Name: development of a hepatitis b virus reporter system to monitor the early stages of the replication cycle
Uploaded: 2017-02-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle at JoVE.com

This work was supported in part by the Research Program on Hepatitis from Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) and by Grants-in-Aids for Scientific Research from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT) of Japan.

1. إنتاج المؤتلف HBV ترميز البروتين مراسل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الخلايا HepG2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد خلية ثقافة المتوسط ​​(متوسطة تعديل النسر Dulbecco وفي (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، و 100 U / ال...

<ol>
	<li>Fattovich, G., Stroffolini, T., Zagni, I., Donato, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocellular+carcinoma+in+cirrhosis:+incidence+and+risk+factors.">Hepatocellular carcinoma in cirrhosis: incidence and risk factors.</a> Gastroenterology. 127 (5), 35-50 (2004).</li><li>Revill, P., Testoni, B., Locarnini, S., Zoulim, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+strategies+are+required+to+cure+and+eliminate+HBV+infection.">Global strategies are required to cure and eliminate HBV infection.</a> Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 13 (4), 239-248 (2016).</li><li>Wursthorn, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peginterferon+alpha-2b+plus+adefovir+induce+strong+cccDNA+decline+and+HBsAg+reduction+in+patients+with+chronic+hepatitis+B.">Peginterferon alpha-2b plus adefovir induce strong cccDNA decline and HBsAg reduction in patients with chronic hepatitis B.</a> Hepatology. 44 (3), 675-684 (2006).</li><li>Stuyver, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nomenclature+for+antiviral-resistant+human+hepatitis+B+virus+mutations+in+the+polymerase+region.">Nomenclature for antiviral-resistant human hepatitis B virus mutations in the polymerase region.</a> Hepatology. 33 (3), 751-757 (2001).</li><li>Ochiya, T., Tsurimoto, T., Ueda, K., Okubo, K., Shiozawa, M., Matsubara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+system+for+infection+with+hepatitis+B+virus+that+uses+primary+human+fetal+hepatocytes.">An in vitro system for infection with hepatitis B virus that uses primary human fetal hepatocytes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86 (6), 1875-1879 (1989).</li><li>Galle, P. R., Hagelstein, J., Kommerell, B., Volkmann, M., Schranz, P., Zentgraf, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+experimental+infection+of+primary+human+hepatocytes+with+hepatitis+B+virus.">In vitro experimental infection of primary human hepatocytes with hepatitis B virus.</a> Gastroenterology. 106 (3), 664-673 (1994).</li><li>Gripon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+a+human+hepatoma+cell+line+by+hepatitis+B+virus.">Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (24), 15655-15660 (2002).</li><li>Murakami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+novel+direct+acting+antiviral+agents+for+HBV+using+in+silico+screening.">Discovering novel direct acting antiviral agents for HBV using in silico screening.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 456 (1), 20-28 (2015).</li><li>Ladner, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+expression+of+human+hepatitis+B+virus+(HBV)+in+stably+transfected+hepatoblastoma+cells:+a+novel+system+for+screening+potential+inhibitors+of+HBV+replication.">Inducible expression of human hepatitis B virus (HBV) in stably transfected hepatoblastoma cells: a novel system for screening potential inhibitors of HBV replication.</a> Antimicrob. Agents. Chemother. 41 (8), 1715-1720 (1997).</li><li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+taurocholate+cotransporting+polypeptide+is+a+functional+receptor+for+human+hepatitis+B+and+D+virus.">Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus.</a> Elife. 3, (2012).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-competent+infectious+hepatitis+B+virus+vectors+carrying+substantially+sized+transgenes+by+redesigned+viral+polymerase+translation.">Replication-competent infectious hepatitis B virus vectors carrying substantially sized transgenes by redesigned viral polymerase translation.</a> PLoS. One. 8, 60306 (2013).</li><li>Chaisomchit, S., Tyrrell, D. L., Chang, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+replicative+and+nonreplicative+hepatitis+B+virus+vectors.">Development of replicative and nonreplicative hepatitis B virus vectors.</a> Gene. Ther. 4 (12), 1330-1340 (1997).</li><li>Hong, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+recombinant+hepatitis+B+virus+vectors+efficiently+deliver+protein+and+RNA+encoding+genes+into+primary+hepatocytes.">Novel recombinant hepatitis B virus vectors efficiently deliver protein and RNA encoding genes into primary hepatocytes.</a> J. Virol. 87 (12), 6615-6624 (2013).</li><li>Hall, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+luciferase+reporter+from+a+deep+sea+shrimp+utilizing+a+novel+imidazopyrazinone+substrate.">Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate.</a> ACS. Chem. Biol. 7 (11), 1848-1857 (2012).</li><li>Nishitsuji, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+reporter+system+to+monitor+early+stages+of+the+hepatitis+B+virus+life+cycle.">Novel reporter system to monitor early stages of the hepatitis B virus life cycle.</a> Cancer. Sci. 106 (11), 1616-1624 (2015).</li><li>Sugiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+hepatitis+B+virus+genotypes+on+the+intra-+and+extracellular+expression+of+viral+DNA+and+antigens.">Influence of hepatitis B virus genotypes on the intra- and extracellular expression of viral DNA and antigens.</a> Hepatology. 44 (4), 915-924 (2006).</li><li>Seeger, C., Zoulim, F., Mason, W., Knipe, D., Howley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepadnaviruses.">Hepadnaviruses.</a> Field Virology. Volume 1. , 2185-2221 (2013).</li><li>Moolla, N., Kew, M., Arbuthnot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+elements+of+hepatitis+B+virus+transcription.">Regulatory elements of hepatitis B virus transcription.</a> J. Viral. Hepat. 9 (5), 323-331 (2002).</li><li>Cattaneo, R., Will, H., Schaller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+B+virus+transcription+in+the+infected+liver.">Hepatitis B virus transcription in the infected liver.</a> EMBO. J. 3 (9), 2191-2196 (1984).</li><li>Enders, G. H., Ganem, D., Varmus, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+major+transcripts+of+ground+squirrel+hepatitis+virus:+the+presumptive+template+for+reverse+transcriptase+is+terminally+redundant.">Mapping the major transcripts of ground squirrel hepatitis virus: the presumptive template for reverse transcriptase is terminally redundant.</a> Cell. 42 (1), 297-308 (1985).</li><li>Haines, K. M., Loeb, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sequence+of+the+RNA+primer+and+the+DNA+template+influence+the+initiation+of+plus-strand+DNA+synthesis+in+hepatitis+B+virus.">The sequence of the RNA primer and the DNA template influence the initiation of plus-strand DNA synthesis in hepatitis B virus.</a> J. Mol. Biol. 370 (3), 471-480 (2007).</li><li>Hirsch, R. C., Lavine, J. E., Chang, L. J., Varmus, H. E., Ganem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+gene+products+of+hepatitis+B+viruses+are+required+for+genomic+RNA+packaging+as+well+as+for+reverse+transcription.">Polymerase gene products of hepatitis B viruses are required for genomic RNA packaging as well as for reverse transcription.</a> Nature. 344 (6266), 552-555 (1990).</li></ol>

الجينوم HBV أربعة إطارات الابتدائية مفتوحة القراءة (ORFS) بما في ذلك النواة، البلمرة، السطحية وX ORFS (الشكل 1). وينظم النسخ من هذه ORFS أربعة HBV بإحكام من قبل أربعة مروجين: المروج precore / الأساسية التي تحتوي على محسن الثاني، S1 المروج، والمروج S2 وX المروج التي تحتوي على م?...

عدوى مزمنة بفيروس التهاب الكبد B (HBV) هو عامل خطر رئيسي لأمراض الكبد المزمنة 1. وعلى الرغم من الاستراتيجيات العلاجية الحالية القائمة على النظير النوكليوتيدات التي تمنع الالتهاب الكبدي الوبائي وظيفة بول و / أو إدارة من النوع الأول الإنترفيرون الذي ينشط الاستجابات المناعية عند الأفراد المصابين وكذلك قمع غير مباشرة انتشار الالتهاب الكبدي الوبائي من خلال حفز الانترفيرون وظائف الجينات 2، ويمكن لهذه العلاجات لا يلغي الالتهاب الكبدي الوبائي الحمض النووي تماما 3. وعلاوة على ذلك، فإن ظهور HBVs التي تقاوم عوامل مضادة للبول هو من القلق 4. وقد أظهرت إدارة جنبا إلى جنب العوامل المضادة للفيروسات التي تستهدف بشكل مباشر على الخطوات المختلفة لفيروس نقص المناعة البشري (HIV) أو التهاب الكبد الوبائي (سي) دورة الحياة لقمع بنجاح أو القضاء على فيروس (الخانات). مشابهة لهذه الفكرة، ووضع مكافحة الالتهاب الكبدي الوبائي وكيل (ق) التي تعمل مباشرة على مراحل مختلفة من Hدورة الحياة BV مهمة لتأسيس العلاجات الالتهاب الكبدي الوبائي في المستقبل. بشكل عام، وإنشاء بسيط في نظام الثقافة المختبر من الفيروس هدف يسهل تطوير عوامل مضادة للفيروس. ومع ذلك، هناك اثنين على الاقل من الحواجز التي تحول دون تطوير نظم الاستزراع في المختبر لفحص عوامل مضادة للالتهاب الكبد البائي. الأول هو عدم وجود نظام في المختبر زراعة الخلايا مناسب لفيروس التهاب الكبد B عدوى / انتشار الأسلحة النووية. على عكس غيره من الفيروسات، مثل فيروس نقص المناعة البشرية والتهاب الكبد الوبائي، والتي تم نشرها في خطوط الخلايا المعمول بها، فإنه من الصعب زراعة الالتهاب الكبدي الوبائي في المختبر بسبب القيود التجريبية بما في ذلك مجموعة المضيف ضيق. استخدام نظم محددة ثقافة الخلية مثل خط خلية الكبدي البشري HepaRG، الذي هو عرضة للعدوى الالتهاب الكبدي الوبائي، 5، 6، وقد وضعت 7 إلى التغلب على هذه المشاكل. وعلاوة على ذلك، فإن الخلايا PXB، معزولة عن يوروكيناز-تايالمؤسسة العامة المنشط plasminogen المعدلة وراثيا / الفئران SCID تلقيح مع الكبدية الإنسان الأساسية (PHH) عرضت، لتكون عرضة للعدوى الالتهاب الكبدي الوبائي وتكرار 8. ومع ذلك، مستويات تكرار الالتهاب الكبدي الوبائي في HepaRG تعتمد على حالة التمايز الخلوي بعد والثقافة، والذي يمكن أن يسبب نتائج غير متناسقة وirreproducible من مستويات العدوى / تكرار الالتهاب الكبدي الوبائي. يستخدم PXB عادة للتجارب العدوى ولكن محدودة بسبب توافره. والالتهاب الكبدي الوبائي محرض خط خلية التعبير التتراسيكلين، HepAD38، كما تم استخدامها على نطاق واسع لدراسة تكرار الالتهاب الكبدي الوبائي، ولكن هذا النظام يسمح فقط تقييم بعد النسخ وليس في خطوة دخول العدوى 9. في الآونة الأخيرة، سمحت تحديد ببتيد الصوديوم توروكولات cotransporting (NTCP) بمثابة مستقبلات وظيفية لHBV تطوير نظام الثقافة HBV متغير 10. في الواقع، NTCP التعبير في خلايا سرطانة الكبد غير عرضة مثل Huh7 وHepG2 تمكن عدوى الالتهاب الكبدي الوبائي (10) وبالتالي، تم توسيع وتنويع اختياراتك في خطوط الخلايا عرضة HBV، وحل العديد من القيود التجريبية. المشكلة الثانية هي عدم وجود نظام فحص بسيط لتقييم العدوى والتكرار. وعادة ما يتم إجراء تقييم العدوى عن طريق تحليل HBV DNA و RNA والبروتينات. ومع ذلك، وتحديد حجم هذه العلامات الفيروس هو مضيعة للوقت، في كثير من الأحيان مكلفا وليس بسيطا دائما. لذلك، وتطوير نظام فحص بسيط، مثل استخدام الجينات المراسل، قد تغلب على المشاكل المرتبطة بنظم HBV فحص. ومع ذلك، لأن حجم الجينوم التي يمكن تعبئتها إلى القفيصة HBV محدودة - أقل من 3.7 كيلو بايت 11 - حجم الجين مراسل يجب أن تكون قصيرة قدر الإمكان. وعلاوة على ذلك، فإن وجود عناصر رابطة الدول المستقلة المتعددة المنتشرة في جميع أنحاء الجينوم، التي تعتبر ضرورية لتكاثر الفيروس، يحد من الوظائف المتاحة لفي<html> sertion من الجين مراسل في الجينوم. وقد حاول العديد من التقارير لادخال الجينات الغريبة، بما في ذلك فيروس نقص المناعة البشرية-1 تات والأخضر بروتين فلوري، وعن dsRed، في جينوم فيروس الالتهاب الكبدى ب 11 و 12 و 13. ومع ذلك، هذه HBVs المؤتلف ليست مفيدة لفحص الالتهاب الكبدي الوبائي عدوى / التكرار، أو لفحص عالية الإنتاجية من العوامل التي تؤثر عدوى الالتهاب الكبدي الوبائي / النسخ المتماثل. هذا هو السبب الرئيسي لانخفاض الإنتاجية من الفيروسات المؤتلف وانخفاض كثافة التعبير مراسل الجينات التي تسببها إنتاج فيروس فعالة. للتغلب على هذه القضايا، فإننا شيدت HBV مراسل مع ارتفاع العائد من إنتاج فيروس. هذا الفيروس حساس للغاية لرصد المراحل المبكرة من دورة النسخ المتماثل HBV، من الدخول إلى النسخ. ولتحقيق ذلك، تم اختيار NanoLuc (NL) باسم الجينات علامة لأنه هو صغير (171 الأحماض الأمينية) هندستها مراسل الانارةالطبقة = &quot;XREF&quot;&gt; 14. وعلاوة على ذلك، NL ما يقرب من 150 أضعاف أكثر إشراقا من يراعة أو Renilla وسيفيراز، وردود الفعل الانارة هو ATP مستقل، مما يشير إلى أن معدل ضرب كاذبة سوف تكون منخفضة للكشف عن الإنتاجية العالية. كفاءة إنتاج HBV المؤتلف حوالي 1/5 من الوالد الالتهاب الكبدي الوبائي، وتشبه إلى مستويات ذكرت بحثا عن الفيروسات المؤتلف HBV السابقة؛ ومع ذلك، فإن سطوع NL يتغلب على قضايا الإنتاجية فيروس لذلك يمكن استخدامها لفحص كتلة من عوامل مضادة للالتهاب الكبد البائي. فحص وكلاء مكافحة الالتهاب الكبدي الوبائي باستخدام خلايا الكبد الأولية، قد يكون HepaRG، HepAD38 وخلايا الكبد NTCP-transduced مفيدة لفحص وكلاء مكافحة الالتهاب الكبدي الوبائي من الطريقة التقليدية (ق). ومع ذلك، فإن النظام المذكور هنا له مزايا عديدة مثل معالجة بسيطة، وحساسية عالية، والتكلفة المنخفضة للفحص. هذه المزايا هي مناسبة لفحوصات إنتاجية عالية لتطوير وتحديد عوامل الالتهاب الكبدي الوبائي الجديد لأغراض علاجية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="781">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">Nano-Glo Luciferase Assay Regent</td>
			<td style="width:201px;">Promega</td>
			<td style="width:160px;">N1110</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Streptomycin Mixed Solution</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>09367-34&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11995065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:332px;">100 mm/collagen-coated dish</td>
			<td>Iwaki</td>
			<td>4020-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3000001&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polyethylene glycol (PEG) 6000&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polyethylene glycol (PEG) 8000&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>31319-45&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.5 mol/l-EDTA Solution</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>06894-14&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris-HCl</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>35434-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Millex-HP, 0.45 &#956;m, polyethethersulfone, filter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLHP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagen coated 96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>NO3585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Passive Lysis 5xBuffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GloMax 96 Microplate Luminometer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E6501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sucrose</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>30403-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luminometer plate</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>655075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HepG2-NTCP1-myc-clone22</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Reference 15</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pUC1.2HBV delta epsilon</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Reference 15</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pUC1.2HBV/NL</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Reference 15</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">50 ml tube</td>
			<td>Violamo</td>
			<td>1-3500-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Myc antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBIG</td>
			<td>Japan Blood Products Organization</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IFN-&#946;</td>
			<td>Mochida Pharmaceutical</td>
			<td>14987224005413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a hepatitis b virus reporter system to monitor the early stages of the replication cycle

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), that carry foreign genes such as a reporter or marker protein in their genomes. These recombinant viruses usually faithfully mimic the life cycle of the original virus in infected cells and exhibit the same host range dependence. The development of a recombinant virus enables the efficient screening of inhibitors and the identification of specific host factors. However, to date the construction of recombinant hepatitis B virus (HBV) has been difficult because of various experimental limitations. The main limitation is the compact genome size of HBV, and a fairly strict genome size that does not exceed 1.3 genome sizes, that must be packaged into virions. Thus, the size of a foreign gene to be inserted should be smaller than 0.4 kb if no deletion of the genome DNA is to be performed. Therefore, to overcome this size limitation, the deletion of some HBV DNA is required. Here, we report the construction of recombinant HBV encoding a reporter gene to monitor the early stage of the HBV replication cycle by replacing part of the HBV core-coding region with the reporter gene by deleting part of the HBV pol coding region. Detection of recombinant HBV infection, monitored by the reporter activity, was highly sensitive and less expensive than detection using the currently available conventional methods to evaluate HBV infection. This system will be useful for a number of applications including high-throughput screening for the identification of anti-HBV inhibitors, host factors and virus-susceptible cells.

ويبين الشكل 1 تخطيطي للجينوم فيروس التهاب الكبد B، الرنا كتب والبروتينات الفيروس والمنطقة الترميز على الجينوم. وأشار أيضا الجين مراسل وموقعها في الجينوم. ويبين الشكل 2 HBV البلازميد مراسل ومساعد البلازميد التي تحتوي على الجين المرا...

Watch this Scientific Journal Video about Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle at JoVE.com

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

نحن هنا وصف وضعت حديثا فيروس التهاب الكبد B (HBV) نظام مراسل لمراقبة مراحل مبكرة من دورة حياة الالتهاب الكبدي الوبائي. وهذا مبسطة في نظام المختبر مساعدة في فحص وكلاء مكافحة الالتهاب الكبدي الوبائي باستخدام استراتيجية عالية الإنتاجية.

تطوير نظام الفيروسات مراسل التهاب الكبد B لرصد المراحل المبكرة من دورة النسخ المتماثل

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

وضع علامة سلبية لإختيار a المتحولة الحالة للنسج</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

تشريح المضيف للفيروسات التفاعل في النسخ المتماثل التحللي من الفيروسة الموديل

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

بروتوكول لتحليل التهاب الكبد الوبائي فيروس النسخ المتماثل

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

Mouse Fetal Liver Culture System to Dissect Target Gene Functions at the Early and Late Stages of Terminal Erythropoiesis

الماوس الجنين الكبد نظام الثقافة لتشريح الهدف جين وظائف في المراحل المبكرة والمتأخرة من محطة الكريات الحمر

Erythropoiesis involves a dynamic process that begins with committed erythroid burst forming units (BFU-Es) followed by rapidly dividing erythroid colony ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

في تحليل المختبر من الاستجابة المناعية الخلوية بوساطة Myd88 لفيروس غرب النيل المسخ سلالة العدوى

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus

المناعي لمراقبة الخلوية امتصاص اللاكتوفيرين الإنسان ولها نشاط مضاد للفيروسات أسوشيتد ضد فيروس التهاب الكبد الوبائي C

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or ...

Rearing Ixodes scapularis, the Black-legged Tick: Feeding Immature Stages on Mice

Rearing Ixodes scapularis, the Black-legged Tick: Feeding Immature Stages on Mice

تربية<em&gt; اللبود الكتفي،</em&gt; القراد الأسود أرجل: تغذية مراحل غير ناضجة على الفئران

Ixodes scapularis, the vector of Lyme disease, is one of the most important disease vectors in the eastern and Midwestern United States. This species is a ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

نظام تغذية خالية رواية للإنتاج الضخم للخلايا القاتلة الطبيعية مورين في المختبر

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

الجمعية وتنقية من النموذج إينتاسوميس فيروس مزبد

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

استخراج سريعة وآمنة وبسيطة دليل السرير الحمض النووي للكشف عن الفيروس في عينات الدم كله

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...