Name: online size-exclusion and ion-exchange chromatography on a saxs beamline
Uploaded: 2017-01-05T12:30:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline at JoVE.com

We acknowledge financial support for the project from the French grant REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 and by research grants from the Service de Sant&#233; des Arm&#233;es and the D&#233;l&#233;gation G&#233;n&#233;rale pour l'Armement. We are thankful to the ESRF for the SAXS beam time. We thank Andrew McCarthy, Gordon Leonard, Wim Burmeister, and Guy Schoehn for financial and scientific support.

<ol>
	<li>Graewert, M. A., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+and+progress+in+small+and+wide+angle+X-ray+scattering+(SAXS+and+WAXS).">Impact and progress in small and wide angle X-ray scattering (SAXS and WAXS).</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 23, 748-754 (2013).</li><li>Jacques, D. A., Trewhella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-angle+scattering+for+structural+biology-Expanding+the+frontier+while+avoiding+the+pitfalls.">Small-angle scattering for structural biology-Expanding the frontier while avoiding the pitfalls.</a> Protein Sci. 19, 642-657 (2010).</li><li>Kikhney, A. G., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+small+angle+X-ray+scattering+(SAXS)+of+flexible+and+intrinsically+disordered+proteins.">A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins.</a> FEBS Lett. 589, 2570-2577 (2015).</li><li>Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+solution+scattering+(SAXS)+combined+with+crystallography+and+computation:+defining+accurate+macromolecular+structures,+conformations+and+assemblies+in+solution.">X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution.</a> Q. Rev. Biophys. 40, 191-285 (2007).</li><li>Vestergaard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+biostructural+changes,+dynamics,+and+interactions+-+Small-angle+X-ray+scattering+to+the+rescue.">Analysis of biostructural changes, dynamics, and interactions - Small-angle X-ray scattering to the rescue.</a> Arch. Biochem. Biophys. , (2016).</li><li>David, G., P&#233;rez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+sampler+robot+and+high-performance+liquid+chromatography:+a+fully+automated+system+for+biological+small-angle+X-ray+scattering+experiments+at+the+Synchrotron+SOLEIL+SWING+beamline.">Combined sampler robot and high-performance liquid chromatography: a fully automated system for biological small-angle X-ray scattering experiments at the Synchrotron SOLEIL SWING beamline.</a> J. Appl. Crystallogr. 42, 892-900 (2009).</li><li>Graewert, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Pipeline+for+Purification,+Biophysical+and+X-Ray+Analysis+of+Biomacromolecular+Solutions.">Automated Pipeline for Purification, Biophysical and X-Ray Analysis of Biomacromolecular Solutions.</a> Sci. Rep. 5, (2015).</li><li>Lambright, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+techniques+enhance+the+quality+and+scope+of+information+obtained+from+SAXS.">Complementary techniques enhance the quality and scope of information obtained from SAXS.</a> ACA Trans. , 1-12 (2013).</li><li>Mathew, E., Mirza, A., Menhart, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-chromatography-coupled+SAXS+for+accurate+sizing+of+aggregating+proteins.">Liquid-chromatography-coupled SAXS for accurate sizing of aggregating proteins.</a> J. Synchrotron Radiat. 11, 314-318 (2004).</li><li>Round, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+GH3.+12+protein+conformation+through+HPLC-integrated+SAXS+measurements+combined+with+X-ray+crystallography.">Determination of the GH3. 12 protein conformation through HPLC-integrated SAXS measurements combined with X-ray crystallography.</a> Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 69, 2072-2080 (2013).</li><li>Watanabe, Y., Inoko, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-exclusion+chromatography+combined+with+small-angle+X-ray+scattering+optics.">Size-exclusion chromatography combined with small-angle X-ray scattering optics.</a> J. Chromatogr. 1216, 7461-7465 (2009).</li><li>Hutin, S., Brennich, M. E., Maillot, B., Round, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+ion-exchange+chromatography+for+small+angle+X-ray+scattering.">Online ion-exchange chromatography for small angle X-ray scattering.</a> Acta Cryst. , (2016).</li><li>Selkirk, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion-exchange+chromatography.">Ion-exchange chromatography.</a> Protein Purification Protocols. , 125-131 (2004).</li><li>Yigzaw, Y., Hinckley, P., Hewig, A., Vedantham, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+exchange+chromatography+of+proteins+and+clearance+of+aggregates.">Ion exchange chromatography of proteins and clearance of aggregates.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 10, 421-426 (2009).</li><li>Pernot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upgraded+ESRF+BM29+beamline+for+SAXS+on+macromolecules+in+solution.">Upgraded ESRF BM29 beamline for SAXS on macromolecules in solution.</a> J. Synchrotron Radiat. 20, 660-664 (2013).</li><li>Iyer, L. M., Koonin, E. V., Leipe, D. D., Aravind, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+evolution+of+the+archaeo-eukaryotic+primase+superfamily+and+related+palm-domain+proteins:+structural+insights+and+new+members.">Origin and evolution of the archaeo-eukaryotic primase superfamily and related palm-domain proteins: structural insights and new members.</a> Nucleic Acids Res. 33, 3875-3896 (2005).</li><li>Singleton, M. R., Dillingham, M. S., Wigley, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+helicases+and+nucleic+acid+translocases.">Structure and mechanism of helicases and nucleic acid translocases.</a> Annu. Rev. Biochem. 76, 23-50 (2007).</li><li>Hutin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+organization+of+vaccinia+virus+helicase-primase+D5.">Domain organization of vaccinia virus helicase-primase D5.</a> J. Virol. , 4604-4613 (2016).</li><li>Round, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioSAXS+Sample+Changer:+a+robotic+sample+changer+for+rapid+and+reliable+high-throughput+X-ray+solution+scattering+experiments.">BioSAXS Sample Changer: a robotic sample changer for rapid and reliable high-throughput X-ray solution scattering experiments.</a> Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 71, 67-75 (2015).</li><li>De Maria Antolinos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISPyB+for+BioSAXS,+the+gateway+to+user+autonomy+in+solution+scattering+experiments.">ISPyB for BioSAXS, the gateway to user autonomy in solution scattering experiments.</a> Acta Crystallographica Section D. 71, 76-85 (2015).</li><li>Brennich, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+data+analysis+at+the+ESRF+bioSAXS+beamline,+BM29.">Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29.</a> J. Appl. Crystallogr. 49, (2016).</li><li>Petoukhov, M. V., Konarev, P. V., Kikhney, A. G., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATSAS+2.1-towards+automated+and+web-supported+small-angle+scattering+data+analysis.">ATSAS 2.1-towards automated and web-supported small-angle scattering data analysis.</a> J. Appl. Crystallogr. 40, 223-228 (2007).</li><li>Franke, D., Jeffries, C. M., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+Map,+a+goodness-of-fit+test+for+one-dimensional+X-ray+scattering+spectra.">Correlation Map, a goodness-of-fit test for one-dimensional X-ray scattering spectra.</a> Nat. Methods. 12, 419-422 (2015).</li><li>Schrodinger, LLC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8. , (2015).</li><li>Jensen, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+SAXS+measurements+facilitated+by+online+HPLC+buffer+exchange.">Time-resolved SAXS measurements facilitated by online HPLC buffer exchange.</a> J. Synchrotron Radiat. 17, 769-773 (2010).</li><li>Hynson, R. M., Duff, A. P., Kirby, N., Mudie, S., Lee, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ultracentrifugation+coupled+to+small-angle+X-ray+scattering+on+macromolecular+complexes.">Differential ultracentrifugation coupled to small-angle X-ray scattering on macromolecular complexes.</a> J. Appl. Crystallogr. 48, 769-775 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

بالنسبة للعديد من الجزيئات، وتنقية الخطوة النهائية باستخدام الكروماتوغرافيا مطلوب قبل جمع البيانات SAXS للحصول على مجموعة البيانات ذات نوعية جيدة. ومع ذلك، لا تزال ليس كل عينات مستقرة؛ أنها قد تكون عرضة للتجميع أو إعادة موازنة إلى خليط من الدول oligomerization. لذلك، لا بد من تنقية الخطوة النهائية على الانترنت على خط الأشعة لتقليل الوقت بين تنقية وجمع البيانات من أجل الحصول على البيانات SAXS أفضل نوعية. اعتمادا على الخواص الفيزيائية الحيوية من البروتين من الفائدة، قد يتم اختياره SEC-SAXS أو IEC-SAXS للحصول على جودة عينة المثلى. هنا، على بناء بروتين مشتق من هيليكاز / بريميز D5، وأوضح كل من التقنيات ومناقشتها. الحصول على البيانات SEC-SAXS أصبحت أكثر وأكثر توحيدا ومتاح في العديد من beamlines BioSAXS. تحليل البيانات، وخصوصا الطرح الخلفية، واضحة ومباشرة وسهلة نسبيا. ومع ذلك، إشارة عازلة مستقرةوفصل كاف من أنواع الجزيئات يبقى أساسيا. لذا، فمن الأهمية بمكان أن تخصيص وقت كاف للتوازن العمود تماما. يمكن أن فشل هذه الطريقة يكون راجعا إلى الملوثات المستمرة مشابهة من حيث الحجم للبروتين من الفائدة، وتركيزات منخفضة، والمخازن حساسة للإشعاع. في الممارسة العملية، في البداية، من المحتمل أن تستخدم الأسلوب المفضل لمعظم عينات الجزيئات SEC-SAXS. ومع ذلك، العديد من البروتوكولات تنقية تتطلب خطوة IEC السابقة بسبب وجود ملوثات أو التجميع. وبالنظر إلى أن كل خطوة التركيز واللوني ويرتبط مع خسائر من عينة (تقدر بنحو 30-50٪) والوقت، مباشر IEC-SAXS هو مفيد. للعينات التي لا يمكن تنقيته من قبل المجلس الأعلى للتعليم، سواء كان ذلك بسبب وجود &quot;الملوثات&quot; ذات الحجم المماثل أو لأنها مجموع بشدة في تركيزات اللازمة، IEC-SAXS ستكون دائما النهج الأفضل ملاءمة. أيضا، دعمت معدلات التدفق العاليمن قبل العديد من الأعمدة IEC يمكن أن تساعد على تقليل زمن العبور بين تنقية والقياس. في المثال المقدمة هنا، كان يستخدم IEC مع شطف خطوة، والذي يسمح للفصل بين القمم وثيقة من D5 323-785 من الملوثات عن طريق اختيار بعناية الخطوات تركيز الملح. من حيث المبدأ، على عدد من الخطوات غير محدود، ولكن من الناحية العملية، مطلوب 1 على الأقل خطوة في الذروة، وليس الكثير يجب أن يتم اختياره. للأسلوب خلفية الطرح هو موضح أعلاه، لا بد من قياس عدد كبير نسبيا من المؤلفات عازلة مختلفة من أجل العثور على مطابقة واحدة. والجانب السلبي المشتركة لكل التقنيات هو عدم وجود معلومات دقيقة تركيز البروتين. ونتيجة لهذا، تقرير شامل دقيق على أساس نثر الأمام غير ممكن. للبروتينات كروية مثل D5 323-785، ويوفر حجم Porod بديل، وإن كان أقل دقة، وتقدير الشامل، ولكن للبروتينات عالية مرنة أو المختلين، فإن هذا النهج لا تكون صالحة. وهناك تباين في خطوة حكيمة التدرج طريقة IEC-SAXS المقدمة هنا هو استخدام الانحدار الخطي بدلا من ذلك. في حين أنه من الممكن للعمل مع العديد من الخطوات المطلوبة لعزل القمم دون استخدام شطف تدريجي، في النهج الخطية الانحدار، هو مطلوب منها لتحسين شروط التدرج بعناية من أجل فصل قمم تماما قبل البدء في SAXS تجربة. خلفية الطرح في هذا النهج يمكن أن يتم إطار من الحكمة ويتسن التحقق من هذه المقارنة من الأطر الفردية، ولكنه يتطلب معالجة البيانات أكثر تقدما، وبرامج مخصصة ليست موجودة بعد. اختيار عمود مناسبة أمر حاسم لكلا التقنيات، كما أنه يحدد الفصل بين الأنواع الجزيئات. أعمدة الحجم استبعاد تختلف في قدرة التحميل، ومدى حجم الجزيئات للانفصال، والقرار، في حين تختلف أعمدة التبادل الأيوني في نوع وكثافةالتهم عن أداء وظائفها. في حين أن بروتوكول المعروضة هنا تقتصر على خط الأشعة ESRF BM29، والتكيف مع أي خط الأشعة SAXS الآخر، من حيث المبدأ، واضحة. المتطلبات الرئيسية هي عالية بما فيه الكفاية تدفق الأشعة السينية وجهاز الكشف عن مناسبة (مثالي واحد الفوتون العد)، للحصول على البيانات معقولة الإشارة إلى الضوضاء في نطاق ثانية أو أقل، ونظام اللوني السائل عبر الإنترنت قادر على خلق التدرجات. ومن شأن التنفيذ المحدد، بالطبع، يعتمد على البيئة خط الأشعة المحلية. النتائج التي تم الحصول عليها في D5 323-785 باستخدام الطريقتين تختلف قليلا. نصف قطر الدوران هو أصغر قليلا لبيانات اللجنة الانتخابية المستقلة من لبيانات المجلس الأعلى للتعليم، وتحول الدنيا المحلية من منحنى نثر لناقلات نثر أكبر قليلا. وهذا يعني أن D5 323-785 قياس مع IEC-SAXS قليلا أكثر إحكاما من D5 323-785 قياس مع SEC-SAXS. هذا قد بالبريد بسبب وجود خلافات في إعداد العينات، في وقت ما بين تنقية والقياس (IEC أسرع)، أو، أقل احتمالا، إلى الملوثات في عينة تنقيته المجلس الأعلى للتعليم. نماذج حبة تم الحصول عليها بشكل مستقل تماما مع كل الأساليب قابلة للمقارنة (الشكل 1H). D5 323-785 يظهر جوفاء، هيكل hexameric المتوقع 18. في الختام، على شبكة الإنترنت التبادل الأيوني والانترنت حجم الاستبعاد اللوني طرق تنقية الكيميائية الحيوية الهامة التي يمكن أن يقترن مباشرة إلى SAXS 6،7،9-12،25،26. الطرح خلفية البيانات IEC-SAXS قليلا أكثر صعوبة وغموضا من لSEC-SAXS، ولكن من الممكن مع ذلك. اعتمادا على الخواص الفيزيائية الحيوية من البروتين من الفائدة، سواء المجلس الأعلى للتعليم وIEC-SAXS تسمح لتعظيم الاستفادة من فصل الأنواع مع المزايا الكامنة. التي تنص على أن خطوات التحقق من صحة (كما هو موضح) لوحظ بشكل صحيح، يمكن تحليل البيانات الناتجة خفة دمالثقة ساعة، ونماذج يمكن تحديد باستخدام الأدوات القياسية المتاحة داخل المجتمع. معا، وكلاهما تقنيات تسمح الانفصال عبر الإنترنت لمجموعة واسعة من الجزيئات البيولوجية، مما أسفر عن البيانات لا يمكن الوصول إليها عن طريق قياسات ثابتة القياسية.

BioSAXS هو أداة قوية لتحديد شكل الأشياء نانو الحجم 1-4. تشتت الأشعة السينية بواسطة محلول يحتوي على الجزيئات، الحجم في نطاق نانومتر، يتم تسجيلها في زوايا منخفضة جدا. هذا النطاق الزاوي يحتوي على معلومات حول معلمات العالمية: نصف قطر الدوران. وعلى مسافة أكبر intraparticle. شكل الجسيمات. ودرجة للطي، وتمسخ، أو اضطراب. هذه التقنية لا تتطلب البلورات، وجزيء يبقى في الحل، وبالتالي يمكن أن تبقى في ظروف محاكاة بعض المعالم الهامة للخلية، مثل القوة الأيونية، ودرجة الحموضة، وما إلى ذلك معرفة هذه العوامل قد تساعد على تحديد، على سبيل المثال، الدولة بلازميدة قليلة القسيمات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية لبروتين من الفائدة أو للتحقق من صحة نموذج مقترح للمجمع. توصيف تفاعلات البروتين البروتين في ظروف عازلة مختلفة، وخلق نماذج من المجالات المفقودة، وصقل النماذج التماثل، وديإنهاء الدول مطوية وتكشفت منفصلة لا يمكن أن يؤديها بسرعة وبسهولة 5. كما هو الحال مع أي تقنية، BioSAXS لديها نقاط ضعف جوهرية: عينات مجمعة أو التشويه والتحريف، خليط من جزيئات، وعينات غير متجانسة، أضرار الإشعاع، وعدم التطابق المخزن المؤقت قد يؤدي إلى بيانات الامم المتحدة للتفسير. بالنسبة لكثير من أساليب التحليل، يفترض ضمنا أن العينة هي monodisperse، شرط أن غالبا ما يكون من الصعب الحصول عليها في الممارسة العملية. في كثير من الحالات، وتدهور العينة خفية ولا يمكن الكشف في البيانات من تلقاء نفسها، وأية محاولة لتفسير البيانات يعطي نتائج غير دقيقة أو حتى مضللة. للتغلب على هذه العقبات، تم تنفيذ مجموعة من اللوني الحجم الاستبعاد (SEC) وSAXS على العديد من beamlines لضمان جودة البيانات ولجعل هذه التقنية أكثر سهولة لعينات من الصعب على نحو متزايد 6-11. وأضاف نحن في الآونة الأخيرة طريقة جديدة للذخيرة عن طريق وضع على الانترنت التبادل الأيونياللوني (IEC) -coupled SAXS 12. وفي كلتا الطريقتين قد تفتح SAXS إلى مجموعة واسعة من الجزيئات البيولوجية مستحيلة سابقا لتحليلها. اختيار الأسلوب الذي لاستخدام يعتمد على الخواص الفيزيائية الحيوية من الجزيئات من الفائدة. المجلس الأعلى للتعليم يفصل الجزيئات التي حجمها، حيث هناك حاجة إلى ما لا يقل عن فارق 10٪ في الكتلة الجزيئية واضحة للفصل. القيود المادية من العمود والخصائص الفسيولوجية للعينات، مثل أسطح مسعور، والمرونة، وعدم الاستقرار، كما يعقد جمع البيانات وتحليلها، وتفسيرها. التبادل الأيوني اللوني، الذي يفصل بين الجزيئات على أساس عهدتهم، وبالتالي تقارب ملزمة لالعمود IEC، ويمكن استخدامها بدلا من أو بالإضافة إلى المجلس الأعلى للتعليم. مجموع شحنة يمكن التلاعب بها بسهولة عن طريق تغيير درجة الحموضة، أو متفاوتة تركيز الملح من المنطقة العازلة، وتوفير وسيلة بسيطة نسبيا لايل تسيطر عليهاution من الجزيئات من العمود IEC. باستخدام هذا الاتهام، والفصل بين أنواع وأحجام مختلفة من جزيئات مماثلة، الذي من شأنه أن يكون الأمر خلاف ذلك من الصعب فصل، لا يمكن أن يؤديها بشكل روتيني مع IEC. بالإضافة إلى ذلك، IEC لديها ميزة كونها قادرة على التعامل مع عينات المخفف، يسمح احد لتجنب الخطوات تركيز، والتي تحمل المخاطر المحتملة لتغيير طبيعة البروتين. للأسف، وتوزيع التهمة هي غاية العينة التي تعتمد، IEC يتطلب الأمثل فيما يتعلق درجة الحموضة وتركيز الملح 13،14. بالنسبة لكثير من البروتينات التي يصعب التعبير، تنقية، أو كليهما، تتوفر لدراسة كميات منخفضة فقط من العينة. ومن المهم أن تكون فعالة والتقليل من عدد من الخطوات لتنقية، وبالتالي، فإن الخسائر. لهذا السبب، فإن الخطوة تنقية الأخيرة على الانترنت مباشرة قبل الحصول على البيانات SAXS، من أجل زيادة احتمال جمع مجموعة بيانات جيدة. هنا، نقدم ومقارنة عبر الإنترنت SEC-SAXS وIEC-SAXS. نفذت كل من التقنيات على خط الأشعة BioSAXS BM29 في مرفق الأوروبي السنكروترون الإشعاع (ESRF) في غرونوبل، فرنسا 15. كحالة اختبار، كنا المجال D5N وهيليكاز من البروتين فيروس جدري D5، التي كانت صعبة نوعا ما لتحليل الهيكلية باستخدام طرق أخرى. فيروس جدري هو عضو في عائلة فيروسات جدرية وهو 98٪ مطابقة للفيروس الجدري، وسبب الجدري. باستخدام نظام اللقاحية ندرس آلية التكرار، مع التركيز هنا على أساسي D5 هيليكاز-بريميز. D5 هو بروتين 95 كيلو دالتون مع-archeo حقيقية النواة بريميز (AEP) نطاق-N محطة 16 تليها منطقة العنقودية السيستين (احتياط 240-345) 16. وعلاوة على ذلك نحو محطة سي تأتي مجال D5N (احتياط 340-460)، الذي يرتبط دائما مع D5 من نوع helicases، وأخيرا الفصيلة 3 (SF3) نطاق هيليكاز (احتياط 460-785) 17 (شملت رقمالبريد 1A). المجال هيليكاز من D5 يبني هيكل حلقة hexameric أن هناك حاجة للربط محكم على الحمض النووي. وذلك بفضل دراسات SAXS وEM الأخيرة، والهياكل منخفضة الدقة من بريميز والمجالات هيليكاز معروفة الآن 18. هنا، وتبين لنا كيفية استخدام تقنيات اللوني تنفذ على الانترنت على خط الأشعة BioSAXS BM29 في ESRF لاكتساب نظرة ثاقبة لبنية جزء C-محطة (بقايا 323-785) من D5.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4 dithiothreitol [DTT]</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gel</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>4561033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Phusion Flash PCR Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>F 548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetic acid glacial</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>20104.298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose D-5</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>LF45130653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra -15 Centrifugal filters Ultracel -30K</td>
			<td>Millipore Ltd</td>
			<td>UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0400-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Novagene</td>
			<td>70750-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue&#160;</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>8122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete protease inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11231400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Pac 10 DG Desalting column</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>732-2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>24388.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-6405-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HindIII</td>
			<td>Roche</td>
			<td>656313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisSelect HF Nickel Affinity Gel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>20252.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>AppliChem Panreac</td>
			<td>A1073,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth Miller</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>L3152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc.</td>
			<td>191421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>27808.297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>ER0571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>C6010-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pProEx HTb vector&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>10711018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer</td>
			<td>&#160;Eurofins mwg operon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel extraction kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification kid</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>75746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 6 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5172-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA gel stain</td>
			<td>Invitrogen life technology</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 ligase</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>home made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOP 10</td>
			<td>Invitrogen life technology</td>
			<td>C404003&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uno Q 1R column&#160;</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>720 0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>MPBiomedicals, LLC</td>
			<td>194834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beamline control software BsXCuBE</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camserver software</td>
			<td>Dectris</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>detector control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAMAVER</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>program to align ab initio models&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAMMIF</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>ab initio&#160; model reconstruction programm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC program Biologic Duo Flow</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC program LabSolutions</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPyB</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85.</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMUS</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>program, which performs the manipulation with experimental SAXS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyMOL</td>
			<td>DeLano Scientific LLC</td>
			<td>https://www.pymol.org/</td>
			<td>software for visualization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPCOMB</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>program to superimpose 3D structures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLogic Duo Flow</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLogic Biofrac Fraction collector</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC system</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labsonic P</td>
			<td>Sartorius Stedim biotech</td>
			<td>BBI8535108</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

online size-exclusion and ion-exchange chromatography on a saxs beamline

زاوية صغيرة البيولوجي الأشعة السينية نثر (BioSAXS) هي تقنية قوية في مجال البيولوجيا الجزيئية والهيكلية المستخدمة لتحديد الهيكل حل، وحجم الجسيمات والشكل، ونسبة الجزيئات السطح إلى الحجم. هذه التقنية هي التي تنطبق على مجموعة واسعة جدا من الظروف حل تغطي مجموعة واسعة من تركيزات والقيم ودرجة الحموضة، ونقاط القوة الأيونية، ودرجات الحرارة والمواد المضافة وغيرها، ولكن مطلوب العينة أن تكون monodisperse. أدى هذا التحذير إلى تنفيذ أنظمة اللوني السائل على beamlines SAXS. هنا، نحن تصف التكامل المنبع من حجم الاستبعاد (SEC) والتبادل الأيوني اللوني (IEC) على خط الأشعة، وأساليب مختلفة لخلفية الطرح الأمثل، والحد من البيانات. وكمثال على ذلك، ونحن تصف كيف نستخدم SEC- وIEC-SAXS على جزء من الضروري بروتين فيروس جدري D5، ويتألف من مجال D5N هيليكاز. علينا أن نحدد شكله العام والوزن الجزيئي، والتي تبين هيكل hexameric من الالبروتين ه.

يتم سرد نتائج التحليل ثابتة خالية من نموذج في الجدول 1. وأظهر تحليل البيانات 323-785 SEC-SAXS D5 تقدير الكتلة الجزيئية (من تحليل Porod) من 345 كيلو دالتون مقابل 338 كيلو دالتون، لاحظ استخدام IEC-SAXS. كلاهما في اتفاق مع كتلة المتوقع من 6 مرات 53.5 كيلو دالتون (321 كيلو دالتون) لمسدوس. وأجرى النمذجة أساسه كل من مجموعات البيانات مع أي تماثل المفروضة (SEC-SAXS: χ 2 = 0.88، IEC-SAXS: χ 2 = 3.1) واستخدام C6 التماثل (SEC-SAXS: χ 2 = 1.0، IEC-SAXS : χ 2 = 4). كما تناسبها الشاملة للبيانات نثر لكل من إعادة البناء قابلة للمقارنة في كلتا الحالتين (1D الشكل وE)، C6 التماثل يمكن الافتراض. وهكذا، فإن نموذج يتوافق مع بنية تشبه مخروط سداسية مع قناة المركزية، والذي يظهر عرقلت جزئيا (SEC: الشكل 1F، IEC: <strأونج&gt; الشكل 1G، تراكب الشكل 1H). دراسة نماذج فردية قبل المتوسط ​​يدل على أن هذه العراقيل من المرجح أن تكون قطعة أثرية من عملية المتوسط. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54861/54861fig1x.jpg" /> الشكل 1: تحليل البيانات SAXS ومقارنة D5 323 -785 (شخصية مقتبسة من المراجع 12 و 18). أ) بنية المجال التخطيطي للبروتين D5 و D5 323-785. ب) غير متصل التبادل الأيوني اللوني مع الإشارة إلى القمم الثلاث. البرتقالي منحنى: الامتصاصية في 280 نانومتر (الاتحاد الافريقي)، المنحنى الأزرق: النسبة المئوية من العازلة ب. النسب المئوية من B العازلة في القمم وأشار. C) على الانترنت التبادل الأيوني اللوني. مفتاح اللون كما في B. بالإضافة إلى ذلك، يشار إلى قياس كثافة باللون الأخضر. تناثر تجريبي منحنىالثانية احتساب منحنى من طراز حصلت عليها D SEC-SAXS) وIEC E) تحليل البيانات من D5 323-785. نموذج F) حبة من D5 323-785 استنادا إلى بيانات المجلس الأعلى للتعليم والبيانات G) IEC. H) تراكب من النماذج المجلس الأعلى للتعليم واللجنة الانتخابية المستقلة. تم إنشاء لوحات في F) إلى H) باستخدام برنامج التصور الجزيئي 24. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54861/54861fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> معلمات جمع البيانات </td><td></td></tr><tr><td> صك: </td><td> ESRF BM29 </td></tr><tr><td> الطول الموجي (أ) </td><td> 0.99 </td></tr><tr><td> ف المدى (أ -1) </td><td> ،0032-0،49 </td></tr><tr><td> عينة إلى كشف المسافة </td><td> 2،864 م </td></tr><tr><td> وقت التعرض (ثانية) </td><td> 1 في إطار </td></tr><tr><td> مجموعة تركيز </td><td> غ </td></tr><tr><td> درجة الحرارة (K) </td><td> 293 </td></tr><tr><td> الكاشف </td><td> بيلاتوس 1M (Dectris) </td></tr><tr><td> الجريان (الفوتونات / ثانية) </td><td> 1 × 10 12 </td></tr><tr><td> شعاع حجم (ميكرون 2) </td><td> 700 × 700 </td></tr><tr><td> المعلمات الهيكلية للD5 323-785، المجلس الأعلى للتعليم </td><td></td></tr><tr><td> أنا 0 (سم -1) [من Guinier] </td><td> 0.0237 </td></tr><tr><td> النمو الحقيقي (أ) [من Guinier] </td><td> 48 </td></tr><tr><td> ف دقيقة R ز - س كحد أقصى R ز تستخدم لGuinier </td><td> 0،77-1،24 </td></tr><tr><td> D ماكس (أ) [من ص (ص)] </td><td> 145 </td></tr><tr><td> ف المدى تستخدم لص (ص) (أ -1)</td><td> 0،02-0،17 </td></tr><tr><td> Porod المجلد الخامس ص (3) [من مبعثر] </td><td> (570 ± 5) × 10 3 </td></tr><tr><td> الجزيئية كتلة M ص (كيلو دالتون) [من الخامس ص] </td><td> 345 </td></tr><tr><td> تحسب أحادى السيد من تسلسل (كيلو دالتون) </td><td> 321 </td></tr><tr><td> المعلمات الهيكلية للD5 323-785، IEC </td><td></td></tr><tr><td> أنا 0 (سم -1) [من Guinier] </td><td> 0.386 </td></tr><tr><td> النمو الحقيقي (أ) [من Guinier] </td><td> 46.5 ± 0.1 </td></tr><tr><td> ف دقيقة R ز - س كحد أقصى R ز تستخدم لGuinier </td><td> 0،44-1،29 </td></tr><tr><td> D ماكس (أ) [من ص (ص)] </td><td> 120 </td></tr><tr><td> ف المدى تستخدم لص (ص) (أ -1) </td><td> 0،03-0،18 </td></tr><tr><td> Porod المجلد الخامس ص (&amp; #197؛ 3) [من مبعثر] </td><td> (577 ± 5) × 10 3 </td></tr><tr><td> الجزيئية كتلة M ص (كيلو دالتون) [من الخامس ص] </td><td> 339 </td></tr><tr><td> تحسب hexameric السيد من تسلسل (كيلو دالتون) </td><td> 321 </td></tr></tbody></table> الجدول 1: معلمات البيانات SAXS. ويلخص الجدول المعلمات من الحصول على البيانات SAXS والتحليل.

Watch this Scientific Journal Video about Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline at JoVE.com

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

تحديد هيكل الحل من البروتين زاوية صغيرة للأشعة السينية نثر (SAXS) يتطلب عينات monodisperse. هنا، نقدم احتمالين لضمان الحد الأدنى من التأخير بين إعداد العينات والحصول على البيانات: الإنترنت الحجم الاستبعاد اللوني (SEC) على الانترنت والتبادل الأيوني اللوني (IEC).

على الانترنت الحجم الاستبعاد والتبادل الأيوني اللوني على SAXS خط الأشعة

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

طريقة بسيطة لفحص المواد الكيميائية عالية الإنتاجية في ايليجانس كاينورهابديتيس

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

هضم البروتين، أولترافيلتراتيون، وحجم الاستبعاد اللوني لتحسين عزل اكسوسوميس من بلازما الدم البشري والمصل

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

التبادل الأيوني اللوني (المستوى) بالإضافة إلى تشتت الضوء زاوية المتعددة (مالس) لفصل البروتين وتوصيف

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

توصيف البروتينات حسب الحجم والاستبعاد الكروماتوغرافيا المقترنة بتشتت الضوء متعدد الزوايا (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

ثقافة الخلية علي اغشيه نيرايد السيليكون والتعويض عن البرد لل Synchrotron الاشعه السينية الفلورية نانو-تحليل

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

تحليل الموجات الاختزالية السائلة غير المستهدفة - قياس الطيف الشامل - Metabolomics من حبوب القمح

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

تحليل بيانات لجنة الأوراق المالية والبورصة -SAXS عن طريق إزالة الفولفورة والإيفاد في EFA

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

التحليل شبه الكمي للببتيدوغليكان بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة قياس الطيف الكتلي والمعلوماتية الحيوية

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

خط أنابيب إعداد عينة للبلورات الدقيقة في خط شعاع VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...