium, DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin i en T75 cm2 vævskultur-kolbe. Vokse ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator. </li><li> Fjern og kassér cellekulturmediet. Skyl cellelaget med 0,25% trypsin-0,03% EDTA-opløsning, og derefter tilsættes 1 - 2 ud ml trypsin-EDTA-opløsning til kolben, og kolben holde ved 37 ° C i 3 - 5 min. Observere cellerne under et inverteret mikroskop indtil cellelaget er afmonteret. Tilsæt 10 ml komplet vækstmedium og aspireres cellerne ved forsigtigt pipettering. </li><li> Dekanteres væsken og cellerne i en 15-ml centrifugerør og centrifugering ved 700 xg i 5 minutter til fjernelse af cellerester. </li&gt; <li> Supernatanten fjernes fra centrifugerøret. Tilsæt 10 ml komplet vækstmedium og re-suspendere cellepelleten. Spin cellerne ved 700 x g i 5 min. </li><li> Supernatanten fjernes fra centrifugerøret. Resuspender cellepelleten i komplet vækstmedium i en koncentration på 2,0 x 10 5 celler / ml (bestemt ved tælling ved anvendelse af et hæmocytometer, udelukker døde celler ved trypan-blå-farvning). BEMÆRK: Frisk optøede celler subkultiveret i mindst 3 passager for eksperimenter. </li></ol> 2. Seed og behandle celler på cellekulturplader <ol><li> Seed celler på en 96-brønds ekstracellulære flux celledyrkningspladen: 80 uL / ​​brønd. Placer celledyrkningspladen ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator. Bemærk: 16 × 10 3 celler per brønd vil nå op på 60 - med 80% konfluens inden 24 timer. </li><li> Hvis cellerne bliver udsat for en kemisk, tilsæt de behandlinger, når cellerne er fæstnet til pladen bunden (8 - 24 timer efter seding). BEMÆRK: transfektionsforsøg, ikke tilføjer antibiotika i komplet vækstmedium. </li></ol> 3. Vurdering af mitokondrie-funktionen Brug af Bioanalyzer <ol><li> Forud for starten af assayet, hydrat en ekstracellulær flux sensor patron med kalibrant ved tilsætning 150 pi af ekstracellulær flux kalibrant løsning til pladen og inkubering O / N ved 37 ° C uden CO2. </li><li> Brug af skylleapparat station, ændre cellekulturmediet i pH 7,0 ekstracellulære flux assaymedium. Inkuber cellerne ved 37 ° C uden CO2 i 30 - 60 min. </li><li> Forbered arbejdsopløsninger af 8 uM oligomycin, 4,5 uM FCCP, 10 uM rotenon, og 10 uM antimycin i DMEM. Load 25 uL af stamopløsninger i patron injektion porte: Port A, oligomycin; Port B, FCCP; Port C, rotenon og antimycin med ekstracellulært flux assaymedium. Gennemføre assayprotokollen som beskrevet i tabel 1. </li><li> Læg hydreret patronen i Bioanalyzer og udføre kalibreringen ved at klikke på &quot;Start&quot; knappen. Efter kalibreringen er afsluttet, fjernes bundpladen patron og indlæse celle pladen ved at klikke på &quot;Unload Cartridge&quot; prompt. Fortsæt analysen indtil slutningen af ​​alle målinger. </li><li> Åbn datafilen og få de sats værdier fra Bioanalyzer. Eksportere data til et regneark fil. </li></ol> 4. Data Analyser BEMÆRK: Beregningerne for data analyser formuleres nedenfor. Værdierne fås fra Bioanalyzer instrument som OCR vist i figur 2. <ol><li> For at beregne Basal respiration, trække den ikke-mitokondrielle respiration (målinger 10 - 12) fra den basale værdi (måling 3). BEMÆRK: Basal respiration = Basal - ikke-mitokondrie respiration = Rate ③ - Pris ⑩ ~ ⑫. </li><li> For at beregne ATP productipå, trække den ATP-koblet respiration (målinger 4 - 6) fra den basale værdi (måling 3). BEMÆRK: ATP produktion = Basal - ATP-koblet respiration = Rate ③ - Pris ④ ~ ⑥. </li><li> For at beregne Maksimal respiration, trække den ikke-mitokondrielle respiration (målinger 10 - 12) fra Maximum respiration (målinger 7 - 9). BEMÆRK: Maksimal respiration = Maksimal respiration - ikke-mitokondrie respiration = Rate ⑦ ~ ​​⑨ - Pris ⑩ ~ ⑫. </li><li> For at beregne Uudnyttet kapacitet, trække den basale værdi (måling 3) fra Maximum respiration (målinger 7 - 9). BEMÆRK: Uudnyttet kapacitet = Maksimal respiration - Basal = Rate ⑦ ~ ​​⑨ - Rate ③. </li><li> For at beregne Proton læk, trække den ikke-mitokondrie respiration (måling 10-12) fra ATP-koblet respiration (måling 4). BEMÆRK: Proton læk = ATP-koblet respiration - ikke-mitokondrierl respiration = Rate ④ - Pris ⑩ ~ ⑫. </li></ol>

<ol>
	<li>Quintero, M., Colombo, S. L., Godfrey, A., Moncada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+as+signaling+organelles+in+the+vascular+endothelium.">Mitochondria as signaling organelles in the vascular endothelium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 5379-5384 (2006).</li><li>Liu, Y., Li, H., Bubolz, A. H., Zhang, D. X., Gutterman, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cytoskeletal+elements+are+critical+for+flow-mediated+dilation+in+human+coronary+arterioles.">Endothelial cytoskeletal elements are critical for flow-mediated dilation in human coronary arterioles.</a> Med Biol Eng Comput. 46, 469-478 (2008).</li><li>Al-Mehdi, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perinuclear+mitochondrial+clustering+creates+an+oxidant-rich+nuclear+domain+required+for+hypoxia-induced+transcription.">Perinuclear mitochondrial clustering creates an oxidant-rich nuclear domain required for hypoxia-induced transcription.</a> Sci Signal. 5, ra47 (2012).</li><li>Mironov, S. L., Ivannikov, M. V., Johansson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Ca2+]i+signaling+between+mitochondria+and+endoplasmic+reticulum+in+neurons+is+regulated+by+microtubules.+From+mitochondrial+permeability+transition+pore+to+Ca2+-induced+Ca2++release.">[Ca2+]i signaling between mitochondria and endoplasmic reticulum in neurons is regulated by microtubules. From mitochondrial permeability transition pore to Ca2+-induced Ca2+ release.</a> J Biol Chem. 280, 715-721 (2005).</li><li>Sutendra, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Nogo+and+the+mitochondria-endoplasmic+reticulum+unit+in+pulmonary+hypertension.">The role of Nogo and the mitochondria-endoplasmic reticulum unit in pulmonary hypertension.</a> Sci Transl Med. 3, 88ra55 (2011).</li><li>Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hyperfused+mitochondrial+state+achieved+at+G1-S+regulates+cyclin+E+buildup+and+entry+into+S+phase.">A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11960-11965 (2009).</li><li>Doll, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+crisis+in+cerebrovascular+endothelial+cells+opens+the+blood-brain+barrier.">Mitochondrial crisis in cerebrovascular endothelial cells opens the blood-brain barrier.</a> Stroke. 46, 1681-1689 (2015).</li><li>Ren, X., Simpkins, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+Blood-Brain+Barrier+Damage+in+Stroke:+Mitochondrial+Mechanism.">Deciphering the Blood-Brain Barrier Damage in Stroke: Mitochondrial Mechanism.</a> J Neuroinfect Dis. S2, e002 (2015).</li><li>Pun, P. B., Lu, J., Moochhala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+ROS+in+BBB+dysfunction.">Involvement of ROS in BBB dysfunction.</a> Free Radic Res. 43, 348-364 (2009).</li><li>Sun, J., Hu, H., Ren, X., Simpkins, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tert-butylhydroquinone+compromises+survival+in+murine+experimental+stroke.">Tert-butylhydroquinone compromises survival in murine experimental stroke.</a> Neurotoxicol Teratol. 54, 15-21 (2016).</li><li>Modis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+bioenergetics+is+regulated+by+PARP1+under+resting+conditions+and+during+oxidative+stress.">Cellular bioenergetics is regulated by PARP1 under resting conditions and during oxidative stress.</a> Biochem Pharmacol. 83, 633-643 (2012).</li><li>Brown, R. C., Morris, A. P., O'Neil, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+junction+protein+expression+and+barrier+properties+of+immortalized+mouse+brain+microvessel+endothelial+cells.">Tight junction protein expression and barrier properties of immortalized mouse brain microvessel endothelial cells.</a> Brain Res. 1130, 17-30 (2007).</li><li>Bukeirat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiR-34a+regulates+blood-brain+barrier+permeability+and+mitochondrial+function+by+targeting+cytochrome+c.">MiR-34a regulates blood-brain barrier permeability and mitochondrial function by targeting cytochrome c.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 36, 387-392 (2016).</li><li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Impairment+in+Cerebrovascular+Endothelial+Cells+is+Involved+in+the+Correlation+between+Body+Temperature+and+Stroke+Severity.">Mitochondrial Impairment in Cerebrovascular Endothelial Cells is Involved in the Correlation between Body Temperature and Stroke Severity.</a> Aging Dis. 7, 14-27 (2016).</li><li>Oldendorf, W. H., Cornford, M. E., Brown, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+large+apparent+work+capability+of+the+blood-brain+barrier:+a+study+of+the+mitochondrial+content+of+capillary+endothelial+cells+in+brain+and+other+tissues+of+the+rat.">The large apparent work capability of the blood-brain barrier: a study of the mitochondrial content of capillary endothelial cells in brain and other tissues of the rat.</a> Ann Neurol. 1, 409-417 (1977).</li><li>Oldendorf, W. H., Brown, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Greater+number+of+capillary+endothelial+cell+mitochondria+in+brain+than+in+muscle.">Greater number of capillary endothelial cell mitochondria in brain than in muscle.</a> Proc Soc Exp Biol Med. 149, 736-738 (1975).</li><li>Kaczara, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+monoxide+released+by+CORM-401+uncouples+mitochondrial+respiration+and+inhibits+glycolysis+in+endothelial+cells:+A+role+for+mitoBKCa+channels.">Carbon monoxide released by CORM-401 uncouples mitochondrial respiration and inhibits glycolysis in endothelial cells: A role for mitoBKCa channels.</a> Biochim Biophys Acta. 1847, 1297-1309 (2015).</li><li>Bharadwaj, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+respirometric+assessment+of+mitochondria+isolated+from+skeletal+muscle+tissue+obtained+by+percutaneous+needle+biopsy.">Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy.</a> J Vis Exp. (96), e52350 (2015).</li></ol>

The authors declare no potential conflicts of interest with respect to the research, authorship, and/or publication of this article. Open Access fees for this article were provided by Agilent Technologies.

Denne protokol er en fremgangsmåde til evaluering af den bioenergetic fænotype i cerebrale vaskulære endotelceller. Det tjener som en grundlæggende analyse for endotelcellen mitokondrie evaluering, og det er optimalt for eksperimenter designet til at undersøge mekanismerne i stimuli, der kan påvirke mitochondrial signalvejen i CVE-celler. Det giver også en fremgangsmåde til testning potentielle lægemidler for BBB-afbrydelse-associerede sygdomme. Kritiske trin i protokollen Ekstracellulære flux bioanalyzers har evnen til at måle OCR i realtid. I dette assay at identificere den passende celledensitet er kritisk. Hvis celledensiteten er under 8 × 10 3 celler per brønd, den basale OCR er for lav til at blive analyseret (figur 2 og figur 3); hvis celledensiteten er over 32 × 10 3 celler pr, behøver cellerne ikke reagerer på oligomycin eller FCCP treatmeNTS (figur 2 og figur 3). Den optimale celledensitet for denne cellelinie i vores eksperimentelle model er 16 × 10 3 celler per brønd, hvilket viser reproducerbare resultater og følsomhed over for stimuli 7 og behandlinger 10,14. Hvis der anvendes en 24-brønds Bioanalyzer vil nye titreringer af celledensiteten være nødvendig til assayet. Det er dokumenteret, at CVEs har et stort volumen af mitokondrier i forhold til andre endotelceller eller vævstyper 15,16, hvilket tyder på behovet for større energiproduktion og færre celler til måling bioenergetik metabolisme. Vi har testet flere typer af hjerne endotelceller, såsom primære og udødeliggjorte murine cerebrovaskulære endotelceller 7 og immortaliserede humane cerebrovaskulære endotelceller (upublicerede data). Disse celler krævede lignende celledensiteter at nå acceptable OCR (basal respiration OCR placeret inden for 40 - 160 pmol / min for96-brønds plader og over 50 - 400 pmol / min i 24-brønds plader), når bioenergetik assay blev udført. Kaczara et al. Rapporterede måling bioenergetic metabolisme i humane navlevene-endotelceller (HUVEC), der anvendte en højere celletæthed 17. Vores gruppe ikke vurdere fartøj celler fra andre væv eller organer. Teoretisk set kunne det Bioanalyzer potentielt anvendes på enhver celletype, men det kræver optimere analysen for celledensiteten, celledyrkningsmediet, og dyrkningsbetingelser (nogle specifikke celler kan kræve belagte plader at vokse godt). Det kræves, at forsøgene gennemført for at sikre OCR sats er inden for det acceptable interval. Hvis OCR i endotelceller fra andre organer er lavere end CVEs fra hjerner, øge celledensiteten kan hjælpe med at få inden for et acceptabelt OCR interval. Alternativt, hvis celler ikke bruger oxidativ fosforylering som deres vigtigste kilde til energi, Bioanalyzer ville ikke være en optimal assay. Den Bioanalyzer giver mulighed for den sekventielle afbrydelse af elektron transportkæden, baseret på den rækkefølge, som reagenserne anvendes. Først bliver oligomycin anvendes, som inhiberer mitokondrie Complex V (ATP syntase). For det andet, FCCP, en elektron afkobleren, anvendes, hvilket fører til afbrydelse af proton gradient. Endelig rotenon og antimycin A, som inhiberer mitochondrial Komplekser I og III, henholdsvis anvendes til at føre til en total inhibering af elektronstrøm. Rækkefølgen af ​​lægemiddeleksponering er afgørende, fordi lægemidlerne blokerer specifikke elektrontransportkæden reaktion, og kan måles de sekventielle ændringer for at afspejle den mitokondriefunktionen. Ændringer og fejlfinding Til bedømmelse mitochondrial reaktion på stimuli i CVE celler, anbefales det, at de stimuli påføres celler efter cellerne er klæbet til celledyrkningspladen bund (se tidslinjenvist i figur 1; det normalt tager mindst 6 h). At opnå reproducerbare resultater ved behandlinger, er det yderst vigtigt at holde celledensiteten konsekvent. Hvis forbehandlinger er udformet før cellepodning, bør celletæthed for hvert forbehandling nøje målt, eksklusive de døde celler til podning. Hvis transfektion er inkluderet i den eksperimentelle design, henvises til producentens transfektion protokol. Demonstreret i data præsenteret i figur 4, blev MIR-34a transficeret i CVE celler under anvendelse af en lipofectamin transfektion kit, som kræver antibiotika-fri celledyrkningsmedium og et mito-stresstest til at vurdere ændringer i metabolisk funktion med overekspression af MIR-34a . Doserne af plasmid kan også optimeres, som tidligere offentliggjort 13.. En anden ændring, der kan gøres til protokollen ændrer koncentrationen af ​​reagenserne. En titreringskurve for oligomycin, FCCP, og / eller rotenon og antimycin kan være kompleted. Desuden, hvis dette assay anvendes til high throughput analyser af forskellige stoffer, foreslås det at inkludere en parallel analyse til måling af cellelevedygtigheden og celleproliferation, der blev beskrevet i vores tidligere publikationer 7,13. OCR værdier er signifikant påvirket af celleantal (figur 2 og 3), og celleproliferationen og levedygtighed assays gavn normalisering af dataene. Men færdiggørelsen af ​​disse analyser er skøn enkelte laboratorium. Begrænsninger af teknikken Den største begrænsning ved denne protokol er, at vi kun anvendes en in vitro cellekultur-model i undersøgelsen. I øjeblikket er der ingen ledige ex vivo modeller eller dyremodeller, der kan løse endotelceller mitokondriefunktionen. Forventes nye modeller skal udvikles til vurdering af bioenergetic funktion in vivo og <em&gt; ex vivo i fremtidige studier. En anden begrænsning er udvidelsen af ​​barrieren vurderingerne efter de bioenergetik foranstaltninger. kan ikke udføres forsøgene første fordi efter afslutningen af ​​de bioenergetic målinger, cellelevedygtigheden mindskes efter fuldstændig afbrydelse af elektrontransportkæden; sekunder, er specifikke cellekultur plader og indsatser der kræves for at opdage bioenergetik værdier, og ikke passer indsatse til vurderinger barriere. Derfor er der ikke mange funktionelle assays, der kan opfyldes efter bioenergetik analysen. Det forventes dog, at der kan udvikles særlige enheder til at udføre funktionelle assays forud for bioenergetik analysen. Betydningen af ​​Teknik med Respekt for eksisterende / Alternative Metoder Tidligere teknikker til at evaluere mitokondriefunktion nødvendiggjorde isolering af mitokondrier fra cellerne 18. Denne new teknik under anvendelse af Bioanalyzer muliggør måling af mitokondriel aktivitet i intakte celler, som bevarer mere af det cellulære miljø end evaluere isolerede mitokondrier. Fremtidige Programmer eller vejvisning efter Mastering Denne teknik Denne protokol er designet og udviklet til bEnd.3 cellelinie, men det er også kompatibel med primær cerebral vaskulær endotel (pCVE) -celler 7 eller andre endotel, og vi har demonstreret dette i vores tidligere publikation hjælp pCVE celler 7. Når der anvendes andre typer af endotel, kan kræves coatingen af ​​dyrkningspladen og anvendelse af vækstfaktorer. Imidlertid anbefales, titreringen assay for andre celletyper samt. Denne protokol giver en generel metode, der skal vedtages i evalueringen af ​​de bioenergetik af CVE celler, og det kan yderligere anvendes til mekanisme undersøgelser eller terapeutiske reaktioner på denne måde.

Det er almindeligt anerkendt, at blod-hjerne-barrieren (BBB) ​​er dannet af cerebral vaskulær endotel (CVE) celler har meget forskellige og unikke funktioner altoverskyggende til vaskulær biologi. Disse endotelceller bruger mitokondrier til at generere det meste af den cellulære levering af adenosintriphosphat (ATP) som kilde til kemisk energi. Ud over at give ATP for CVE celler, mitokondrier regulerer forskellige cellulære processer i vaskulære endotelceller, såsom cellulær signalering 1-4, apoptose 5, og kontrollen af cellecyklussen og cellevækst 6. Dysregulering af mitokondrie bioenergetic funktion i CVE celler kan påvirke mitochondrial biogenese, hvilket fører til nedsat vaskulær endotel-aktivitet, og forværrer cerebrovaskulære sygdomme og neurodegenerative lidelser, f.eks slagtilfælde 7,8 og Alzheimers sygdom (AD) 9. Vi har vist, at fornærmelser til CVE celler efter udsættelse for lipopolysacsaccharidhydrokolloid (LPS) forringe mitokondrie funktion i CVE celler og forværre slagtilfælde resultater 7. Tert.butylhydroquinon (tBHQ) forøger dødeligheden slagtilfælde ved at interferere med oxidativ phosphorylering i CVE celler 10. Derfor er den kvantitative model af bioenergetic funktion i CVE celler ikke kun piloter en serie af mekanisme-relaterede undersøgelser for centralnervesystemet (CNS) sygdomme, men også giver et gennembrud i medicin screening af lægemidler rettet mod mitokondrie funktion i vaskulær biologi. Isolerede mitokondrier er blevet anvendt til at måle bioenergetic funktion. Vi 7 og andre 11 har rapporteret vurderinger af cellulære bioenergetik i intakte CVE celler ved hjælp af en ekstracellulær flux Bioanalyzer. Analysatoren tilvejebringer fordelen af ​​endogent cellulært bioenergetic vurdering. Dette følsomme og konsekvent assay måler den mitokondrielle metabolisme af CVE celler og kan anvendes til at evaluere bioenergetic forringelse ved stimuli, undersøge mekanismerne i mitokondrielle signalveje, og skærmen medicin eller behandlinger, der påvirker mitokondrie funktion i CVE celler. Den Oxygen Forbrug Rate (OCR) registreres af Bioanalyzer hjælp af en farmakologisk profilering tilgang ved at kombinere anvendelsen af ​​fire mitokondrie stoffer: oligomycin, carbonyl cyanid-4 (trifluormethoxy) phenylhydrazon (FCCP), rotenon, og antimycin A. I denne protokol, vi detalje en optimeret tilgang, der giver mulighed for måling og beregning af mitokondrie funktionelle parametre i CVE celler, herunder basal mitokondrie respiration ATP produktion, proton lækage, maksimal respiration, og reservedele respiratorisk kapacitet, i en enkelt analyse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="840">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">bEnd.3 cell line</td>
			<td style="width:147px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-2299</td>
			<td style="width:197px;">25-30 passages</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:147px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:147px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">S12450</td>
			<td>10% in final</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Penicillin/Steptomycin</td>
			<td style="width:147px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SV30010</td>
			<td>1&#215;100 stocking</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">0.25% trypsin 0.03% EDTA solution</td>
			<td style="width:147px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:147px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-000-CI</td>
			<td>1.0 &#181;M in final</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Glucose</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CAS 50-99-7</td>
			<td>25 mM in final</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">O4876</td>
			<td>1.0 &#181;M in final</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Carbonilcyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C2920</td>
			<td>0.5 &#181;M in final</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Rotenone</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R8875</td>
			<td>1.0 &#181;M in final</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CAS 1397-94-0</td>
			<td>1.0 &#181;M in final</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Plate wash station</td>
			<td style="width:147px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Extracellular flux bioanayzer&#160;&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">XFe96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Extracellular flux cell culture plate</td>
			<td style="width:147px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">102416-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Extracellular flux sensor cartridge</td>
			<td style="width:147px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">102416-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Extracellular flux calibrant solution</td>
			<td style="width:147px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">100840-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Extracellular flux assay medium</td>
			<td style="width:147px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">102365-100</td>
			<td>PH buffered prior to assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of bioenergetic function in cerebral vascular endothelial cells

Integriteten af ​​blod-hjerne-barrieren (BBB) ​​er kritisk for at forhindre hjerneskade. Cerebral vaskulær endotel (CVE) celler er en af ​​de celletyper, der omfatter BBB; disse celler har en meget høj energi efterspørgsel, hvilket kræver optimal mitokondriefunktionen. I tilfælde af sygdom eller beskadigelse, kan den mitokondrielle funktion i disse celler ændres, hvilket resulterer i sygdom eller indledningen af ​​BBB. I dette manuskript, introducerer vi en metode til at måle mitokondrisk funktion i CVE celler ved anvendelse af hele, intakte celler og en Bioanalyzer. En mito-stress assay anvendes til at udfordre de celler, der er blevet forstyrret, enten fysisk eller kemisk, og vurdere deres bioenergetic funktion. Desuden er denne metode giver også en nyttig måde at screene nye lægemidler, der har direkte indvirkning på mitokondriefunktionen. Vi har optimeret celledensiteten nødvendig til opnåelse iltforbrug priser, der giver mulighed for beregning af en række mitokondriel parameter, herunder ATP produktion, maksimal respiration, og reservekapacitet. Vi viser også følsomheden af ​​assayet ved at påvise, at indførelsen af ​​microRNA, MIR-34a, fører til en udtalt og påviseligt fald i mitochondrial aktivitet. Mens de i dette papir data er optimeret til bEnd.3 cellelinien, har vi også optimeret protokollen for primære CVE celler, hvilket yderligere antyder anvendeligheden i prækliniske og kliniske modeller.

For at vurdere bioenergetic funktion CVE celler som reaktion på oxidativ stress, vi valgte murine hjerne mikrovaskulære endotel cellelinie bEnd.3, som viser de samme komparative barriereegenskaber som primær hjerne mikrovaskulære endotelceller 12. Da kinetikken og relativ intensitet af respons varieres blandt de forskellige celletyper, blev den første serie eksperimenter designet til at opnå målelige OCR-niveauer ved at identificere det optimale antal bEnd.3 celler til anvendelse i assayet til metabolisk profilering, der er vist i Figur 2. Efter evalueringen, er de data, kvantificeres og præsenteres i figur 3. Basal respiration, maksimal respiration, og overskydende respiratorisk kapacitet viste en proportional reaktion med celletæthed. Faldt imidlertid ATP-produktion, når 64 x 10 3 celler pr brønd blev valgt, hvilket antyder, at over-sammenflydende cellekulturikke egnet til dette eksperiment. De optimale celledensiteter opstår mellem 8-32 × 10 3 celler per brønd, baseret på svar på mitokondrielle stoffer. For efterfølgende eksperimenter blev en podning densitet på 16 × 10 3 celler pr brønd anvendes til at muliggøre optimal detektering af ændringer i OCR. Brug af 16 × 10 3 celler per brønd, observerede vi de forventede responser i OCR og viste, at microRNA MIR-34a reducerer mitokondrisk funktion i CVE celler (figur 4). Vi har tidligere rapporteret, at MIR-34a reduceret oxidativ phosphorylering i disse celler 13. De gentagne forsøg viste også, at maksimal respiration og uudnyttede kapacitet blev signifikant reduceret ved overekspression af MIR-34a i CVEs ved 24 timer efter transfektion, selv om den basale respiration, ATP-produktion, og proton læk havde ingen signifikante ændringer (figur 4) . disse datademonstrere følsomhed Bioanalyzer at konstatere ændringer i mitokondrisk funktion i CVEs. <img alt="figur 1" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig1.jpg" /> Figur 1. Strategisk planlægning for eksperimentet. Tidslinjen for cellen, plade, og forberedelse patron er angivet. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig2.jpg" /> Figur 2. Repræsentant Raw Data bioenergetic Funktion i CVE Celler med forskellige celledensiteter. Iltforbrug blev målt i CVE celler med forskellige celledensiteter. Data repræsenterer middelværdi ± SD (n = 5); OCR: Oxygen Consumption Pris; FCCP: carbonyl cyanid-4- (trifluormethoxy) phenylhydrazon;<html> Rot / Anti-A: rotenon og antimycin A. ①, ②, og ③ indikerer basal respiration; ④, ⑤, og ⑥ indikerer ATP forbundet respiration; ⑦, ⑧ og ⑨ angiver maksimal respiration; ⑩, ⑪ og ⑫ indikerer ikke-mitokondrie respiration. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig3.jpg" /> Figur 3. Repræsentative resultater af bioenergetic Funktion i CVE Celler med forskellige celledensiteter. Basal åndedræt, ATP produktions-, maksimal åndedræt, og reservekapacitet beregnes ud fra de rå data fra de bioenergetik funktionel analyse i figur 2 ved hjælp af formlerne angivet i afsnit 4 . Dataene repræsenterer middelværdi ± SD (n = 5); OCR: Oxygen Consumption Rate.<html> f = &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Klik her for at se en større version af dette tal. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig4.jpg" /> Figur 4: Repræsentative resultater af Nedsat bioenergetic funktion ved miR-34a (A) Rådata af mitokondriefunktionen efter overekspression af miR-34a ved 24 timer efter transfektion.. (B) Basal respiration ATP produktion, maksimal respiration, og ledig kapacitet beregnes ud fra de rå data fra de bioenergetik funktionel assay i figur 4A; parametrene beregnes efter formlerne i afsnit 4. Overekspression af miR-34a reducerer mitokondrie funktion i CVE celler ved 24 timer efter transfektion. Data repræsenterer middelværdi ± SD (n = 5); OCR: Oxygen Consumption Rate. ****, P &lt;0,0001.filer / ftp_upload / 54.847 / 54847fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik her for at se en større version af dette tal. <img alt="tabel 1" src="/files/ftp_upload/54847/54847table1.jpg" /> Tabel 1. Instrument Run protokol.

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells at JoVE.com

Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

Endotelcelle mitokondrier er kritiske for at opretholde blod-hjerne-barrieren integritet. Vi introducerer en protokol til at måle bioenergetic funktion i cerebrale vaskulære endotelceller.

Evaluering af bioenergetic Funktion i cerebrale vaskulære endotelceller

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dobbelte Elektrofysiologiske Optagelser af synaptisk-evoked astrogliale og Neuronal respons i Akut hippocampusskiver

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

Isolering af Primary Murine Brain mikrovaskulære endotelceller

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Kvantificering af cerebral vaskulær arkitektur ved hjælp af to-foton mikroskopi i en musemodel af HIV-induceret Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Imaging Serotonerge Fibers i Mouse Spinal Cord Brug af CLARITY / CUBIC Teknik

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

Samtidig Evaluering af Cerebral Hæmodynamik og lysspredning Egenskaber for<em&gt; In vivo</em&gt; Rottehjerne ved brug af multispektral diffus refleksionsbilleddannelse

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional ...

Rat Model of Widespread Cerebral Cortical Demyelination Induced by an Intracerebral Injection of Pro-Inflammatory Cytokines

Rottemodel af udbredt cerebral kortikal demyelinering induceret af en intracerebral injektion af proinflammatoriske cytokiner

Multiple sclerosis (MS) is the most common immune-mediated disease of the central nervous system (CNS) and progressively leads to physical disability and ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

I Vivo Calcium billeddannelse af laterale-line hårcellerne i larve zebrafisk

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

Isolering af primære Murine skeletmuskulatur mikrovaskulære Endothelial Cells

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...