Name: evaluation of bioenergetic function in cerebral vascular endothelial cells
Uploaded: 2016-11-19T15:00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells at JoVE.com

This work was supported by the following grants: AHA 16SDG31170008 to X.R. and NIH P20 GM109098, P01 AG027956, and U54 GM104942 to J.W.S.

Not: protokol şeması prosedürleri, bir zaman çizgisi de dahil olmak üzere, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. CVE 1. Hücre Kültürü ve Pasaj <ol><li> Tam büyüme ortamı içinde kültür CVE hücreleri (bEnd.3 hücreleri) (yüksek glukoz Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı, DMEM) T75 cm2&#39;lik doku kültür şişesi içinde% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin ile takviye edilmiştir. % 5 CO2 inkübatörde 37 ° C&#39;de büyütülmüştür. </li><li> Çıkarın ve hücre kültür ortamı atılır. % 0.25 tripsin-% 0.03 EDTA çözeltisi ile hücre tabakasını durulayın, ve daha sonra 1 ekleyin - şişeye Tripsin-EDTA solüsyonu 2 mL, 3 37 ° C &#39;de balon devam - 5 dak. Hücre tabakası ayrılmış kadar bir ters mikroskop altında hücre dikkate alınmalıdır. tam büyüme ortamı 10 ml ekleyin ve hafifçe pipetleme hücreleri aspire. </li><li> 5 dakika, selüler artığın ayrılması için 700 x g&#39;de 15 ml santrifüj tüpüne ve spin içerisine sıvı ve hücre süzün. </li&gt; <li> santrifüj tüpten atın. tam büyüme ortamında 10 ml ekleyin ve hücre topağı yeniden askıya. 5 dakika boyunca 700 xg&#39;de hücreleri dönerler. </li><li> santrifüj tüpten atın. Yeniden askıya 2.0 x 10 5 hücre / ml bir konsantrasyonda tam büyüme ortamında hücre pelletini (hemasitometre kullanarak saymak suretiyle belirlendi, tripan-mavisi boyama ile ölü hücreleri hariç). Not: Taze çözülmüş hücreler deneyler için en az 3 geçişleri için alt kültürlenir. </li></ol> Hücre Kültürü Tabaklar 2. Tohum ve tedavi Hücreler <ol><li> 96 oyuklu bir hücre dışı akı hücre kültürü plakasının Tohum hücreleri: de 80 uL /. % 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de hücre kültürü plakası yerleştirin. Not: kuyu başına 16 × 10 3 hücreleri 60 ulaşacak - 24 saat içinde% 80 confluency. </li><li> hücreler, bir kimyasala maruz kaldığı takdirde, hücreler plaka tabanına takılmaktadırlar, sonra, tedaviler ekleyin (8-24 saat izleyenlereding). Not: Transfeksiyon deneyleri için, tam büyüme ortamında antibiyotik ilave değildir. </li></ol> Bioanalyzer kullanarak Mitokondriyal Fonksiyon 3. Değerlendirme <ol><li> Deneyin başlamasından önce, plakaya hücre dışı akı kalibrant çözeltisi 150 uL ilave edilmesi ve CO2 olmadan 37 ° C &#39;de O / N inkübe edilerek kalibratörü ile hücre dışı bir akış sensörü kartuşu hidrat. </li><li> plaka yıkayıcı istasyonunu kullanarak, pH 7.0 dışı akı deney ortamı içine hücre kültür ortamı değiştirin. 60 dakika - 30 CO 2 olmadan 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri. </li><li> 8 mcM oligomycin, 4.5 uM FCCP, 10 uM rotenone ve DMEM 10 uM antimisin çalışma çözümleri hazırlayın. Yük 25 uL kartuş enjeksiyon portlarına stok çözümleri: Port A, oligomycin; Liman B, FCCP; Liman C, hücre dışı akı deney ortamı ile rotenone ve antimisin. Tablo 1 &#39;de tarif edildiği gibi analiz protokolü uygulamak. </li><li> Bioanalyzer içine sulandırılmış kartuşu yükleyin ve &quot;Başlat&quot; düğmesine tıklayarak kalibrasyonu yapın. Kalibrasyon tamamlandıktan sonra, kartuş alt plaka kaldırmak ve &quot;Unload Kartuşu&quot; istemini tıklayarak hücre plaka yükleyin. Tüm ölçümlerin sonuna kadar tahlil devam edin. </li><li> veri dosyasını açın ve Bioanalyzer gelen oran değerlerini elde. Bir tablo dosyasına veri verir. </li></ol> 4. Veri Analizi NOT: Veri analizler için hesaplamalar aşağıda formüle edilmiştir. OCR Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi değerler Bioanalyzer alet elde edilir. <ol><li> Bazal değerden (ölçüm 3) - Bazal solunum hesaplamak için, olmayan mitokondriyal solunum (12 ölçümleri 10) çıkarın. NOT: Bazal solunum = Bazal - olmayan mitokondriyal solunum = Oranı ③ - Oranı ⑩ ~ ⑫. </li><li> ATP verimlilik hesaplamak içinbazal değerden (ölçüm 3) - on ATP bağlı solunum (6 ölçümleri 4) çıkarın. NOT: ATP üretimi = Bazal - ATP bağlı solunum = Oranı ③ - Oranı ④ ~ ⑥. </li><li> Maksimum solunum dan (ölçümler 7-9) - Maksimum solunum hesaplamak için, olmayan mitokondriyal solunum (12 ölçümleri 10) çıkarın. NOT: Maksimal solunum = Maksimum solunum - olmayan mitokondriyal solunum = Oranı ⑦ ~ ⑨ - Oranı ⑩ ~ ⑫. </li><li> Yedek kapasitesini hesaplamak için, maksimum solunum bazal değer (ölçüm 3) (- 9 ölçümler 7) çıkarın. NOT: Yedek kapasite = Maksimum solunum - Bazal = Oranı ⑦ ~ ⑨ - Oranı ③. </li><li> ATP bağlı solunum (ölçüm 4) den - Proton sızıntı hesaplamak için, olmayan mitokondriyal solunum (12 ölçüm 10) çıkarın. NOT: Proton kaçak = ATP bağlı solunum - olmayan mitokondril solunum = Oranı ④ - Oranı ⑩ ~ ⑫. </li></ol>

<ol>
	<li>Quintero, M., Colombo, S. L., Godfrey, A., Moncada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+as+signaling+organelles+in+the+vascular+endothelium.">Mitochondria as signaling organelles in the vascular endothelium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 5379-5384 (2006).</li><li>Liu, Y., Li, H., Bubolz, A. H., Zhang, D. X., Gutterman, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cytoskeletal+elements+are+critical+for+flow-mediated+dilation+in+human+coronary+arterioles.">Endothelial cytoskeletal elements are critical for flow-mediated dilation in human coronary arterioles.</a> Med Biol Eng Comput. 46, 469-478 (2008).</li><li>Al-Mehdi, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perinuclear+mitochondrial+clustering+creates+an+oxidant-rich+nuclear+domain+required+for+hypoxia-induced+transcription.">Perinuclear mitochondrial clustering creates an oxidant-rich nuclear domain required for hypoxia-induced transcription.</a> Sci Signal. 5, ra47 (2012).</li><li>Mironov, S. L., Ivannikov, M. V., Johansson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Ca2+]i+signaling+between+mitochondria+and+endoplasmic+reticulum+in+neurons+is+regulated+by+microtubules.+From+mitochondrial+permeability+transition+pore+to+Ca2+-induced+Ca2++release.">[Ca2+]i signaling between mitochondria and endoplasmic reticulum in neurons is regulated by microtubules. From mitochondrial permeability transition pore to Ca2+-induced Ca2+ release.</a> J Biol Chem. 280, 715-721 (2005).</li><li>Sutendra, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Nogo+and+the+mitochondria-endoplasmic+reticulum+unit+in+pulmonary+hypertension.">The role of Nogo and the mitochondria-endoplasmic reticulum unit in pulmonary hypertension.</a> Sci Transl Med. 3, 88ra55 (2011).</li><li>Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hyperfused+mitochondrial+state+achieved+at+G1-S+regulates+cyclin+E+buildup+and+entry+into+S+phase.">A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11960-11965 (2009).</li><li>Doll, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+crisis+in+cerebrovascular+endothelial+cells+opens+the+blood-brain+barrier.">Mitochondrial crisis in cerebrovascular endothelial cells opens the blood-brain barrier.</a> Stroke. 46, 1681-1689 (2015).</li><li>Ren, X., Simpkins, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+Blood-Brain+Barrier+Damage+in+Stroke:+Mitochondrial+Mechanism.">Deciphering the Blood-Brain Barrier Damage in Stroke: Mitochondrial Mechanism.</a> J Neuroinfect Dis. S2, e002 (2015).</li><li>Pun, P. B., Lu, J., Moochhala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+ROS+in+BBB+dysfunction.">Involvement of ROS in BBB dysfunction.</a> Free Radic Res. 43, 348-364 (2009).</li><li>Sun, J., Hu, H., Ren, X., Simpkins, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tert-butylhydroquinone+compromises+survival+in+murine+experimental+stroke.">Tert-butylhydroquinone compromises survival in murine experimental stroke.</a> Neurotoxicol Teratol. 54, 15-21 (2016).</li><li>Modis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+bioenergetics+is+regulated+by+PARP1+under+resting+conditions+and+during+oxidative+stress.">Cellular bioenergetics is regulated by PARP1 under resting conditions and during oxidative stress.</a> Biochem Pharmacol. 83, 633-643 (2012).</li><li>Brown, R. C., Morris, A. P., O'Neil, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+junction+protein+expression+and+barrier+properties+of+immortalized+mouse+brain+microvessel+endothelial+cells.">Tight junction protein expression and barrier properties of immortalized mouse brain microvessel endothelial cells.</a> Brain Res. 1130, 17-30 (2007).</li><li>Bukeirat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiR-34a+regulates+blood-brain+barrier+permeability+and+mitochondrial+function+by+targeting+cytochrome+c.">MiR-34a regulates blood-brain barrier permeability and mitochondrial function by targeting cytochrome c.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 36, 387-392 (2016).</li><li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Impairment+in+Cerebrovascular+Endothelial+Cells+is+Involved+in+the+Correlation+between+Body+Temperature+and+Stroke+Severity.">Mitochondrial Impairment in Cerebrovascular Endothelial Cells is Involved in the Correlation between Body Temperature and Stroke Severity.</a> Aging Dis. 7, 14-27 (2016).</li><li>Oldendorf, W. H., Cornford, M. E., Brown, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+large+apparent+work+capability+of+the+blood-brain+barrier:+a+study+of+the+mitochondrial+content+of+capillary+endothelial+cells+in+brain+and+other+tissues+of+the+rat.">The large apparent work capability of the blood-brain barrier: a study of the mitochondrial content of capillary endothelial cells in brain and other tissues of the rat.</a> Ann Neurol. 1, 409-417 (1977).</li><li>Oldendorf, W. H., Brown, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Greater+number+of+capillary+endothelial+cell+mitochondria+in+brain+than+in+muscle.">Greater number of capillary endothelial cell mitochondria in brain than in muscle.</a> Proc Soc Exp Biol Med. 149, 736-738 (1975).</li><li>Kaczara, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+monoxide+released+by+CORM-401+uncouples+mitochondrial+respiration+and+inhibits+glycolysis+in+endothelial+cells:+A+role+for+mitoBKCa+channels.">Carbon monoxide released by CORM-401 uncouples mitochondrial respiration and inhibits glycolysis in endothelial cells: A role for mitoBKCa channels.</a> Biochim Biophys Acta. 1847, 1297-1309 (2015).</li><li>Bharadwaj, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+respirometric+assessment+of+mitochondria+isolated+from+skeletal+muscle+tissue+obtained+by+percutaneous+needle+biopsy.">Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy.</a> J Vis Exp. (96), e52350 (2015).</li></ol>

The authors declare no potential conflicts of interest with respect to the research, authorship, and/or publication of this article. Open Access fees for this article were provided by Agilent Technologies.

Bu protokol, serebral vasküler endotel hücrelerinde biyoenerjik fenotipinin değerlendirilmesi için bir yöntemi temsil eder. Bu endotel hücre mitokondriyal değerlendirme için temel bir tahlil olarak hizmet eder ve bu CVE hücrelerde mitokondriyal sinyal yolağı etkileyebilir uyaranlara mekanizmalarının incelenmesi amacıyla tasarlanan deneylerde için en uygunudur. Ayrıca, BBB bozulması ile ilişkili hastalıklar için potansiyel terapötik test etmek için bir yöntem sağlar. Protokol çerçevesinde kritik adımlar Hücre dışı akı bioanalyzers gerçek zamanlı olarak OCR ölçme yeteneğine sahiptir. Bu tahlilde, uygun hücre yoğunluğu tespit önemlidir. Hücre yoğunluğu oyuk başına 8 x 10 3 hücre altında ise, taban OCR (Şekil 2 ve Şekil 3) analiz edilecek olan çok düşük olduğu; Hücre yoğunluğu oyuk başına 32 x 10 3 hücre üzerinde ise, hücreler oligomycin ya FCCP işlemesi yanıt yokNTS (Şekil 2 ve Şekil 3). Bizim deneysel modelinde bu hücre hattı için en uygun hücre yoğunluğu 7 ve tedavileri 10,14 uyaranlara tekrarlanabilir sonuçlar ve hassasiyet gösteren kuyu başına 16 × 10 3 hücredir. 24 oyuklu Bioanalyzer kullanılırsa, hücre yoğunluğu, yeni titrasyonları tahlili için gerekli olacaktır. CVEs diğer endotel hücreleri ya da doku tipleri 15,16 ile karşılaştırıldığında mitokondri büyük bir hacme sahip olduğunu daha fazla enerji üretimi ve biyoenerjetik metabolizmayı ölçmek için daha az hücre ihtiyacını öne belgelenmiştir. Biz primer beyin endotel hücreleri çeşitli test ve fare serebrovasküler endotel hücrelerini 7 ölümsüzleştirdi ve insan serebrovasküler endotel hücrelerini (yayınlanmamış veri) ölümsüzleştirilmiş var. 160 pmol / dak - Bu hücreler 40 içinde olarak kabul edilebilir bir OCR (bazal solunum OCR ulaşmak için benzer bir hücre yoğunlukları gerekli96 oyuklu plakalar, ve 50-24 oyuklu plakalar 400 pmol / dakika) biyoenerji deney yapıldı. Kaczara ve ark., Daha yüksek bir hücre yoğunluğuna 17 kullanılan insan göbek damarı endotel hücrelerinin (HUVEC), içinde bioenergetic metabolizma ölçüm bildirmiştir. Grubumuz, diğer doku veya organlardan damar hücrelerini değerlendirmek vermedi. Teorik olarak, Bioanalyzer potansiyel olarak herhangi bir hücre tipi kullanılabilir ancak, hücre yoğunluğu, hücre kültür ortamı ve kültür koşulları (bazı özel hücrelerin de büyüme plakaları kaplanmış gerektirebilir) için tahlil optimize etmeyi gerektirir. Deneyler OCR oranını kabul edilebilir aralık içinde olduğundan emin olmak için tamamlanmış olması gereklidir. diğer organlarda endotel hücrelerinde OCR hücre yoğunluğu artan, beyinlerinden CVEs daha düşük ise, kabul edilebilir bir OCR aralığında almak için yardımcı olabilir. Hücreler enerji ana kaynağı olarak oksidatif fosforilasyon kullanmıyorsanız Alternatif olarak, Bioanalyzer bir optima olmazl deneyi. Bioanalyzer reaktifler uygulandığı sırasına göre, elektron taşıma zinciri sıralı bozulması için izin verir. İlk olarak, oligomycin mitokondriyal kompleks V (ATP sintaz) inhibe eden, uygulanır. İkinci olarak, FCCP, bir elektron uncoupler proton gradyanı bozulmasına yol açar, uygulanır. Son olarak, mitokondriyal Kompleksi I ve III inhibe rotenon ve antimisin, sırasıyla elektron akışının toplam inhibisyonuna yol uygulanır. ilaca maruz kalma sırası ilaçların spesifik elektron taşıma zincir reaksiyonu engellemek için gereklidir ve ardışık değişiklikler mitokondriyal fonksiyon yansıtacak şekilde ölçülebilir. Değişiklikler ve Sorun Giderme CVE hücrelerinde uyaranlara mitokondriyal yanıtı değerlendirmek için, hücrelerin hücre kültürü plakası altına yapıştırılır sonra uyaranlar (zaman çizelgesi bkz hücrelere uygulanır tavsiye edilirŞekil 1 &#39;de gösterilen; Genellikle) en az 6 saat sürer. tedaviler ile tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için, tutarlı hücre yoğunluğunu tutmak için son derece önemlidir. ön işlemler hücre tohumlama önce tasarlanmış, her ön-tedavisi için hücre yoğunluğu dikkatle tohumlama için ölü hücreleri hariç, ölçülmelidir. transfeksiyon deney tasarımı dahil edilirse, üreticinin transfeksiyon protokolü bakın. Şekil 4&#39;de sunulan veriler göstermiştir miR-34A miR-34a aşırı ekspresyonu ile metabolik fonksiyonu değişiklikleri değerlendirmek için antibiyotik içermeyen hücre kültür ortamı ve Mito-stres testi gerektiren bir lipofektamin transfeksiyon kiti kullanılarak CVE hücrelerine transfekte edilmiştir . Daha önce 13 yayınlanan plazmid dozları da, optimize edilebilir. protokole yapılabilir bir diğer değişiklik reaktifler konsantrasyonları değişiyor. oligomycin, FCCP ve / veya rotenone ve antimisin bir titrasyon eğrisi komple olabilirTed. Yüksek performans için kullanılan bu deney, çeşitli ilaçların analiz Buna ek olarak, hücre canlılığı ve önceki yayınlarda 7,13 tanımlanmıştır hücre çoğalmasını ölçmek için bir paralel tahlil içerir önerilmektedir. OCR değerleri anlamlı hücre sayısı (Şekil 2 ve 3) etkilenen ve hücre çoğalması ve canlılığı deneyleri veri normalleşme fayda vardır. Ancak, bu testlerin tamamlanması her laboratuvar takdirine kalmıştır. Tekniğin Sınırlamalar Bu protokolün en önemli kısıtlılığı, biz sadece çalışmada in vitro hücre kültürü modeli kullanılmış olmasıdır. Şu anda, endotel hücre mitokondrial fonksiyon hitap edebilir hiçbir kullanılabilir ex vivo modeller ya da hayvan modelleri vardır. Yeni modeller in vivo biyoenerjetik fonksiyonunun değerlendirilmesi için geliştirilmiş olması bekleniyor ve <em&gt; ex vivo gelecekteki çalışmalarda. Başka bir sınırlama biyoenerjetiğin tedbirler aşağıdaki bariyer değerlendirmelerinin uzantısıdır. İlk olarak, biyoenerjitik ölçümler tamamlandıktan sonra, hücre canlılığı, elektron taşıma zincirinin tam parçalanmadan sonra azalır, çünkü deneyler gerçekleştirilemez; İkinci, özel hücre kültürü plakaları ve ekler biyoenerjetik değerlerini tespit etmek için gerekli olan ve bariyer değerlendirmeler için ekler uymaz. Bu nedenle, biyoenerji tahlil sonra tamamlanabilir pek çok işlevsel tahliller değildir. Bununla birlikte, özel cihazlar biyoenerji deneyi öncesinde fonksiyonel tahliller yapmak için geliştirilebilir beklenmektedir. Mevcut / Alternatif Yöntemler Göre Tekniği Önemi Mitokondriyal fonksiyonu değerlendirmek için önceki teknikler hücrelerden 18 den mitokondri izolasyonu gerektirmiştir. bu neBioanalyzer kullanılarak W tekniği izole mitokondri değerlendirilmesi daha selüler ortamın fazla muhafaza sağlam hücrelerde mitokondriyal aktivite ölçümü sağlar. Bu Tekniği Mastering sonra gelecek Uygulamalar veya Tarifi Bu protokol, tasarlanmış ve bEnd.3 hücre hattı için geliştirilmiş, ancak aynı zamanda primer serebral vasküler endotelyal (pCVE) hücreleri 7 ya da endotel ile uyumlu olduğunu ve pCVE hücreleri 7 kullanarak önceki yayında bu göstermiştir edilir. endotel diğer türleri kullanıldığında, kültür plakasının kaplama ve büyüme faktörleri kullanımı gerekebilir. Bununla birlikte, titrasyon testi gibi diğer hücre tipleri için tavsiye edilir. Bu protokol, CVE hücre Biyoenerjetiğin değerlendirilmesinde kabul edilmesi genel bir yöntem sunmaktadır ve bu daha da mekanizma çalışmaları da bu şekilde tedavi yanıtları tatbik edilebilir.

Yaygın serebral vasküler endotelyal (CVE) hücreleri tarafından oluşturulan kan-beyin bariyeri (KBB) vasküler biyoloji için her şeyden çok farklı ve benzersiz işlevlere sahiptir olduğu kabul edilmektedir. Bu endotel hücreleri, kimyasal enerji kaynağı olarak adenosin trifosfat hücre kaynağı (ATP) en oluşturmak için mitokondri kullanımı. CVE hücreleri için ATP sağlamanın yanı sıra, mitokondri 1-4 sinyal hücresel vasküler endotel hücreleri, çeşitli hücresel işlemleri, apoptoz 5 ve hücre döngüsü kontrol edilmesi ve hücre büyümesini 6. CVE hücrelerde mitokondriyal biyoenerjik fonksiyonunun bozulması düzenleyen bozulmuş vasküler endotel aktivitesine yol açan, mitokondriyal biogenezi etkiler ve serebrovasküler hastalıklar ve nörodejeneratif bozukluklar, örneğin, felç 7,8 ve Alzheimer hastalığı (AD) 9 şiddetlendirebilir. Bu CVE hücrelere hakaretler lipopolysac maruz kaldıktan sonra göstermiştirsakarit (LPS) CVE hücrelerinde mitokondriyal fonksiyonunu bozabilir ve inme 7 sonuçlarını kötüleştirebilir. Bütilhidrokuinon (TBHQ) CVE hücrelerinde 10 oksidatif fosforilasyon ile müdahale ederek inme mortaliteyi artırmaktadır. Bu nedenle, CVE hücreleri sadece pilot merkezi sinir sistemi için bir mekanizma ile ilgili bir dizi çalışma (CNS) hastalıkları biyoenerjik fonksiyonunun niceliksel model, aynı zamanda, vasküler biyoloji mitokondriyal fonksiyonu hedefleme terapötik ilaç taramasında bir buluş sağlar. İzole mitokondri biyoenerjitik fonksiyonu ölçmek için kullanılmıştır. Biz 7 ve diğerleri 11 ekstraselüler akı Bioanalyzer kullanarak sağlam CVE hücrelerinde hücresel Biyoenerjetiğin değerlendirmelerini bildirdi. analizör endojen hücresel biyoenerjetik değerlendirme avantajı sağlar. Bu, hassas ve tutarlı deney CVE hücrelerin mitokondrial metabolizmanın büyüklüğüne ve Şti bioenergetic bozukluğu değerlendirmek için kullanılabilirMuli, CVE hücrelerinde mitokondriyal fonksiyonunu etkileyen mitokondriyal sinyal yollarının mekanizmalarını ve ekran ilaçlar ya da tedaviler araştırmak. Bu protokolde, rotenone ve antimycin A. oligomycin, karbonil siyanür-4 (triflorometoksi) fenilhidrazonun (FCCP): Oksijen Tüketim Hızı (OCR) dört mitokondriyal bozucuların kullanımını birleştirerek bir farmakolojik profil yaklaşımı kullanılarak Bioanalyzer tarafından kaydedilir biz detay tek bir deneyde, ölçme ve bazal mitokondriyal solunum, ATP üretimi, proton sızıntısı, maksimal solunum ve yedek solunum kapasitesi dahil olmak üzere CVE hücrelerinde mitokondriyal fonksiyonel parametrelerin hesaplanması için izin veren bir optimize edilmiş bir yaklaşım.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="840">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">bEnd.3 cell line</td>
			<td style="width:147px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-2299</td>
			<td style="width:197px;">25-30 passages</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:147px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:147px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">S12450</td>
			<td>10% in final</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Penicillin/Steptomycin</td>
			<td style="width:147px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SV30010</td>
			<td>1&#215;100 stocking</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">0.25% trypsin 0.03% EDTA solution</td>
			<td style="width:147px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:147px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-000-CI</td>
			<td>1.0 &#181;M in final</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Glucose</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CAS 50-99-7</td>
			<td>25 mM in final</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">O4876</td>
			<td>1.0 &#181;M in final</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Carbonilcyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C2920</td>
			<td>0.5 &#181;M in final</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Rotenone</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R8875</td>
			<td>1.0 &#181;M in final</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CAS 1397-94-0</td>
			<td>1.0 &#181;M in final</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Plate wash station</td>
			<td style="width:147px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Extracellular flux bioanayzer&#160;&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">XFe96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Extracellular flux cell culture plate</td>
			<td style="width:147px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">102416-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Extracellular flux sensor cartridge</td>
			<td style="width:147px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">102416-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Extracellular flux calibrant solution</td>
			<td style="width:147px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">100840-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:377px;">Extracellular flux assay medium</td>
			<td style="width:147px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">102365-100</td>
			<td>PH buffered prior to assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of bioenergetic function in cerebral vascular endothelial cells

Kan-beyin bariyer (KBB) bütünlüğü beyin hasarını önlemek için kritik öneme sahiptir. Serebral vasküler endotelyal (CVE) hücreleri BBB oluşturan hücre tiplerinden biri olan; Bu hücreler optimum mitokondriyal fonksiyonunu gerektiren çok yüksek-enerji talebinin var. hastalık veya kaza durumunda, bu hücrelerde mitokondriyal fonksiyonu hastalık veya BBB açılması ile sonuçlanır, değişmiş olabilir. Bu yazıda, bütün, sağlam hücreleri ve bir Bioanalyzer kullanarak CVE hücrelerinde mitokondriyal fonksiyonu ölçmek için bir yöntem tanıtmak. Bir mito-stres tahlil ya fiziksel ya da kimyasal, bozulmuş olan hücreler meydan ve onların biyoenerjitik fonksiyonlarını değerlendirmek için kullanılır. Ayrıca, bu yöntem aynı zamanda mitokondriyal fonksiyon üzerinde doğrudan etkiye sahip yeni tedavi ajanlarının ekrana kullanışlı bir yol sağlar. Mitokondriyal para çeşitli hesaplanmasına imkan oksijen tüketim oranları elde etmek için gerekli olan hücre yoğunluğuna optimizeATP üretimi, maksimal solunum ve yedek kapasite de dahil olmak üzere metre. Ayrıca mıkroRNA, miR-34a giriş, mitokondriyal aktivite belirgin bir ve saptanabilir bir azalmaya sebep olduğunu göstererek tahlilin hassasiyetini göstermektedir. Bu çalışmada gösterilen veriler bEnd.3 hücre hattı için optimize edilmiş olsa da, biz de daha ileri preklinik ve klinik modellerde programı düşündüren, birincil CVE hücreleri için protokol optimize ettik.

Oksidatif strese yanıt olarak CVE hücrelerinin bioenergetic fonksiyonunu değerlendirmek için, biz primer beyin mikrovasküler endotel hücreleri 12 ile aynı karşılaştırmalı bariyer özellikleri gösteren fare beyin mikrovasküler endotelin hücre çizgisi bEnd.3 seçti. kinetik ve yanıtın nispi yoğunluk çeşitli hücre tipleri arasında farklılık olduğu göz önüne alındığında, deney birinci seriye ait metabolik profil deneyinde kullanılacak bEnd.3 hücrelerinin uygun tanımlanmasıyla ölçülebilir OCR seviyelerini elde etmek için dizayn edilmiştir, gösterilen değerlendirmenin ardından Şekil 2. veri miktarı ve Şekil 3&#39;te. Bazal solunum, maksimal solunum sunulan ve yedek solunum kapasitesi hücre yoğunluğu ile orantılı tepki gösterdi edilir. Bununla birlikte, ATP üretimi aşırı birleşik hücre kültürü olduğunu düşündüren oyuk başına 64 x 10 3 hücreleri seçildi düşerkenBu deney için uygun değildir. Mitokondriyal bozucuların yanıt göre oyuk başına 3 ila 10 x 32 hücreler, - Optimal hücre yoğunlukları 8 arasında gerçekleşir. Takip eden deneyler için, oyuk başına 16 x 10 3 hücre tohum yoğunluğu OCR değişikliklerin uygun tespiti için izin vermek için kullanılmıştır. Oyuk başına 16 x 10 3 hücreleri kullanılarak, OCR beklenen yanıtları gözlendi ve mikroRNA miR-34A CVE hücrelerde mitokondriyal fonksiyonu (Şekil 4) azalttığını göstermiştir. Biz daha önce miR-34a bu hücrelerin 13 oksidatif fosforilasyon azalttığını bildirdi. Tekrarlanan deneyler de maksimal solunum ve yedek kapasite önemli ölçüde anlamlı bir değişiklik olsa bile bazal solunum, ATP üretimi ve proton sızıntısı olsa, 24 saat sonrası transfeksiyon de CVEs içinde miR-34a aşın azalarak olduğunu gösterdi (Şekil 4) . Bu veriler,CVEs mitokondriyal fonksiyon değişiklikleri tespit etmek için Bioanalyzer hassasiyetini göstermektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig1.jpg" /> Hücre, plaka için. Denemeye zaman çizelgesi 1. Stratejik Planlama Şekil ve kartuş hazırlık gösterilir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig2.jpg" /> Şekil çeşitli hücre yoğunlukları olan CVE hücrelerinde Bioenerjetik Fonksiyonun 2. Örnek ham veriler. Oksijen tüketimi oranları farklı hücre yoğunlukları olan CVE hücrelerinde ölçüldü. Veriler ortalama ± SD temsil (n = 5); OCR: Oksijen Tüketim Hızı; FCCP: karbonil siyanit-4- (trifluorometoksi) fenilhidrazon;<html> Rot / Anti-A: rotenone ve antimycin A. ①, ② ve ③ bazal solunum gösterir; ④, ⑤ ve ⑥ ATP solunum bağlantılı olduğunu gösterir; ⑦, ⑧ ve ⑨ fazla solunum gösterir; ⑩, ⑪ ve ⑫ olmayan mitokondriyal solunum gösteriyor. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54847/54847fig3.jpg" /> Çeşitli Hücre Yoğunlukları ile CVE Hücreleri Bioenerjetik Fonksiyon Şekil 3. Temsilcisi Sonuçlar. Bazal solunum, ATP üretimi, maksimal solunum ve yedek kapasite Biyoenerjetiğin tarafından oluşturulan ham verilerden hesaplanan Şekil formülleri kullanarak 2 fonksiyonel tahlil Bölüm 4&#39;te belirtilen . Veri ortalama ± SD temsil (n = 5); OCR: Oksijen Tüketim Hızı.<html> f = &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54847/54847fig4.jpg" /> Şekil 4: miR-34a tarafından Azalmış Bioenerjetik Fonksiyonun Temsilcisi Sonuçlar (A) Mitokondriyal Fonksiyon Ham veri 24 saat sonrası transfeksiyon de miR-34a aşın şu.. (B) Bazal solunum, ATP üretimi, maksimal solunum ve yedek kapasite Bioenerji Şekil 4A fonksiyonel tahlil tarafından oluşturulan ham verilerden hesaplanır; parametreleri miR-34a Bölüm 4 aşırı ifadesinin belirtilen formüller hesaplanmıştır 24 saat sonra, transfeksiyon olan CVE hücrelerde mitokondriyal fonksiyonu azaltır. Veriler ortalama ± SD temsil (n = 5); OCR: Oksijen Tüketim Hızı. ****, P &lt;0.0001.dosyaları / ftp_upload / 54847 / 54847fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="tablo 1" src="/files/ftp_upload/54847/54847table1.jpg" /> Tablo 1. Enstrüman çalıştırın Protokolü.

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells at JoVE.com

Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

Endotel hücre mitokondri, kan-beyin bariyeri bütünlüğünü korumak açısından kritik önem taşımaktadır. Bu serebral vasküler endotel hücrelerinde bioenergetic fonksiyonu ölçmek için bir protokolü getirmektedir.

Serebral Vasküler Endotelyal Hücrelerinde Bioenerjetik Fonksiyonun Değerlendirilmesi

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

Styryl Boyaların Fotoçevrim kullanarak Synaptic veziküllü Havuzları incelenmesi

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Bozulmamış Duyu Organ Öncü Hücreler Canlı hücre Görüntüleme Drosophila Pupa

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Akut Hipokampal Dilimler içinde Synaptically-uyarılmış astroglial ve Nöronal Cevaplarının İkili Elektrofizyolojik Kayıtlar

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

İlköğretim Kemirgen Beyin mikrovasküler endotel hücreleri İzolasyonu

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

HIV kaynaklı Nöroinflamasyondan bir Fare Modeli İki foton Mikroskop kullanarak Serebral Vasküler Mimarlık Niceleme

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Kullanımı Netlik Fare Omurilik içinde Serotonerjik Elyaf Görüntüleme / KÜBİK Tekniği

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

Serebral Hemodinamiğin ve Işık Saçılımının Eşzamanlı Değerlendirilmesi<em&gt; In Vivo</emÇokspektrumlu yaygın reflektans ımaging&#39;i kullanarak&gt; Sıçan Beyin

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional ...

Rat Model of Widespread Cerebral Cortical Demyelination Induced by an Intracerebral Injection of Pro-Inflammatory Cytokines

Pro-enflamatuar Sitokinlerin İntraserebral Enjeksiyonu ile İndüklenen Yaygın Serebral Kortikal Demiyelinasyonun Sıçan Modeli

Multiple sclerosis (MS) is the most common immune-mediated disease of the central nervous system (CNS) and progressively leads to physical disability and ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

Larva zebra balığı sonradan içini kaplamak saç hücrelerinin vivo kalsiyum görüntüleme

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

Birincil fare iskelet kas mikrovasküler endotel hücre izolasyon

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...