Name: development of a hepatitis b virus reporter system to monitor the early stages of the replication cycle
Uploaded: 2017-02-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle at JoVE.com

This work was supported in part by the Research Program on Hepatitis from Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) and by Grants-in-Aids for Scientific Research from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT) of Japan.

הפקה 1. של HBV רקומביננטי המקודד את החלבון Reporter <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת התאים HepG2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן בינוני תרבית תאים (הבינוני של הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור עובר (FBS), 100 פניצילין U / ml, ...

<ol>
	<li>Fattovich, G., Stroffolini, T., Zagni, I., Donato, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocellular+carcinoma+in+cirrhosis:+incidence+and+risk+factors.">Hepatocellular carcinoma in cirrhosis: incidence and risk factors.</a> Gastroenterology. 127 (5), 35-50 (2004).</li><li>Revill, P., Testoni, B., Locarnini, S., Zoulim, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+strategies+are+required+to+cure+and+eliminate+HBV+infection.">Global strategies are required to cure and eliminate HBV infection.</a> Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 13 (4), 239-248 (2016).</li><li>Wursthorn, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peginterferon+alpha-2b+plus+adefovir+induce+strong+cccDNA+decline+and+HBsAg+reduction+in+patients+with+chronic+hepatitis+B.">Peginterferon alpha-2b plus adefovir induce strong cccDNA decline and HBsAg reduction in patients with chronic hepatitis B.</a> Hepatology. 44 (3), 675-684 (2006).</li><li>Stuyver, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nomenclature+for+antiviral-resistant+human+hepatitis+B+virus+mutations+in+the+polymerase+region.">Nomenclature for antiviral-resistant human hepatitis B virus mutations in the polymerase region.</a> Hepatology. 33 (3), 751-757 (2001).</li><li>Ochiya, T., Tsurimoto, T., Ueda, K., Okubo, K., Shiozawa, M., Matsubara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+system+for+infection+with+hepatitis+B+virus+that+uses+primary+human+fetal+hepatocytes.">An in vitro system for infection with hepatitis B virus that uses primary human fetal hepatocytes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86 (6), 1875-1879 (1989).</li><li>Galle, P. R., Hagelstein, J., Kommerell, B., Volkmann, M., Schranz, P., Zentgraf, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+experimental+infection+of+primary+human+hepatocytes+with+hepatitis+B+virus.">In vitro experimental infection of primary human hepatocytes with hepatitis B virus.</a> Gastroenterology. 106 (3), 664-673 (1994).</li><li>Gripon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+a+human+hepatoma+cell+line+by+hepatitis+B+virus.">Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (24), 15655-15660 (2002).</li><li>Murakami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+novel+direct+acting+antiviral+agents+for+HBV+using+in+silico+screening.">Discovering novel direct acting antiviral agents for HBV using in silico screening.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 456 (1), 20-28 (2015).</li><li>Ladner, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+expression+of+human+hepatitis+B+virus+(HBV)+in+stably+transfected+hepatoblastoma+cells:+a+novel+system+for+screening+potential+inhibitors+of+HBV+replication.">Inducible expression of human hepatitis B virus (HBV) in stably transfected hepatoblastoma cells: a novel system for screening potential inhibitors of HBV replication.</a> Antimicrob. Agents. Chemother. 41 (8), 1715-1720 (1997).</li><li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+taurocholate+cotransporting+polypeptide+is+a+functional+receptor+for+human+hepatitis+B+and+D+virus.">Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus.</a> Elife. 3, (2012).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-competent+infectious+hepatitis+B+virus+vectors+carrying+substantially+sized+transgenes+by+redesigned+viral+polymerase+translation.">Replication-competent infectious hepatitis B virus vectors carrying substantially sized transgenes by redesigned viral polymerase translation.</a> PLoS. One. 8, 60306 (2013).</li><li>Chaisomchit, S., Tyrrell, D. L., Chang, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+replicative+and+nonreplicative+hepatitis+B+virus+vectors.">Development of replicative and nonreplicative hepatitis B virus vectors.</a> Gene. Ther. 4 (12), 1330-1340 (1997).</li><li>Hong, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+recombinant+hepatitis+B+virus+vectors+efficiently+deliver+protein+and+RNA+encoding+genes+into+primary+hepatocytes.">Novel recombinant hepatitis B virus vectors efficiently deliver protein and RNA encoding genes into primary hepatocytes.</a> J. Virol. 87 (12), 6615-6624 (2013).</li><li>Hall, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+luciferase+reporter+from+a+deep+sea+shrimp+utilizing+a+novel+imidazopyrazinone+substrate.">Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate.</a> ACS. Chem. Biol. 7 (11), 1848-1857 (2012).</li><li>Nishitsuji, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+reporter+system+to+monitor+early+stages+of+the+hepatitis+B+virus+life+cycle.">Novel reporter system to monitor early stages of the hepatitis B virus life cycle.</a> Cancer. Sci. 106 (11), 1616-1624 (2015).</li><li>Sugiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+hepatitis+B+virus+genotypes+on+the+intra-+and+extracellular+expression+of+viral+DNA+and+antigens.">Influence of hepatitis B virus genotypes on the intra- and extracellular expression of viral DNA and antigens.</a> Hepatology. 44 (4), 915-924 (2006).</li><li>Seeger, C., Zoulim, F., Mason, W., Knipe, D., Howley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepadnaviruses.">Hepadnaviruses.</a> Field Virology. Volume 1. , 2185-2221 (2013).</li><li>Moolla, N., Kew, M., Arbuthnot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+elements+of+hepatitis+B+virus+transcription.">Regulatory elements of hepatitis B virus transcription.</a> J. Viral. Hepat. 9 (5), 323-331 (2002).</li><li>Cattaneo, R., Will, H., Schaller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+B+virus+transcription+in+the+infected+liver.">Hepatitis B virus transcription in the infected liver.</a> EMBO. J. 3 (9), 2191-2196 (1984).</li><li>Enders, G. H., Ganem, D., Varmus, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+major+transcripts+of+ground+squirrel+hepatitis+virus:+the+presumptive+template+for+reverse+transcriptase+is+terminally+redundant.">Mapping the major transcripts of ground squirrel hepatitis virus: the presumptive template for reverse transcriptase is terminally redundant.</a> Cell. 42 (1), 297-308 (1985).</li><li>Haines, K. M., Loeb, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sequence+of+the+RNA+primer+and+the+DNA+template+influence+the+initiation+of+plus-strand+DNA+synthesis+in+hepatitis+B+virus.">The sequence of the RNA primer and the DNA template influence the initiation of plus-strand DNA synthesis in hepatitis B virus.</a> J. Mol. Biol. 370 (3), 471-480 (2007).</li><li>Hirsch, R. C., Lavine, J. E., Chang, L. J., Varmus, H. E., Ganem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+gene+products+of+hepatitis+B+viruses+are+required+for+genomic+RNA+packaging+as+well+as+for+reverse+transcription.">Polymerase gene products of hepatitis B viruses are required for genomic RNA packaging as well as for reverse transcription.</a> Nature. 344 (6266), 552-555 (1990).</li></ol>

הגנום HBV יש ארבע מסגרות קריאה פתוחות עיקריות (ORFs) כולל הליבה, פולימראז, המשטח ו- X ORFs (איור 1). תמלול של ארבעה HBV ORFs מוסדר בחוזקה על ידי ארבעה יזמים: אמרגן precore / ליבה המכילים שפר שני, אמרגן S1, אמרגן האמרגן ו- X S2 המכיל משפר לי 18. תעתיקי 3.5 קילו ו 3.4 kb מתורגמ?...

זיהום כרוני בנגיף הפטיטיס B (HBV) מהווה גורם סיכון עיקרי למחלות כבדות כרונית 1. למרות אסטרטגיות טיפוליות נוכחיות מבוססות על אנלוגים נוקלאוטיד המעכבות פונקצית pol HBV ו / או הממשל של אינטרפרון מסוג I שמפעיל מערכת חיסונית אצל אנשים נגועים וכן בעקיפין התפשטות HBV דיכוי באמצעות פונקציות גן מגורה אינטרפרון 2, טיפולים אלה לא יכולים לחסל HBV DNA לחלוטין 3. יתר על כן, הופעתה של HBVs כי הם עמידים בפני סוכני-Pol אנטי היא דאגה 4. הממשל של תרופות אנטי-ויראליות בשילוב ישירות מיקוד השלבים השונים של וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) או הפטיטיס C וירוס מחזור החיים (HCV) הוצגה לדכא בהצלחה או למגר את הנגיף (es). דומה לרעיון זה, פיתוח חומר נוגד-HBV (ים) אשר פועל ישירות על השלבים השונים של Hמחזור החיים BV חשוב לביסוס טיפולים HBV בעתיד. באופן כללי, הקמת פשוט במערכת התרבות חוץ גופית של הנגיף היעד מקל על הפיתוח של תרופות אנטי-וירוס. עם זאת, ישנם לפחות שני מחסומים לפיתוח מערכות תרבות במבחנה להקרין תרופות אנטי-HBV. הראשון הוא העדר מערכת תרבית תאים נוח במבחנה עבור זיהום HBV / התפשטות. שלא כמו וירוסים אחרים, כגון HIV HCV, אשר מופצים בשורות תאים הוקמו, קשה לטפח HBV במבחנה בשל מגבלות ניסוי כוללים מגוון מארח צר. השימוש במערכות תרבית תאים ספציפיות כגון שורת תאי hepatoma אדם HepaRG, שהוא רגיש לזיהום HBV, 5, 6, 7 פותחו כדי להתגבר על בעיות אלה. יתר על כן, תאי PXB, מבודדים מן-טאי האוריקינאזמהונדס activator plasminogen PE / עכברים SCID מחוסן עם hepatocyte אדם מן המעלה הראשונה (PHH), הוצגו להיות רגישים לזיהום HBV ושכפול 8. עם זאת, רמות שכפולות HBV ב HepaRG תלויות מדינת ההתמיינות אחרי התרבות, אשר יכול לגרום לתוצאות עקביות irreproducible של רמות HBV זיהום / שכפול. PXB משמש בדרך כלל ניסויי זיהום HBV אך מוגבל בגלל זמינותו. שורת תאי ביטוי HBV מושרה טטרציקלין, HepAD38, גם נעשתה שימוש נרחב ללמוד שכפול HBV, אבל מערכת זו מאפשרת רק הערכה לאחר שעתוק ולא צעד כניסת HBV זיהום 9. לאחרונה, זיהוי של פוליפפטיד cotransporting נתרן taurocholate (NTCP) כמו קולטן פונקציונלי עבור HBV אפשרה פיתוח של מערכת התרבות משתנה HBV 10. אכן, ביטוי NTCP בתאי hepatocarcinoma שאינם רגישים כגון Huh7 וHepG2 מאפשרת זיהום HBV 10 וכך, הבחירה של שורות תאים רגישים HBV הורחבה, לפתרון רב מהמגבלות ניסיון. הבעיה השנייה היא חוסר מערכת assay פשוט להעריך זיהום HBV ושכפול. הערכת זיהום HBV מתבצעת לרוב על ידי ניתוח HBV DNA, RNA וחלבונים. עם זאת, כימות של סמנים אלה של הווירוס הוא גוזל זמן, לעתים קרובות יקר ולא תמיד פשוט. לכן, הפיתוח של מערכת assay פשוטה, כגון שימוש גן כתב, אולי להתגבר על בעיות הקשורות במערכות assay HBV. עם זאת, מכיוון שהגודל הגנום כי ניתן לארוז לתוך קפסיד HBV מוגבל - פחות מ -3.7 kb 11 - בגודל של גן כתב צריך להיות קצר ככל האפשר. יתר על כן, נוכחותם של אלמנטי ציס מרובים הפזורים לאורך הגנום, שחיוניים שכפול נגיפי, מגבילה את המשרות פנויות ב<html> sertion של גן הכתב לתוך הגנום. כמה דיווחים ניסו להכניס גנים זרים, כולל HIV-1 טאט, חלבון פלואורסצנטי ירוק, DsRed, לתוך הגנום HBV 11, 12, 13. עם זאת, HBVs רקומביננטי אלה אינם יעילים לסינון HBV זיהום / שכפול, או להקרנת התפוקה הגבוהה של גורמים המשפיעים HBV זיהום / שכפול. זאת בעיקר בגלל הפריון הנמוך של וירוסים רקומביננטי והעוצמת המופחתים של ביטוי גני כתב הנגרם על ידי ייצור וירוס יעיל. כדי להתגבר על בעיות אלה, בנינו HBV כתב עם תשואה גבוהה של ייצור וירוס. וירוס זה רגיש מאוד לניטור בשלבים המוקדמים של מחזור שכפול HBV, מן הכניסה שעתוק. כדי להשיג זאת, NanoLuc (NL) נבחר גן סמן בגלל זה הוא (חומצות אמינו 171) קטנות מהונדסות כתב זורחclass = &quot;Xref&quot;&gt; 14. יתר על כן, NL הוא כ 150-לקפל בהירים יותר גחלילית או בלוציפראז Renilla, והתגובה הזורחת היא ATP-עצמאית, דבר המצביעה על כך אחוזי הצלחת השווא יהיו נמוכים להקרנת תפוקה גבוהה. יעילות הייצור של HBV רקומביננטי הוא כ 1/5 של ההורה HBV, ובדומה לרמות דיווחו לאיתור וירוסים הקודם רקומביננטי HBV; עם זאת, את הבהירות של NL מתגברת בעיות פריון וירוס, כך שהוא יכול לשמש להקרנה ההמונית של תרופות אנטי-HBV. הקרנת חומרים אנטי-HBV באמצעות hepatocytes העיקרי, HepaRG, HepAD38 ו hepatocytes-transduced NTCP יכול להיות שימושי לצורך ההקרנה של תרופות אנטי-HBV ידי השיטה המקובלת (ים). עם זאת, המערכת המתוארת כאן יש יתרונות שונים כגון טיפול פשוט, רגישות גבוהה, ועלות נמוכה להקרנה. יתרונות אלה מתאימים מבחני תפוקה גבוהים לפתח אילו חומרי HBV חדשים למטרות טיפוליות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="781">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">Nano-Glo Luciferase Assay Regent</td>
			<td style="width:201px;">Promega</td>
			<td style="width:160px;">N1110</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Streptomycin Mixed Solution</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>09367-34&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11995065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:332px;">100 mm/collagen-coated dish</td>
			<td>Iwaki</td>
			<td>4020-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3000001&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polyethylene glycol (PEG) 6000&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polyethylene glycol (PEG) 8000&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>31319-45&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.5 mol/l-EDTA Solution</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>06894-14&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris-HCl</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>35434-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Millex-HP, 0.45 &#956;m, polyethethersulfone, filter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLHP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagen coated 96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>NO3585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Passive Lysis 5xBuffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GloMax 96 Microplate Luminometer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E6501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sucrose</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>30403-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luminometer plate</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>655075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HepG2-NTCP1-myc-clone22</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Reference 15</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pUC1.2HBV delta epsilon</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Reference 15</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pUC1.2HBV/NL</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Reference 15</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">50 ml tube</td>
			<td>Violamo</td>
			<td>1-3500-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Myc antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBIG</td>
			<td>Japan Blood Products Organization</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IFN-&#946;</td>
			<td>Mochida Pharmaceutical</td>
			<td>14987224005413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a hepatitis b virus reporter system to monitor the early stages of the replication cycle

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), that carry foreign genes such as a reporter or marker protein in their genomes. These recombinant viruses usually faithfully mimic the life cycle of the original virus in infected cells and exhibit the same host range dependence. The development of a recombinant virus enables the efficient screening of inhibitors and the identification of specific host factors. However, to date the construction of recombinant hepatitis B virus (HBV) has been difficult because of various experimental limitations. The main limitation is the compact genome size of HBV, and a fairly strict genome size that does not exceed 1.3 genome sizes, that must be packaged into virions. Thus, the size of a foreign gene to be inserted should be smaller than 0.4 kb if no deletion of the genome DNA is to be performed. Therefore, to overcome this size limitation, the deletion of some HBV DNA is required. Here, we report the construction of recombinant HBV encoding a reporter gene to monitor the early stage of the HBV replication cycle by replacing part of the HBV core-coding region with the reporter gene by deleting part of the HBV pol coding region. Detection of recombinant HBV infection, monitored by the reporter activity, was highly sensitive and less expensive than detection using the currently available conventional methods to evaluate HBV infection. This system will be useful for a number of applications including high-throughput screening for the identification of anti-HBV inhibitors, host factors and virus-susceptible cells.

איור 1 מציג סכמה של הגנום HBV, RNAs עבד, חלבוני וירוס ובאזור הקידוד שלהם על הגנום. גן הכתב ומיקומו בגנום מסומן גם. איור 2 מציג את פלסמיד כתב HBV ו עוזרים פלסמיד המכיל את הגן המדווח. כתב pUC1.2HBV / NL נבנה על ידי מחיקת עמדות נוקלאוטיד 223-811 מאתר ייז...

Watch this Scientific Journal Video about Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle at JoVE.com

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

כאן אנו מתארים מערכת הכתב החדש שפותח הפטיטיס B וירוס (HBV) לפקח בשלבים המוקדמים של מחזור החיים HBV. זה פשוט יותר במערכת במבחנה יסייע ההקרנה של תרופות אנטי-HBV משתמש באסטרטגיה תפוקה גבוהה.

פיתוח של מערכת Reporter וירוס הפטיטיס B לפקח בשלבים המוקדמים של מחזור שכפול

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

פיתוח מרקר לבחירה שלילי Entamoeba histolytica</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

אינטראקצית מארח וירוס ביתור בשכפול של וירוס ההרפס ממוסס דגם

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

פרוטוקול לניתוח שכפול נגיף הצהבת מסוג C

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

Mouse Fetal Liver Culture System to Dissect Target Gene Functions at the Early and Late Stages of Terminal Erythropoiesis

עכבר עוברי כבד מערכת התרבות לנתח פונקציות היעד ג&#39;ין בשלבים המוקדמים ומאוחרים של המסוף erythropoiesis

Erythropoiesis involves a dynamic process that begins with committed erythroid burst forming units (BFU-Es) followed by rapidly dividing erythroid colony ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

בניתוח חוץ גופייה של תיווך Myd88 הסלולרי תגובה החיסונית לוירוס הנילוס המערבי זיהום הזנים Mutant

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus

Immunofluorescence לפקח על הספיגה הסלולארית של לקטופרין האדם והפעילות הקשורה אנטי נגד וירוס הצהבת מסוג C

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or ...

Rearing Ixodes scapularis, the Black-legged Tick: Feeding Immature Stages on Mice

Rearing Ixodes scapularis, the Black-legged Tick: Feeding Immature Stages on Mice

Rearing<em&gt; Scapularis קרצית,</em&gt; את הטיק השחור רגליים: האכלת שלבי Immature על עכברים

Ixodes scapularis, the vector of Lyme disease, is one of the most important disease vectors in the eastern and Midwestern United States. This species is a ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

הרומן מזין ללא מערכת לייצור המוני של תאים רוצח טבעי מאתר במבחנה

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

הרכבה ולטיהור Intasomes וירוס קצפית אב-טיפוס

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

חילוץ מהיר, בטוח, ופשוט ידנית המיטה חומצת גרעין איתור וירוס בדגימות דם מלא

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...