Name: evaluation of bioenergetic function in cerebral vascular endothelial cells
Uploaded: 2016-11-19T15:00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells at JoVE.com

This work was supported by the following grants: AHA 16SDG31170008 to X.R. and NIH P20 GM109098, P01 AG027956, and U54 GM104942 to J.W.S.

MERK: Ordningen med protokollen er vist i figur 1, inkludert en tidslinje av prosedyrene. 1. Kultur og Passage av CVE Cells <ol><li> Kultur CVE celler (bEnd.3 celler) i fullstendig dyrkningsmedium (høy glukose Dulbeccos modifiserte Eagles medium, DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin i en T75 cm2 vevskulturkolbe. Vokse ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator. </li><li> Fjern og kast cellekulturmedium. Skyll celle laget med 0,25% trypsin-0,03% EDTA-oppløsning, og deretter legge til 1 - 2 ml Trypsin-EDTA-løsning til kolben og holde kolben ved 37 ° C i 3 - 5 min. Observere cellene i henhold til et invertert mikroskop inntil cellelaget er frittliggende. Tilsett 10 ml komplett vekstmedium og aspireres cellene ved forsiktig pipettering. </li><li> Dekanter væsken og celler i en 15-mL sentrifugerør og sentrifugering ved 700 xg i 5 minutter for å fjerne cellulært nedbrytningsmateriale. </li&gt; <li> Kast supernatanten fra sentrifugerøret. Tilsett 10 ml komplett vekstmedium og re-suspen cellepelleten. Spinn cellene ved 700 xg i 5 min. </li><li> Kast supernatanten fra sentrifugerøret. Re-suspen cellepelleten i fullstendig vekstmedium ved en konsentrasjon på 2,0 x 10 5 celler / ml (bestemt ved telling ved anvendelse av et hemocytometer; ekskludere døde celler av Trypan-blått-farging). MERK: Freshly-tinte celler er sub-dyrket i minst 3 passasjer for eksperimenter. </li></ol> 2. Seed og behandle cellene på cellekultur plater <ol><li> Frø celler på en 96-brønners ekstracellulære fluks cellekulturplate: 80 pl / brønn. Plasser cellekulturplaten ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator. Merk: 16 x 10 3 celler per brønn vil nå 60-80% konfluens innen 24 timer. </li><li> Dersom cellene blir utsatt for et kjemisk, tilsett behandlingene når cellene er festet til platen bunnen (8 - 24 timer etter serding). MERK: For transfeksjon eksperimenter, ikke legg antibiotika i fullstendig vekstmedium. </li></ol> 3. Vurdering av mitokondriefunksjon Bruke Bioanalyzer <ol><li> Før starten av analysen, hydratisere et ekstracellulært fluks sensor patron med kalibrerings ved å tilsette 150 ul av ekstracellulær fluks kalibreringsløsning til platen og inkubering O / N ved 37 ° C uten CO2. </li><li> Ved hjelp av platevasker stasjon, endrer cellekulturmediet til pH 7,0 ekstracellulære fluksen analysemedium. Inkuber cellene ved 37 ° C uten CO2 i 30 - 60 min. </li><li> Forbered arbeidsløsninger av 8 mikrometer oligomycin, 4,5 mikrometer FCCP, 10 mikrometer rotenon, og 10 mm antimycin i DMEM. Load 25 mL av stamløsninger i patroninjeksjonsporter: Port A, oligomycin; Port B, FCCP; Port C, rotenon og antimycin med ekstracellulære flux analysemedium. Gjennomføre analyseprotokollen som beskrevet i tabell 1. </li><li> Last inn hydrert kassetten inn i Bioanalyzer og utføre kalibreringen ved å klikke på &quot;Start&quot; -knappen. Etter kalibreringen er fullført, fjerner patronen bunnplate og legg i celleplaten ved å klikke på &quot;Losse Cartridge&quot; spørsmål. Fortsett analysen til slutten av alle målinger. </li><li> Åpne datafilen og få de frekvensen fra Bioanalyzer. Eksportere dataene til et regneark-fil. </li></ol> 4. Data Analyser MERK: Beregningene for dataanalyser er formulert nedenfor. Verdiene er oppnådd fra Bioanalyzer instrument som OCR presentert i figur 2. <ol><li> For å beregne Basal åndedrett, trekker den ikke-mitokondrie respirasjon (målinger 10 - 12) fra basal verdi (måle 3). MERK: Basal respirasjon = Basal - ikke-mitokondriell respirasjon = Stem ③ - Ranger ⑩ ~ ⑫. </li><li> For å beregne ATP productipå, trekke fra ATP-linked respirasjon (målinger 4 - 6) fra basal verdi (måle 3). MERK: ATP produksjon = Basal - ATP-linked respirasjon = Stem ③ - Ranger ④ ~ ⑥. </li><li> For å beregne maksimal respirasjon, trekker den ikke-mitokondrie respirasjon (målinger 10 - 12) fra Maximum respirasjon (målinger 7 - 9). MERK: Maksimal åndedrett = Maksimal åndedrett - ikke-mitokondriell respirasjon = Stem ⑦ ~ ⑨ - Ranger ⑩ ~ ⑫. </li><li> For å beregne Ledig kapasitet, trekke fra basal verdi (måling 3) fra Maximum respirasjon (målinger 7 - 9). MERK: Ledig kapasitet = Maksimal respirasjon - Basal = Stem ⑦ ~ ⑨ - Ranger ③. </li><li> For å beregne Proton lekkasje, subtrahere den ikke-mitokondriell respirasjon (måling 10 - 12) fra den ATP-bundne respirasjon (måling 4). MERK: Proton lekkasje = ATP-linked åndedrett - ikke-mitochondrial respirasjon = Gi ④ - Ranger ⑩ ~ ⑫. </li></ol>

<ol>
	<li>Quintero, M., Colombo, S. L., Godfrey, A., Moncada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+as+signaling+organelles+in+the+vascular+endothelium.">Mitochondria as signaling organelles in the vascular endothelium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 5379-5384 (2006).</li><li>Liu, Y., Li, H., Bubolz, A. H., Zhang, D. X., Gutterman, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cytoskeletal+elements+are+critical+for+flow-mediated+dilation+in+human+coronary+arterioles.">Endothelial cytoskeletal elements are critical for flow-mediated dilation in human coronary arterioles.</a> Med Biol Eng Comput. 46, 469-478 (2008).</li><li>Al-Mehdi, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perinuclear+mitochondrial+clustering+creates+an+oxidant-rich+nuclear+domain+required+for+hypoxia-induced+transcription.">Perinuclear mitochondrial clustering creates an oxidant-rich nuclear domain required for hypoxia-induced transcription.</a> Sci Signal. 5, ra47 (2012).</li><li>Mironov, S. L., Ivannikov, M. V., Johansson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Ca2+]i+signaling+between+mitochondria+and+endoplasmic+reticulum+in+neurons+is+regulated+by+microtubules.+From+mitochondrial+permeability+transition+pore+to+Ca2+-induced+Ca2++release.">[Ca2+]i signaling between mitochondria and endoplasmic reticulum in neurons is regulated by microtubules. From mitochondrial permeability transition pore to Ca2+-induced Ca2+ release.</a> J Biol Chem. 280, 715-721 (2005).</li><li>Sutendra, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Nogo+and+the+mitochondria-endoplasmic+reticulum+unit+in+pulmonary+hypertension.">The role of Nogo and the mitochondria-endoplasmic reticulum unit in pulmonary hypertension.</a> Sci Transl Med. 3, 88ra55 (2011).</li><li>Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hyperfused+mitochondrial+state+achieved+at+G1-S+regulates+cyclin+E+buildup+and+entry+into+S+phase.">A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11960-11965 (2009).</li><li>Doll, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+crisis+in+cerebrovascular+endothelial+cells+opens+the+blood-brain+barrier.">Mitochondrial crisis in cerebrovascular endothelial cells opens the blood-brain barrier.</a> Stroke. 46, 1681-1689 (2015).</li><li>Ren, X., Simpkins, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+Blood-Brain+Barrier+Damage+in+Stroke:+Mitochondrial+Mechanism.">Deciphering the Blood-Brain Barrier Damage in Stroke: Mitochondrial Mechanism.</a> J Neuroinfect Dis. S2, e002 (2015).</li><li>Pun, P. B., Lu, J., Moochhala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+ROS+in+BBB+dysfunction.">Involvement of ROS in BBB dysfunction.</a> Free Radic Res. 43, 348-364 (2009).</li><li>Sun, J., Hu, H., Ren, X., Simpkins, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tert-butylhydroquinone+compromises+survival+in+murine+experimental+stroke.">Tert-butylhydroquinone compromises survival in murine experimental stroke.</a> Neurotoxicol Teratol. 54, 15-21 (2016).</li><li>Modis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+bioenergetics+is+regulated+by+PARP1+under+resting+conditions+and+during+oxidative+stress.">Cellular bioenergetics is regulated by PARP1 under resting conditions and during oxidative stress.</a> Biochem Pharmacol. 83, 633-643 (2012).</li><li>Brown, R. C., Morris, A. P., O'Neil, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+junction+protein+expression+and+barrier+properties+of+immortalized+mouse+brain+microvessel+endothelial+cells.">Tight junction protein expression and barrier properties of immortalized mouse brain microvessel endothelial cells.</a> Brain Res. 1130, 17-30 (2007).</li><li>Bukeirat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiR-34a+regulates+blood-brain+barrier+permeability+and+mitochondrial+function+by+targeting+cytochrome+c.">MiR-34a regulates blood-brain barrier permeability and mitochondrial function by targeting cytochrome c.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 36, 387-392 (2016).</li><li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Impairment+in+Cerebrovascular+Endothelial+Cells+is+Involved+in+the+Correlation+between+Body+Temperature+and+Stroke+Severity.">Mitochondrial Impairment in Cerebrovascular Endothelial Cells is Involved in the Correlation between Body Temperature and Stroke Severity.</a> Aging Dis. 7, 14-27 (2016).</li><li>Oldendorf, W. H., Cornford, M. E., Brown, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+large+apparent+work+capability+of+the+blood-brain+barrier:+a+study+of+the+mitochondrial+content+of+capillary+endothelial+cells+in+brain+and+other+tissues+of+the+rat.">The large apparent work capability of the blood-brain barrier: a study of the mitochondrial content of capillary endothelial cells in brain and other tissues of the rat.</a> Ann Neurol. 1, 409-417 (1977).</li><li>Oldendorf, W. H., Brown, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Greater+number+of+capillary+endothelial+cell+mitochondria+in+brain+than+in+muscle.">Greater number of capillary endothelial cell mitochondria in brain than in muscle.</a> Proc Soc Exp Biol Med. 149, 736-738 (1975).</li><li>Kaczara, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+monoxide+released+by+CORM-401+uncouples+mitochondrial+respiration+and+inhibits+glycolysis+in+endothelial+cells:+A+role+for+mitoBKCa+channels.">Carbon monoxide released by CORM-401 uncouples mitochondrial respiration and inhibits glycolysis in endothelial cells: A role for mitoBKCa channels.</a> Biochim Biophys Acta. 1847, 1297-1309 (2015).</li><li>Bharadwaj, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+respirometric+assessment+of+mitochondria+isolated+from+skeletal+muscle+tissue+obtained+by+percutaneous+needle+biopsy.">Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy.</a> J Vis Exp. (96), e52350 (2015).</li></ol>

The authors declare no potential conflicts of interest with respect to the research, authorship, and/or publication of this article. Open Access fees for this article were provided by Agilent Technologies.

Denne protokollen er en metode for å evaluere av bioenergetisk fenotype i cerebrale vaskulære endotelceller. Det fungerer som en grunnleggende analyse for endotelceller mitokondrie evaluering, og det er optimalt for eksperimenter utført for å undersøke mekanismene for stimuli som kan påvirke mitokondrie signalveien i CVE celler. Det gir også en metode for å teste potensielle legemiddelselskap for BBB-avbrudd-assosierte sykdommer. Kritiske trinn i protokollen Ekstracellulære flux bioanalyzers har evnen til å måle OCR i sanntid. I denne analysen å identifisere den aktuelle celletetthet er kritisk. Når celletettheten er under 8 x 10 3 celler per brønn, er det basale OCR for lavt til å bli analysert (figur 2 og figur 3); hvis celletettheten er over 32 × 10 3 celler per brønn, gjør cellene ikke svare på oligomycin eller FCCP renseanleggNTS (figur 2 og figur 3). Den optimale celletettheten for denne cellelinjen i vår eksperimentelle modellen er 16 × 10 3 celler per brønn, noe som viser kopier resultater og følsomhet for stimuli 7 og behandlinger 10,14. Dersom en 24-brønns Bioanalyzer anvendes, ville nye titreringer av celletettheten være nødvendig for analysen. Det er dokumentert at CVEs ha et stort volum av mitokondrier sammenlignet med andre endoteliale celler eller vevstyper 15,16, noe som tyder på behovet for større energiproduksjon og færre celler for måling av Bioenergi metabolisme. Vi har testet flere typer av hjerne endotelceller, slik som primære og udødelig murine cerebrovaskulære endotelceller 7 og udødeliggjort human cerebrovaskulære endotelceller (upubliserte data). Disse cellene som kreves tilsvarende celletettheter for å nå et akseptabelt OCR (basal åndedrett OCR innenfor 40-160 pmol / min96-brønners plater og 50-400 pmol / min i 24-brønners plater) når den Bioenergi analysen ble utført. Kaczara et al. Rapporterte måle bioenergetisk metabolisme i menneske navleveneendotel celler (HUVEC), som brukte et høyere celletetthet 17. Vår gruppe fikk ikke vurdere fartøy celler fra andre vev eller organer. Teoretisk er Bioanalyzer kan potensielt brukes på en hvilken som helst celletype, men det krever optimalisere assay for celle-densiteten, cellekulturmedium og dyrkningsbetingelser (noen spesifikke celler kan kreve belagte platene til å vokse godt). Det er nødvendig at forsøkene er gjennomført for å sikre at OCR hastigheten er innenfor det akseptable området. Hvis OCR i endoteliale celler fra andre organer er lavere enn CVEs fra hjerne, øke celletettheten kan bidra til å komme innenfor et akseptabelt OCR rekkevidde. Alternativt, hvis cellene ikke bruker oksidativ fosforylering som sin viktigste kilde til energi, Bioanalyzer ville ikke være en optimal analysen. Den Bioanalyzer gir mulighet for sekvensiell avbrudd av elektrontransportkjeden, basert på rekkefølgen reagenser er brukt. Først blir oligomycin anvendt, som hemmer mitokondriell Complex V (ATP syntase). For det andre, FCCP, en elektron uncoupler, er brukt, noe som fører til avbrudd av den proton gradient. Til slutt, rotenon og antimycin A, som hemmer mitokondriell komplekser I og III, henholdsvis, blir tilført for å føre til en total hemming av elektronstrømmen. Rekkefølgen av medikamenteksponering er nødvendig, fordi stoffene blokkerer det spesifikke elektrontransportkjeden reaksjon, og de etterfølgende endringer kan måles for å reflektere den mitokondriefunksjonen. Modifikasjoner og feilsøking For å evaluere mitokondrie respons på stimuli i CVE-celler, er det anbefalt at de stimuli tilføres celler etter at cellene er festet til cellekulturplaten bunn (se tidslinjenvist på figur 1; det tar vanligvis minst 6 timer). For å oppnå kopierbare resultater ved behandlinger, er det ekstremt viktig å holde celletettheten konsekvent. Hvis forbehandlinger er utformet før celle seeding, bør celletetthet for hver forbehandling nøye målt, med unntak av de døde cellene for seeding. Hvis transfeksjon er inkludert i eksperimentell design, se produsentens transfeksjon protokollen. Vist i dataene presentert i Figur 4, er MIR-34a transfektert inn i CVE cellene ved hjelp av en lipofektamin transfeksjon kit, noe som krever antibiotika fritt cellekulturmedium og en mito-stresstest for å vurdere endringer i metabolsk funksjon med overekspresjon av MIR-34a . Dosene av plasmid kan også være optimalisert, som tidligere publisert 13. En annen endring som kan gjøres med den protokoll som er å endre konsentrasjonen av reagensene. En titrering kurve av oligomycin, FCCP, og / eller rotenon og antimycin kan være completed. I tillegg, hvis denne analysen anvendes for høy gjennomstrømning analyser av forskjellige medikamenter, er det foreslått å inkludere en parallell analyse for å måle cellenes levedyktighet og celleproliferasjon, som ble beskrevet i våre tidligere publikasjoner 7,13. OCR-verdier er betydelig påvirket av celletallet (figurene 2 og 3), og celleproliferasjon og levedyktighet assays fordel for normalisering av dataene. Men gjennomføringen av disse analysene er på skjønn av den enkelte laboratorium. Begrensninger av teknikken Den store begrensning av denne protokollen er at vi bare brukte et in vitro cellekulturmodell i studien. For tiden er det ingen tilgjengelige ex vivo modeller eller dyremodeller som kan løse endotelceller mitokondrienes funksjon. Det forventes nye modeller for å bli utviklet for evaluering av bioenergetisk funksjon in vivo og <em&gt; ex vivo i fremtidige studier. En annen begrensning er forlengelsen av barrierevurderingene følgende bioenergi tiltak. Forsøkene kan ikke utføres fordi, først etter fullførelsen av bioenergetiske målinger, cellelevedyktigheten er svekket etter fullstendig avbrytelse av elektrontransportkjeden; andre, bestemte cellekulturplater og innsatser som kreves for å oppdage bioenergi verdier og passer ikke innsatser for barriere vurderinger. Derfor er det ikke mange funksjonelle analyser som kan gjennomføres etter bioenergi analysen. Imidlertid er det forventet at spesielle anordninger kan utvikles for å utføre funksjonelle analyser før den Bioenergi analysen. Betydningen av Technique For eksisterende / alternative metoder Tidligere teknikker for å evaluere mitokondriefunksjon nødvendiggjort isolering av mitokondrier fra cellene 18. dette new teknikk ved hjelp av Bioanalyzer tillater måling av mitokondriell aktivitet i intakte celler, som bevarer mer av det cellulære miljø enn å evaluere isolerte mitokondrier. Fremtidige søknader eller Veibeskrivelse Etter å mestre denne teknikken Denne protokollen er konstruert og utviklet for bEnd.3 cellelinje, men det er også kompatibelt med primær cerebral vaskulær endotel (pCVE) celler 7 eller annen endotel, og vi har vist dette i vår tidligere publikasjon ved hjelp pCVE celler 7. Når andre typer av endotel blir brukt, kan det være nødvendig at belegget på kulturplaten og bruk av vekstfaktorer. Imidlertid er det titrering analysen anbefalt for andre celletyper. Denne protokollen har en generell metode for å bli brukt av evalueringen av bioenergi av CVE-celler, og det kan videre anvendes på mekanismen studier eller terapeutiske responser på denne måten.

Det er allment anerkjent at blod-hjerne-barrieren (BBB) ​​dannet av cerebral vaskulær endotel (CVE) celler har svært distinkte og unike funksjoner ordnede til vaskulær biologi. Disse endotelceller bruke mitokondriene til å generere det meste av den cellulære tilførsel av adenosin trifosfat (ATP) som en kilde for kjemisk energi. I tillegg til å tilveiebringe ATP for CVE cellene, mitokondrier regulerer diverse cellulære prosesser i vaskulære endotelceller, slik som cellulær signale 1-4, apoptose 5, og kontroll av cellesyklus og cellevekst 6. Dysregulering av mitokondriell bioenergetisk funksjon i celler CVE kan påvirke mitokondrie biogenesis, som fører til nedsatt vaskulær endotel aktivitet, og forverre cerebrovaskulære sykdommer og nevrodegenerative lidelser, for eksempel hjerneslag 7,8 og Alzheimers sykdom (AD) 9. Vi har vist at fornærmelser til CVE celler etter eksponering for lipopolysaccharide (LPS) svekke mitokondrienes funksjon i CVE celler og forverre hjerneslag utfall 7. Tert-butylhydrokinon (TBHQ) øker slag dødelighet ved å forstyrre oksidativ fosforylering i CVE celler 10. Derfor kvantitativ modell av bioenergetisk funksjon i CVE celler ikke bare piloter en serie av mekanisme relaterte studier for sentralnervesystemet (CNS) sykdommer, men gir også et gjennombrudd i narkotika-screening av legemiddelselskap rettet mot mitokondrienes funksjon i vaskulær biologi. Isolerte mitokondrier er blitt brukt til å måle bioenergetisk funksjon. Vi 7 og andre 11 har rapportert vurderinger av cellulære bioenergi i intakte CVE celler ved hjelp av et ekstracellulært flux Bioanalyzer. Analysatoren gir fordelen av endogen cellulær bioenergetisk vurdering. Dette følsomme og konsekvente assay måler den mitokondrielle metabolismen av CVE-celler, og kan brukes til å evaluere bioenergetisk svekkelse av stimuli, undersøke mekanismene for mitokondrie signalveier og skjerm legemidler eller behandlinger som påvirker mitokondrienes funksjon i CVE celler. Oksygenforbruket Rate (OCR) er registrert av Bioanalyzer bruke en farmakologisk profilering tilnærming ved å kombinere bruk av fire mitokondrielle forstyrrende: oligomycin, karbonyl cyanid-4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), rotenon, og antimycin A. I denne protokollen, vi detalj en optimalisert metode som gir mulighet for måling og beregning av mitokondrielle funksjonelle parametre i CVE-celler, inkludert basal mitokondriell respirasjon, ATP produksjon, proton lekkasje, maksimal åndedrett, og reserveluftkapasitet, i en enkelt analyse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="840">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">bEnd.3 cell line</td>
			<td style="width:147px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-2299</td>
			<td style="width:197px;">25-30 passages</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:147px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:147px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">S12450</td>
			<td>10% in final</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Penicillin/Steptomycin</td>
			<td style="width:147px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SV30010</td>
			<td>1&#215;100 stocking</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">0.25% trypsin 0.03% EDTA solution</td>
			<td style="width:147px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:147px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-000-CI</td>
			<td>1.0 &#181;M in final</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Glucose</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CAS 50-99-7</td>
			<td>25 mM in final</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">O4876</td>
			<td>1.0 &#181;M in final</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Carbonilcyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C2920</td>
			<td>0.5 &#181;M in final</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Rotenone</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R8875</td>
			<td>1.0 &#181;M in final</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CAS 1397-94-0</td>
			<td>1.0 &#181;M in final</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Plate wash station</td>
			<td style="width:147px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Extracellular flux bioanayzer&#160;&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">XFe96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Extracellular flux cell culture plate</td>
			<td style="width:147px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">102416-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Extracellular flux sensor cartridge</td>
			<td style="width:147px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">102416-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Extracellular flux calibrant solution</td>
			<td style="width:147px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">100840-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Extracellular flux assay medium</td>
			<td style="width:147px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">102365-100</td>
			<td>PH buffered prior to assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of bioenergetic function in cerebral vascular endothelial cells

Integriteten av blod-hjerne-barrieren (BBB) ​​er kritisk for å forhindre hjerneskade. Cerebral vaskulær endotelial (CVE) celler er en av de celletyper som utgjør BBB; Disse celler har en meget høy etterspørsel etter energi, noe som krever mitokondrial optimal funksjon. I tilfelle av sykdom eller skade, kan det mitokondriell funksjon i disse cellene bli endret, hvilket resulterer i sykdommer eller åpningen av BBB. I dette manuskriptet, innfører vi en metode for å måle mitokondrienes funksjon i CVE celler ved hjelp av hele, intakte celler og en Bioanalyzer. En mito-stress-test for å utfordre de celler som har blitt perturbed, enten fysisk eller kjemisk, og vurdere deres bioenergetisk funksjon. I tillegg gir denne metoden gir også en nyttig måte å screene nye behandlingsformer som har direkte effekter på mitokondrienes funksjon. Vi har optimalisert celletettheten er nødvendig for å gi oksygenforbruk som gjør det mulig for beregning av et utvalg av mitokondriell parameter, inkludert ATP produksjon, maksimal respirasjon, og ledig kapasitet. Vi viser også sensitiviteten til analysen ved å vise at innføringen av mikroRNA, MIR-34a, fører til en markant og påvisbar reduksjon av mitokondriell aktivitet. Mens dataene som vises i dette papiret er optimalisert for bEnd.3 cellelinje, har vi også optimalisert protokollen for primær CVE celler, videre tyder verktøyet i prekliniske og kliniske modeller.

For å vurdere bioenergetisk funksjon av CVE-cellene i respons til oksidativt stress, valgte vi murine hjerne mikrovaskulær endothelia cellelinje bEnd.3, som viser de samme sammenlignende barriereegenskaper som primær hjerne mikrovaskulære endotelceller 12. Gitt at kinetikken og relative intensiteten til respons er varierte mellom de ulike celletyper, ble den første serie forsøk utformet for å oppnå målbare OCR-nivåer ved å identifisere det optimale antall bEnd.3 celler til bruk i analysen for metabolske profilering, vist i Figur 2. Etter evalueringen, er dataene kvantifisert og presentert i Figur 3. Basal åndedrett, maksimal respirasjon, og reserveluftkapasitet viste en forholdsmessig reaksjon med celletetthet. Imidlertid redusert ATP-produksjon ved 64 x 10 3 celler pr brønn ble valgt, noe som tyder på at over konfluente cellekultur erikke egnet for dette eksperimentet. De optimale celletettheter oppstå mellom 8-32 × 10 3 celler per brønn, basert på responsen på mitokondrielle forstyrrende. For etterfølgende eksperimenter, ble en såing tetthet på 16 x 10 3 celler per brønn som brukes for å muliggjøre optimal deteksjon av endringer i OCR. Ved hjelp av 16 × 10 3 celler per brønn, observerte vi de forventede reaksjoner i OCR og viste at mikroRNA MIR-34a reduserer mitokondrienes funksjon i CVE-celler (figur 4). Vi har tidligere rapportert at MIR-34a redusert oksydativ fosforylering i disse celler 13. De gjentatte eksperimenter viste også at maksimal respirasjon og reservekapasitet ble betydelig redusert ved overekspresjon av MIR-34a i CVEs på 24 timer etter transfeksjon, selv om basal respirasjon, ATP produksjon, og proton lekkasje hadde ingen vesentlige endringer (figur 4) . disse datademonstrere følsomheten av Bioanalyzer for å detektere endringer i mitokondriefunksjon i CVEs. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig1.jpg" /> Figur 1. Strategisk planlegging for forsøket. Tidslinjen for cellen, plate og kassett forberedelse er angitt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig2.jpg" /> Figur 2. Representant Rådata av bioenergetiske Funksjon i CVE Celler med ulike celletetthet. Oksygenforbruk priser ble målt i CVE celler med forskjellige celletettheter. Data representerer middelverdi ± SD (n = 5); OCR: oksygenforbrukshastighet; FCCP: karbonyl cyanid-4- (trifluoromethoxy) phenylhydrazone;<html> Rot / Anti-A: rotenon og antimycin ①, ② og ③ indikerer basal respirasjon; ④, ⑤, og ⑥ indikere ATP knyttet åndedrett; ⑦, ⑧, og ⑨ indikerer maksimal respirasjon; ⑩, ⑪, og ⑫ indikerer ikke-mitokondriell respirasjon. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig3.jpg" /> Figur 3. Representative Resultater av bioenergetiske Funksjon i CVE Celler med ulike celletetthet. Basal respirasjon, ATP produksjon, maksimal respirasjon, og ledig kapasitet er beregnet ut fra rådata generert av bioenergi funksjonelle analysen i figur 2 ved hjelp av formlene som er angitt i § 4 . data representerer middelverdi ± SD (n = 5); OCR: oksygenforbruk Rate.<html> f = &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig4.jpg" /> Figur 4: Representative Resultater av Redusert bioenergetiske funksjon ved MIR-34a (A) Rådata av mitokondrienes funksjon følgende overekspresjon av MIR-34a på 24 timer etter transfeksjon.. (B) Basal respirasjon, ATP produksjon, maksimal respirasjon, og ledig kapasitet er beregnet ut fra rådata generert av bioenergi funksjonelle analysen i figur 4A; parametrene beregnes ved formlene som er angitt i avsnitt 4. Overekspresjon av MIR-34a reduserer mitokondriell funksjon i CVE-celler ved 24 timer etter transfeksjon. Data representerer middelverdi ± SD (n = 5); OCR: oksygenforbruk Rate. ****, P &lt;0,0001.filer / ftp_upload / 54847 / 54847fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. <img alt="Tabell 1" src="/files/ftp_upload/54847/54847table1.jpg" /> Tabell 1. Instrumentet Run protokollen.

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells at JoVE.com

Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

Endotelcelle mitokondrier er avgjørende for å opprettholde blod-hjerne-barriereintegritet. Vi introduserer en protokoll for å måle bioenergetisk funksjon i cerebrale vaskulære endotelceller.

Evaluering av bioenergetiske Funksjon i Cerebral vaskulære endotelceller

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dual Elektrofysiologiske Opptak av Synaptically-fremkalt Astroglial og Neuronal Responses i akutt hippocampus Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

Isolering av Primary murine Brain mikrovaskulære Cells

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Kvantifisering av Cerebral Vascular Architecture ved hjelp av to-foton mikroskopi i en musemodell for HIV-indusert nevroinflammasjon

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Imaging Serotonerge Fibers i Mouse Spinal Cord Bruke CLARITY / CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

Samtidig Evaluering av Cerebral hemodynamikken og lysspredning egenskaper av<em&gt; In vivo</em&gt; Rat Brain Bruke multispektrale Diffus refleksjon Imaging

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional ...

Rat Model of Widespread Cerebral Cortical Demyelination Induced by an Intracerebral Injection of Pro-Inflammatory Cytokines

Rottemodell av utbredt cerebral kortikale demyelinering indusert av en intracerebral injeksjon av proinflammatoriske cytokiner

Multiple sclerosis (MS) is the most common immune-mediated disease of the central nervous system (CNS) and progressively leads to physical disability and ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

I Vivo kalsium bildebehandling av Lateral linje hårcellene i larver sebrafisk

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

Isolering av primære Murine Skjelettmuskel mikrovaskulær endotelceller

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...