Name: conjugative mating assays for sequence-specific analysis of transfer proteins involved in bacterial conjugation
Uploaded: 2017-01-04T12:30:00
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इस शोध कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग परिषद से एक डिस्कवरी अनुदान (NSERC) द्वारा समर्थित किया गया।

1. डीएनए निर्माणों के जनरेशन <ol><li> लक्ष्य जीन के मुताबिक़ पुनर्संयोजन के लिए oligomers डिजाइनिंग <ol><li> एक भी 55-72 बीपी आगे oligomer डिजाइन इस प्रकार है: (क) एक 19-32 बीपी लंबे न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम कि chloramphenicol acetyltransferase जीन...

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बैक्टीरियल विकार प्रक्रिया एक साधन है जिसके द्वारा बैक्टीरिया ऐसे एंटीबायोटिक प्रतिरोध मार्करों के प्रसार के रूप में चुनौतीपूर्ण वातावरण में विकास के लिए एक विकासवादी लाभ प्रदान जीन फैल सकता है। क?...

सूक्ष्म जीवधारी स्तर पर जीन और प्रोटीन के हस्तांतरण बैक्टीरियल अस्तित्व और विकास के रूप में अच्छी तरह से संक्रमण की प्रक्रिया में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है। बैक्टीरिया के बीच या एक जीवाणु और एक सेल के बीच डीएनए के आदान-परिवर्तन, विकार या वेक्टर पारगमन के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है। 1,2 संयुग्मन ऐसे कोलाई के रूप में ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया के बीच विकार के दौरान परिवर्तन और उस में पारगमन की तुलना में अद्वितीय है, डीएनए के हस्तांतरण के एक दाता नियंत्रित फैशन जिससे एक जटिल प्रणाली macromolecular दाता और प्राप्तकर्ता कोशिकाओं से जोड़ता में होता है। संयुग्मन भी सबसे सीधा रास्ता है जो बैक्टीरियल कोशिकाओं मेजबान कोशिकाओं के साथ बातचीत करने के लिए मेजबान सिस्टम में जीन, प्रोटीन या रसायन इंजेक्षन है। 3 अक्सर, ऐसे एजेंटों के हस्तांतरण मेजबान पर उल्लेखनीय प्रभाव, विकास और अनुकूलन की मेजबानी करने के रोगजनन और कैंसरजनन से लेकर है। ऐसा नहीं है कि संयुग्मी recombinatio दिखाया गया हैn पर्यावरण के तनाव की शर्तों के तहत उच्च उत्परिवर्तन दर के साथ बैक्टीरिया में अनुकूलन 3 गुना की दर बढ़ जाती है। 4 इसके अलावा, विकार अब तक का सबसे आम मार्ग के माध्यम से जो जीवाणु उपभेदों में एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीनों में फैले हुए हैं के द्वारा होता है। 5,6 सूक्ष्मजीवों सेलुलर झिल्ली भर में बड़े अणुओं के स्थानांतरण का समर्थन करने के लिए विशेष स्राव सिस्टम विकसित किया है; वर्तमान में वर्णित किया गया है कि ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया में स्राव सिस्टम (TSSs) के 9 प्रकार के होते हैं: T1SS, T2SS, T3SS, T4SS, T5SS, T6SS, T7SS, साथ ही धारा (स्राव) और गूंथना (दो arginine translocation) रास्ते। 7.8 स्राव प्रणाली के प्रत्येक प्रकार के आगे विभिन्न उपप्रकार में, एक आवश्यकता प्रोटीन की विविधता और शामिल रास्ते की विशिष्टता के कारण, विभिन्न जीवाणु उपभेदों में बांटा गया है। उदाहरण के लिए, प्रकार चतुर्थ स्राव प्रणाली (T4SS) में, तिवारी और कैग सिस्टम जबकि एफ प्लाज्मिड प्रेरक परिवहन की सुविधा, R27 एकएन डी pKM101 T4SSs एक संयुग्मी प्लाज्मिड के हस्तांतरण की सुविधा। 7,9,10 तंत्र है जिसके द्वारा जीवों एक प्राप्तकर्ता या अपने आसपास के वातावरण के साथ अपने घटक प्रोटीन से उनके संबंधित स्राव सिस्टम को इकट्ठा और सेलुलर सामग्री साझा करने की एक विस्तृत समझ लक्षित रणनीतियों के विकास रोगजनक सूक्ष्मजीवों और प्रक्रियाओं का मुकाबला करने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है सेलुलर संक्रमण। Lederberg और टेटम, 11 से ई कोलाई में प्रारंभिक पहचान बैक्टीरियल विकार के बाद मोबाइल और संयुग्मी plasmids की एक बड़ी संख्या की पहचान की और विशेषता किया गया है। 12 तरह के मोबाइल plasmids दिखाने काफी रेंज आकार (1 से 200 से अधिक kilobases (केबी) करने के लिए) है, लेकिन सभी मोबाइल plasmids एक relaxase, जो हस्तांतरण (Orit) जिससे प्लाज्मिड के प्रसारण के लिए सक्षम करने के मूल पहचानता होते हैं। संयुग्मी plasmids एक कार्यात्मक T4SS की विधानसभा के लिए आगे सांकेतिक शब्दों में जीन के साथ ही एक प्रकार हैचतुर्थ युग्मन प्रोटीन। 12 उदाहरण के लिए ई कोलाई के 100 केबी एफ प्लाज्मिड एक 33.3 kB हस्तांतरण (टीआरए) क्षेत्र के भीतर सभी संयुग्मी जीन encodes। 13 संयुग्मी प्लाज्मिड स्थानांतरण के दौरान सभी प्रोटीन है कि pilus गठन की सुविधा, जोड़ी गठन (एमपीएफ), डीएनए हस्तांतरण और बहिष्कार कार्यों संभोग एफ प्लाज्मिड सांकेतिक शब्दों का टीआरए क्षेत्र में जीनों। 10,14,15 ज्ञान का एक महत्वपूर्ण शरीर संयुग्मी T4SSs के लिए उपलब्ध है, लेकिन केवल अधिक हाल ही में उपलब्ध हो रहे हैं संयुग्मी प्रोटीन और परिसरों के संरचनात्मक अध्ययन विस्तृत जानकारी दी। 16 - 28 आदेश संयुग्मी प्रक्रिया के लिए एक व्यापक दृष्टिकोण को इकट्ठा करने के लिए, विस्तृत संरचनात्मक अध्ययन की एक युग्मन संयुग्मी हस्तांतरण प्रोटीन का विश्लेषण mutational करने के लिए आवश्यक है। इस संयुग्मी संभोग assays के माध्यम से हासिल किया जा सकता है। एफ प्लाज्मिड के लिए, प्रत्येक प्रोटीन टीआरए क्षेत्र के भीतर इनकोडिंग एफ की मध्यस्थता सह में एक भूमिका निभाता हैnjugation; इसलिए, पीटकर / एक हस्तांतरण के जीन का विलोपन सेल (चित्रा 1) के संयुग्मी क्षमता को समाप्त होगा। जबकि छोटे मोबाइल plasmids मानक विलोपन प्रक्रियाओं के लिए अनुकूल है, ऐसे एफ के रूप में बड़ा संयुग्मी plasmids के लिए कर रहे हैं, जीन नॉकआउट अधिक आसानी मुताबिक़ पुनर्संयोजन के माध्यम से प्राप्त कर रहे हैं, जहां लक्ष्य जीन एक एक अलग एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन संदेश के साथ बदल दिया है। वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम 55 केबी एफ प्लाज्मिड व्युत्पन्न pOX38-टीसी में chloramphenicol acetyltransferase (कैट) के साथ ब्याज की एक हस्तांतरण के जीन को बदलने के लिए मुताबिक़ पुनर्संयोजन को रोजगार; 29,30 परिणामी पीटकर प्लाज्मिड, pOX38-टीसी Δgene :: सेमी, विकास मीडिया में (सेमी) chloramphenicol की उपस्थिति के लिए प्रतिरोध की सुविधा। शरण pOX38-टीसी Δgene :: सेमी दाता कोशिकाओं संयुग्मी डीएनए स्थानांतरण / संभोग के रूप में एक संभोग परख के उपयोग के माध्यम से मनाया को प्रभावित करने में असमर्थ हैं; एक pOX38-टीसी Δgene :: सेमी दाता सेल के संभोग दक्षता और एक सामान्य RECIPient कमी होगी या, अधिक बार, समाप्त कर दिया जाना। pOX38-टीसी Δgene :: सेमी प्लाज्मिड के संयुग्मी हस्तांतरण लक्षित हस्तांतरण जीन को शरण देने के एक छोटे से वसूली प्लाज्मिड के माध्यम से बहाल किया जा सकता है। यह वसूली प्लाज्मिड एक है कि इस तरह के प्लाज्मिड pK184 (pK184-जीन), 31 या एक है कि इतने लंबे समय के रूप में है कि प्लाज्मिड ठीक से सेल (कोशिका द्रव्य या periplasm) के भीतर सही स्थान पर जीन लक्ष्य inducible अभिव्यक्ति प्रदान करता है के रूप में, विधान अभिव्यक्ति प्रदान करता है हो सकता है। नतीजतन, इस नए दाता के बीच संभोग assays में (pOX38-टीसी Δgene :: सेमी + pK184-जीन plasmids शरण) और एक प्राप्तकर्ता सेल, संभोग दक्षता लगभग कि एक सामान्य दाता प्राप्तकर्ता संभोग परख के लिए बहाल करने की उम्मीद है। इस प्रणाली pK184-जीन निर्माणों (विलोपन या बिंदु उत्परिवर्तन) की एक श्रृंखला की पीढ़ी के माध्यम से बाहर खटखटाया जीन के समारोह की जांच करने और प्रत्येक निर्माण के pOX38-टीसी Δgene :: मुख्यमंत्री को शरण देने का संभोग क्षमता को बहाल करने की क्षमता का परीक्षण करने के लिए एक सक्षम बनाता है दाता सेलएस।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="762">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:255px;">GeneJet Plasmid Mini-Prep Kit</td>
			<td style="width:165px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">K0503</td>
			<td style="width:212px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">GeneJet Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:165px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">K0692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">GeneJet PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:165px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">K0702</td>
			<td style="width:212px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E0554S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Broad Range DNA Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0303A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Petri Dishes</td>
			<td style="width:165px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">FB0875713</td>
			<td style="width:212px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Electroporator</td>
			<td style="width:165px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:131px;">4309000027</td>
			<td style="width:212px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Electroporation cuvettes</td>
			<td style="width:165px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">FB101</td>
			<td style="width:212px;">Cuvettes have a 1 mm gap.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Enzymes</td>
			<td style="width:165px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:212px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">AvaI</td>
			<td style="width:165px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">R0152S</td>
			<td style="width:212px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">EcoRI</td>
			<td style="width:165px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">R0101S</td>
			<td style="width:212px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">HindIII</td>
			<td style="width:165px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">R0104L</td>
			<td style="width:212px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">NdeI</td>
			<td style="width:165px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">R0111S</td>
			<td style="width:212px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Phusion DNA Polymerase</td>
			<td style="width:165px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">M0530L</td>
			<td style="width:212px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:165px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">M0202S</td>
			<td style="width:212px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">DpnI</td>
			<td style="width:165px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">R0176S</td>
			<td style="width:212px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Antibiotics</td>
			<td style="width:165px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:212px;">Final Concentrations</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Chloramphenicol (Cm)</td>
			<td style="width:165px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">BP904-100</td>
			<td style="width:212px;">20 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Kanamycin (Km)</td>
			<td style="width:165px;">BioBasic Inc.</td>
			<td style="width:131px;">DB0286</td>
			<td style="width:212px;">50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Nalidixic acid (Nal)</td>
			<td style="width:165px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">N8878-25G</td>
			<td style="width:212px;">10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Rifampicin (Rif)</td>
			<td style="width:165px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:131px;">557303</td>
			<td style="width:212px;">20 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tetracycline (Tc)</td>
			<td style="width:165px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">BP912-100</td>
			<td style="width:212px;">10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:255px;">Streptomycin (Sm)</td>
			<td style="width:165px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">BP910-50</td>
			<td style="width:212px;">50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

conjugative mating assays for sequence-specific analysis of transfer proteins involved in bacterial conjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.

एफ प्लाज्मिड संचालित बैक्टीरियल विकार की प्रक्रिया एक समन्वित प्रक्रिया है कि एफ प्लाज्मिड कि एक T4SS pilus संश्लेषण और संयुग्मी डीएनए हस्तांतरण की सुविधा के लिए assembles के टीआरए क्षेत्र के भी?...

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Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.

बैक्टीरियल संयुग्मन में शामिल स्थानांतरण प्रोटीन के अनुक्रम विशिष्ट विश्लेषण के लिए संयुग्मी संभोग Assays

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

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इन विट्रो प्रतिलेखन Assays और दवाओं की खोज में अपने आवेदन

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

The Use of Induced Somatic Sector Analysis ISSA for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

जीन और प्रमोटरों लकड़ी संरचना और माध्यमिक स्टेम विकास में शामिल अध्ययन के लिए प्रेरित दैहिक क्षेत्र के विश्लेषण (आईएसएसए) का प्रयोग करें

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

शारीरिक ऑक्सीजन स्थिति से अवगत कराया मानव कोशिकाओं में कैप बाध्यकारी प्रोटीन का विश्लेषण

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

इष्टतम गुणसूत्र स्थान का निर्धारण (ओं) एक डीएनए तत्व के लिए एक उपंयास Transposon-मध्यस्थता दृष्टिकोण का उपयोग कर ई कोलाई में

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

अनुक्रम-विशिष्ट और चयनात्मक पहचान डबल-असहाय RNAs पर एकल-असहाय RNAs द्वारा रासायनिक संशोधित पेप्टाइड न्यूक्लिक एसिड

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

High-Resolution Comparison of Bacterial Conjugation Frequencies

बैक्टीरियल विकार आवृत्तियों की उच्च संकल्प तुलना

Bacterial conjugation is an important step in the horizontal transfer of antibiotic resistance genes via a conjugative DNA element. In-depth comparisons ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

सहवास आधारित खमीर में एक्सप्रेस पुस्तकालय स्क्रीनिंग

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

सेल SINEUP गैर कोडिंग RNAs है कि विशेष रूप से mRNA अनुवाद में वृद्धि कर सकते है आधारित परख

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

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मकई प्रोटीन की सीटू प्रसव में के लिए एक ट्रोजन हॉर्स के रूप में Ustilago मेडिस का उपयोग

Inspired by Homer&#180;s Trojan horse myth, we engineered the maize pathogen Ustilago maydis to deliver secreted proteins into the maize apoplast ...

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

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बैक्टीरियल विल्ट रोग के सरल आनुवंशिक विश्लेषण के लिए राल्स्टोनिया सोलनेसेरम के साथ टीका के बाद टमाटर रूट परिवर्तन

Ralstonia solanacearum is a devastating soil borne vascular pathogen that can infect a large range of plant species, causing an important threat to ...