Name: online size-exclusion and ion-exchange chromatography on a saxs beamline
Uploaded: 2017-01-05T12:30:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline at JoVE.com

We acknowledge financial support for the project from the French grant REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 and by research grants from the Service de Sant&#233; des Arm&#233;es and the D&#233;l&#233;gation G&#233;n&#233;rale pour l'Armement. We are thankful to the ESRF for the SAXS beam time. We thank Andrew McCarthy, Gordon Leonard, Wim Burmeister, and Guy Schoehn for financial and scientific support.

<ol>
	<li>Graewert, M. A., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+and+progress+in+small+and+wide+angle+X-ray+scattering+(SAXS+and+WAXS).">Impact and progress in small and wide angle X-ray scattering (SAXS and WAXS).</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 23, 748-754 (2013).</li><li>Jacques, D. A., Trewhella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-angle+scattering+for+structural+biology-Expanding+the+frontier+while+avoiding+the+pitfalls.">Small-angle scattering for structural biology-Expanding the frontier while avoiding the pitfalls.</a> Protein Sci. 19, 642-657 (2010).</li><li>Kikhney, A. G., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+small+angle+X-ray+scattering+(SAXS)+of+flexible+and+intrinsically+disordered+proteins.">A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins.</a> FEBS Lett. 589, 2570-2577 (2015).</li><li>Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+solution+scattering+(SAXS)+combined+with+crystallography+and+computation:+defining+accurate+macromolecular+structures,+conformations+and+assemblies+in+solution.">X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution.</a> Q. Rev. Biophys. 40, 191-285 (2007).</li><li>Vestergaard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+biostructural+changes,+dynamics,+and+interactions+-+Small-angle+X-ray+scattering+to+the+rescue.">Analysis of biostructural changes, dynamics, and interactions - Small-angle X-ray scattering to the rescue.</a> Arch. Biochem. Biophys. , (2016).</li><li>David, G., P&#233;rez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+sampler+robot+and+high-performance+liquid+chromatography:+a+fully+automated+system+for+biological+small-angle+X-ray+scattering+experiments+at+the+Synchrotron+SOLEIL+SWING+beamline.">Combined sampler robot and high-performance liquid chromatography: a fully automated system for biological small-angle X-ray scattering experiments at the Synchrotron SOLEIL SWING beamline.</a> J. Appl. Crystallogr. 42, 892-900 (2009).</li><li>Graewert, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Pipeline+for+Purification,+Biophysical+and+X-Ray+Analysis+of+Biomacromolecular+Solutions.">Automated Pipeline for Purification, Biophysical and X-Ray Analysis of Biomacromolecular Solutions.</a> Sci. Rep. 5, (2015).</li><li>Lambright, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+techniques+enhance+the+quality+and+scope+of+information+obtained+from+SAXS.">Complementary techniques enhance the quality and scope of information obtained from SAXS.</a> ACA Trans. , 1-12 (2013).</li><li>Mathew, E., Mirza, A., Menhart, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-chromatography-coupled+SAXS+for+accurate+sizing+of+aggregating+proteins.">Liquid-chromatography-coupled SAXS for accurate sizing of aggregating proteins.</a> J. Synchrotron Radiat. 11, 314-318 (2004).</li><li>Round, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+GH3.+12+protein+conformation+through+HPLC-integrated+SAXS+measurements+combined+with+X-ray+crystallography.">Determination of the GH3. 12 protein conformation through HPLC-integrated SAXS measurements combined with X-ray crystallography.</a> Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 69, 2072-2080 (2013).</li><li>Watanabe, Y., Inoko, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-exclusion+chromatography+combined+with+small-angle+X-ray+scattering+optics.">Size-exclusion chromatography combined with small-angle X-ray scattering optics.</a> J. Chromatogr. 1216, 7461-7465 (2009).</li><li>Hutin, S., Brennich, M. E., Maillot, B., Round, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+ion-exchange+chromatography+for+small+angle+X-ray+scattering.">Online ion-exchange chromatography for small angle X-ray scattering.</a> Acta Cryst. , (2016).</li><li>Selkirk, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion-exchange+chromatography.">Ion-exchange chromatography.</a> Protein Purification Protocols. , 125-131 (2004).</li><li>Yigzaw, Y., Hinckley, P., Hewig, A., Vedantham, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+exchange+chromatography+of+proteins+and+clearance+of+aggregates.">Ion exchange chromatography of proteins and clearance of aggregates.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 10, 421-426 (2009).</li><li>Pernot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upgraded+ESRF+BM29+beamline+for+SAXS+on+macromolecules+in+solution.">Upgraded ESRF BM29 beamline for SAXS on macromolecules in solution.</a> J. Synchrotron Radiat. 20, 660-664 (2013).</li><li>Iyer, L. M., Koonin, E. V., Leipe, D. D., Aravind, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+evolution+of+the+archaeo-eukaryotic+primase+superfamily+and+related+palm-domain+proteins:+structural+insights+and+new+members.">Origin and evolution of the archaeo-eukaryotic primase superfamily and related palm-domain proteins: structural insights and new members.</a> Nucleic Acids Res. 33, 3875-3896 (2005).</li><li>Singleton, M. R., Dillingham, M. S., Wigley, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+helicases+and+nucleic+acid+translocases.">Structure and mechanism of helicases and nucleic acid translocases.</a> Annu. Rev. Biochem. 76, 23-50 (2007).</li><li>Hutin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+organization+of+vaccinia+virus+helicase-primase+D5.">Domain organization of vaccinia virus helicase-primase D5.</a> J. Virol. , 4604-4613 (2016).</li><li>Round, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioSAXS+Sample+Changer:+a+robotic+sample+changer+for+rapid+and+reliable+high-throughput+X-ray+solution+scattering+experiments.">BioSAXS Sample Changer: a robotic sample changer for rapid and reliable high-throughput X-ray solution scattering experiments.</a> Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 71, 67-75 (2015).</li><li>De Maria Antolinos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISPyB+for+BioSAXS,+the+gateway+to+user+autonomy+in+solution+scattering+experiments.">ISPyB for BioSAXS, the gateway to user autonomy in solution scattering experiments.</a> Acta Crystallographica Section D. 71, 76-85 (2015).</li><li>Brennich, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+data+analysis+at+the+ESRF+bioSAXS+beamline,+BM29.">Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29.</a> J. Appl. Crystallogr. 49, (2016).</li><li>Petoukhov, M. V., Konarev, P. V., Kikhney, A. G., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATSAS+2.1-towards+automated+and+web-supported+small-angle+scattering+data+analysis.">ATSAS 2.1-towards automated and web-supported small-angle scattering data analysis.</a> J. Appl. Crystallogr. 40, 223-228 (2007).</li><li>Franke, D., Jeffries, C. M., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+Map,+a+goodness-of-fit+test+for+one-dimensional+X-ray+scattering+spectra.">Correlation Map, a goodness-of-fit test for one-dimensional X-ray scattering spectra.</a> Nat. Methods. 12, 419-422 (2015).</li><li>Schrodinger, LLC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8. , (2015).</li><li>Jensen, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+SAXS+measurements+facilitated+by+online+HPLC+buffer+exchange.">Time-resolved SAXS measurements facilitated by online HPLC buffer exchange.</a> J. Synchrotron Radiat. 17, 769-773 (2010).</li><li>Hynson, R. M., Duff, A. P., Kirby, N., Mudie, S., Lee, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ultracentrifugation+coupled+to+small-angle+X-ray+scattering+on+macromolecular+complexes.">Differential ultracentrifugation coupled to small-angle X-ray scattering on macromolecular complexes.</a> J. Appl. Crystallogr. 48, 769-775 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

For mange makromolekyler, er et sidste rensning skridt ved hjælp chromatografi påkrævet før SAXS dataindsamling for at opnå en god kvalitet datasæt. Men ikke alle prøver forbliver stabile; de kan være tilbøjelige til aggregering eller re-ækvilibrering til en blanding af oligomeriserende stater. Derfor er en endelig online rensning skridt på beamline kræves for at minimere tiden mellem rensning og dataindsamling for at opnå den SAXS data bedst kvalitet. Afhængigt af de biofysiske egenskaber af proteinet af interesse, kan SEC-SAXS eller IEC-SAXS blive valgt til at opnå optimal prøve kvalitet. Her, på et protein-konstruktion afledt af helicase / primase D5, er begge teknikker forklaret og diskuteret. Erhvervelse af SEC-SAXS data bliver mere og mere standardiseret og er tilgængelig på mange BioSAXS beamlines. Dataanalyse, især baggrund subtraktion, er forholdsvis ligetil og nemt. Men en stabil puffer signalog en tilstrækkelig adskillelse af de makromolekylære arter fortsat vigtigt. Derfor er det afgørende at reservere tilstrækkelig tid til at ækvilibrere søjlen grundigt. Svigt af denne metode kan skyldes persistente forureninger af lignende størrelse til proteinet af interesse, lave koncentrationer, og strålingsfølsomme buffere. I praksis indledningsvist, SEC-SAXS er forventes anvendt som den foretrukne metode til de fleste makromolekylære prøver. Stadig, mange oprensningsprotokoller kræve en forudgående IEC trin på grund af tilstedeværelsen af ​​forurenende stoffer eller aggregering. I betragtning af, at hver koncentration og kromatografi trin er forbundet med tab af prøve (anslået til 30-50%) og tid, direkte IEC-SAXS er fordelagtig. For prøver, der ikke kan renses ved SEC, det være sig på grund af tilstedeværelsen af ​​samme størrelse &quot;forureninger&quot;, eller fordi de er alvorlig aggregat ved de nødvendige koncentrationer, ville IEC-SAXS altid være lige velegnet fremgangsmåde. Også, støttet de højere flowhastighederaf mange IEC kolonner kan bidrage til at reducere transittiden mellem rensning og måling. I eksemplet præsenteret her, blev IEC bruges med en trinvis eluering, hvilket giver mulighed for adskillelse af de tætte toppe af D5 323-785 fra kontaminanter ved omhyggeligt at vælge saltkoncentrationen trin. I princippet er antallet af trin er ubegrænset, men praktisk er mindst 1 trin pr peak påkrævet, og ikke for mange bør vælges. For baggrundssubtraktion beskrevet ovenfor, er det vigtigt at kunne måle et relativt stort antal af forskellige buffer-sammensætninger for at finde den matchende en. En delt ulempe ved begge teknikker er manglen på præcise oplysninger proteinkoncentration. På grund af dette, præcis masse bestemmelse baseret på forward spredning er ikke mulig. For kugleformede proteiner såsom D5 323-785, den Porod volumen giver et alternativ, om end mindre præcise, masse skøn, men for meget fleksible eller uordnede proteinerVille denne fremgangsmåde ikke være gyldig. En variation af den trinvise gradient IEC-SAXS metode præsenteres her er anvendelsen af ​​en lineær gradient i stedet. Selv om det er muligt at arbejde med så mange trin, som ønskes at isolere sub-toppe under anvendelse af en trinvis eluering i lineær gradient tilgang, er det nødvendigt at optimere gradientbetingelserne omhyggeligt for at adskille toppene helt før start af SAXS eksperiment. Baggrund subtraktion i denne tilgang kunne gøres frame-klog og kunne verificeres ved en sammenligning af de enkelte frames, men det kræver mere avanceret data håndtering, og en dedikeret software findes ikke endnu. Valget af en egnet kolonne er kritisk for begge teknikker, eftersom den måler adskillelsen af ​​de makromolekylære arter. Størrelsesudelukkelses-kolonner forskellige i lasteevnen, størrelsesområdet adskillelige makromolekyler, og opløsning, mens ionbyttersøjler variere i form og densitetenaf deres immobiliserede afgifter. Mens den protokol, der præsenteres her er specifik for ESRF beamline BM29, tilpasning til enhver anden SAXS beamline er i princippet ligetil. De vigtigste krav er en tilstrækkelig høj X-ray flux og en egnet detektor (ideelt enkelt-foton-tælling), at erhverve rimelige signal-til-støj-data i området fra sekunder eller mindre, og et online væskekromatografi system, der kan skabe gradienter. Den nøjagtige implementering vil naturligvis afhænge af den lokale beamline miljø. De opnåede på D5 323-785 ved hjælp af de to metoder resultater afvige lidt. Den inertiradius er lidt mindre for IEC data end for SEC-data, og den lokale minima af spredningen kurven forskydes til lidt større sprednings- vektorer. Dette betyder, at D5 323-785 målt med IEC-SAXS er lidt mere kompakt end D5 323-785 målt med SEC-SAXS. Dette kan be på grund af forskelle i prøveforberedelse, i tiden mellem rensning og måling (IEC er hurtigere), eller, mindre sandsynligt, at et forurenende stof i SEC-renset prøve. Perlen modeller opnået helt uafhængigt med begge metoder er sammenlignelige (Figur 1 H). D5 323-785 viser den forventede hule, hexamere struktur 18. Afslutningsvis online ionbytning og online gelpermeationskromatografi er vigtige biokemiske oprensningsmetoder, som kan kobles direkte til SAXS 6,7,9-12,25,26. Baggrunden fratrækning af IEC-SAXS data er lidt sværere og tvetydig end for SEC-SAXS, men det er ikke desto mindre muligt. Afhængigt af de biofysiske egenskaber af proteinet af interesse, både SEC og IEC-SAXS muliggøre optimering af separation arter med iboende fordele. Forudsat, at validering trin (som beskrevet) er korrekt observeret, kan de resulterende data analyseres with tillid, og modeller kan bestemmes ved hjælp af standard værktøjer til rådighed i samfundet. Sammen begge teknikker tillader online adskillelse for en bred vifte af biologiske makromolekyler, hvilket giver data ikke tilgængelige via standard statiske målinger.

BioSAXS er et kraftfuldt værktøj til at bestemme formen af nanostørrelse objekter 1-4. Spredningen af ​​røntgenstråler ved en opløsning indeholdende makromolekyler, dimensioneres på nm, registreres ved meget lave vinkler. Denne kantede sortiment indeholder oplysninger om globale parametre: inertiradius; den største intrapartikulære distance; partiklen form; og graden af ​​foldning, denaturering, eller lidelse. Teknikken kræver ikke krystaller, og makromolekylet forbliver i opløsning og kan således holdes under forhold efterligner visse vigtige parametre for cellen, såsom ionstyrke, pH osv Kendskabet til disse faktorer kan bidrage til at fastslå, for eksempel det fysiologisk relevante oligomere tilstand af et protein af interesse eller til at validere en foreslået model af et kompleks. Karakteriseringen af ​​protein-protein interaktioner i forskellige bufferbetingelser, skabelse af modeller for manglende domæner, forfinelse af homologi modeller, og dekan udføres terminering af diskrete foldede og ufoldede tilstande hurtigt og nemt 5. Som med enhver teknik, BioSAXS har iboende svagheder: aggregerede eller denaturerede prøver, blandinger af partikler, heterogene prøver, stråleskader, og buffer misforhold kan resultere i un-fortolkelige data. For mange analysemetoder, er det implicit antaget, at prøven er monodisperse, et krav, er ofte vanskeligt at opnå i praksis. I mange tilfælde, nedbrydningen af ​​prøven er subtile og kan ikke påvises i data på egen hånd, og ethvert forsøg på at fortolke data giver urigtige eller endda misvisende resultater. For at overvinde disse forhindringer, var kombinationen af størrelse-(SEC) og SAXS implementeret på mange beamlines at sikre datakvaliteten og gøre denne teknik mere tilgængelige for stadig sværere prøver 6-11. For nylig har vi tilføjet en ny metode til at repertoiret ved at udvikle online ionbytningkromatografi (IEC) -coupled SAXS 12. Begge teknikker åbner SAXS til en bred vifte af biologiske partikler tidligere umuligt at analysere. Valget af metode afhænger af de biofysiske egenskaber af partiklerne af interesse. SEC adskiller makromolekyler ved deres størrelse, hvorved der behov for mindst en forskel i tilsyneladende molekylvægt på 10% til adskillelse. Fysiske begrænsninger i søjlen og fysiologiske egenskaber af prøverne, ligesom hydrofobe overflader, fleksibilitet og manglende stabilitet, også komplicere dataindsamling, analyse og fortolkning. Ionbytningskromatografi, som adskiller molekyler baseret på deres ladning og dermed deres bindingsaffinitet til IEC kolonne, kan anvendes i stedet for eller som supplement til SEC. Den totale ladning kan let manipuleres ved ændring af pH eller variere koncentrationen af ​​bufferen salt, hvilket giver en forholdsvis simpel metode til styret elution af molekylerne fra IEC kolonne. Ved at bruge afgiften, adskillelse af lignende typer og størrelser af molekyler, som ellers ville være svært at adskille, kan udføres rutinemæssigt med IEC. Derudover IEC har den fordel at være i stand til at behandle fortyndede prøver, tillader en at undgå koncentrering, som bærer den potentielle risiko for denaturering af proteinet. Desværre, som ladningsfordelingen er yderst prøve-afhængig, IEC kræver optimering med hensyn til pH og saltkoncentrationer 13,14. For mange proteiner, som er vanskeligt at udtrykke, oprense eller begge kun lave mængder af prøven er tilgængelige til at studere. Det er vigtigt at være effektiv og for at minimere antallet af rensningstrin og dermed tab. Af denne grund det sidste oprensningstrin er online direkte inden SAXS dataopsamling, for at øge sandsynligheden for opsamling af en god data sættet. HerPræsenterer vi og sammenligne online SEC-SAXS og IEC-SAXS. Begge teknikker blev gennemført på BioSAXS beamline BM29 på ESRF (ESRF) i Grenoble, Frankrig 15. Som en prøvesag, brugte vi D5N og helicasedomænet af vacciniavirus protein D5, som var temmelig vanskeligt at analysere strukturelt ved hjælp af andre metoder. Vaccinia virus er et medlem af Poxviridae familien og er 98% identisk med variolavirus, årsagen til kopper. Ved hjælp af vaccinia systemet, studerer vi replikation maskiner, der fokuserer her på de væsentlige helicase-primase D5. D5 er et 95-kDa protein med en N-terminal Archeo-eukaryot primase (AEP) domæne 16 efterfulgt af en cystein klynge region (res. 240-345) 16. Tættere på C-terminus kommer en D5N domæne (res. 340-460), som altid er forbundet med D5-type helicaser, og endelig en superfamilie 3 (SF3) helicasedomænet (res. 460-785) 17 (Figure 1A). Helicasedomænet af D5 bygger en hexamer ringstruktur, der er nødvendig for tæt binding til DNA. Takket være de seneste SAXS og EM studier er de lav opløsning strukturer i primase og helicase domæner nu kendt 18. Her viser vi, hvordan man bruger de gennemførte online kromatografiteknikker på BioSAXS beamline BM29 på ESRF at få indblik i strukturen af ​​den C-terminale fragment (rest 323-785) i D5.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4 dithiothreitol [DTT]</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gel</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>4561033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Phusion Flash PCR Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>F 548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetic acid glacial</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>20104.298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose D-5</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>LF45130653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra -15 Centrifugal filters Ultracel -30K</td>
			<td>Millipore Ltd</td>
			<td>UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0400-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Novagene</td>
			<td>70750-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue&#160;</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>8122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete protease inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11231400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Pac 10 DG Desalting column</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>732-2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>24388.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-6405-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HindIII</td>
			<td>Roche</td>
			<td>656313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisSelect HF Nickel Affinity Gel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>20252.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>AppliChem Panreac</td>
			<td>A1073,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth Miller</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>L3152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc.</td>
			<td>191421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>27808.297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>ER0571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>C6010-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pProEx HTb vector&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>10711018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer</td>
			<td>&#160;Eurofins mwg operon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel extraction kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification kid</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>75746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 6 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5172-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA gel stain</td>
			<td>Invitrogen life technology</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 ligase</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>home made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOP 10</td>
			<td>Invitrogen life technology</td>
			<td>C404003&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uno Q 1R column&#160;</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>720 0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>MPBiomedicals, LLC</td>
			<td>194834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beamline control software BsXCuBE</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camserver software</td>
			<td>Dectris</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>detector control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAMAVER</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>program to align ab initio models&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAMMIF</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>ab initio&#160; model reconstruction programm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC program Biologic Duo Flow</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC program LabSolutions</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPyB</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85.</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMUS</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>program, which performs the manipulation with experimental SAXS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyMOL</td>
			<td>DeLano Scientific LLC</td>
			<td>https://www.pymol.org/</td>
			<td>software for visualization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPCOMB</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>program to superimpose 3D structures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLogic Duo Flow</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLogic Biofrac Fraction collector</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC system</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labsonic P</td>
			<td>Sartorius Stedim biotech</td>
			<td>BBI8535108</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

online size-exclusion and ion-exchange chromatography on a saxs beamline

Biologisk lille vinkel røntgenspredning (BioSAXS) er en kraftfuld teknik i molekylær og strukturel biologi anvendes til at bestemme opløsning struktur, partikelstørrelse og form, og flade-til-volumen-forholdet af makromolekyler. Teknikken kan anvendes til en meget bred vifte af løsningsmodeller betingelser spænder over en bred vifte af koncentrationer, pH-værdier, ioniske styrker, temperaturer, tilsætningsstoffer osv, men prøven er forpligtet til at være monodisperse. Denne advarsel førte til gennemførelsen af ​​væskekromatografi systemer på SAXS beamlines. Her beskriver vi den opstrøms integration af størrelsesudelukkelseschromatografi (SEC) og ionbytningskromatografi (IEC) på en beamline, forskellige metoder til optimal baggrund subtraktion, og datareduktion. Som et eksempel beskriver vi, hvordan vi bruger SEC og IEC-SAXS på et fragment af det essentielle vacciniavirus protein D5, der består af en D5N helicasedomænet. Vi bestemme dens overordnede form og molekylvægt, der viser den hexameriske struktur the-protein.

Resultaterne af model-fri invariant analyse er anført i tabel 1. Analysen af D5 323-785 SEC-SAXS data viste en molekylmasse skøn (fra en Porod analyse) af 345 kDa versus 338 kDa, observeret ved hjælp af IEC-SAXS. Begge er i overensstemmelse med den forventede masse på 6 gange 53,5 kDa (321 kDa) for en hexamer. Den ab initio modellering af begge datasæt blev gennemført uden pålagt symmetri (SEC-SAXS: χ 2 = 0,88, IEC-SAXS: χ 2 = 3,1), og ved hjælp af C6 symmetri (SEC-SAXS: χ 2 = 1,0, IEC-SAXS : χ 2 = 4). Da de overordnede passer til spredningen data for begge rekonstruktioner er sammenlignelige i begge tilfælde (Figur 1D og E), kan C6 symmetri antages. Således modellen svarer til en sekskantet kegle-lignende struktur med en central kanal, som vises delvis blokeret (SEC: Figur 1F; IEC: <strong&gt; Figur 1G, overlay Figur 1 H). En undersøgelse af de enkelte modeller inden gennemsnit viser, at denne hindring er sandsynligvis være en artefakt af gennemsnit processen. <img alt="figur 1" src="/files/ftp_upload/54861/54861fig1x.jpg" /> Figur 1: SAXS dataanalyse og sammenligning af D5 323 -785 (figur tilpasset fra Referencer 12 og 18). A) Skematisk domæne struktur D5 protein og D5 323-785. B) Offline ion-udveksling kromatogram med angivelse af de tre toppe. Orange kurve: Absorbans ved 280 nm (au), blå kurve: Procent af puffer B. Procentdele af puffer B ved toppene er angivet. C) Online ion-udveksling kromatogram. Farve nøgle som i B. Derudover er den målte intensitet angivet med grøn. Den eksperimentelle spredning kurve and beregnede kurve af modellen opnås ved SEC-SAXS D) og IEC E) dataanalyse af D5 323-785. F) Bead model af D5 323-785 baseret på SEC-data og G) IEC data. H) overlejring af SEC og IEC-modeller. Panelerne i F) til H) blev oprettet ved hjælp af en molekylær visualisering software 24. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54861/54861fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Parametre data-indsamling </td><td></td></tr><tr><td> Instrument: </td><td> ESRF BM29 </td></tr><tr><td> Bølgelængde (Å) </td><td> 0.99 </td></tr><tr><td> q-range (Å -1) </td><td> ,0032-,49 </td></tr><tr><td> Prøve-til-detektor afstand </td><td> 2,864 m </td></tr><tr><td> Eksponering tid (sek) </td><td> 1 per ramme </td></tr><tr><td> Koncentration rækkevidde </td><td> na </td></tr><tr><td> Temperatur (K) </td><td> 293 </td></tr><tr><td> detektor </td><td> Pilatus 1M (Dectris) </td></tr><tr><td> Flux (fotoner / s) </td><td> 1 × 10 12 </td></tr><tr><td> Beam størrelse (um 2) </td><td> 700 × 700 </td></tr><tr><td> Strukturelle parametre for D5 323-785, SEK </td><td></td></tr><tr><td> I 0 (cm-1) [fra Guinier] </td><td> 0,0237 </td></tr><tr><td> Rg (Å) [fra Guinier] </td><td> 48 </td></tr><tr><td> q min R g - q max Rg anvendes til Guinier </td><td> 0,77-1,24 </td></tr><tr><td> D max (Å) [fra P (R)] </td><td> 145 </td></tr><tr><td> q-måleområder for p (r) (Å -1)</td><td> 0,02 til 0,17 </td></tr><tr><td> Porod volumen V p (Å 3) [fra Scatter] </td><td> (570 ± 5) × 10 3 </td></tr><tr><td> Molekylær masse M r (kDa) [fra V p] </td><td> 345 </td></tr><tr><td> Beregnet monomer hr fra sekvensen (kDa) </td><td> 321 </td></tr><tr><td> Strukturelle parametre for D5 323-785, IEC </td><td></td></tr><tr><td> I 0 (cm-1) [fra Guinier] </td><td> 0,386 </td></tr><tr><td> Rg (Å) [fra Guinier] </td><td> 46,5 ± 0,1 </td></tr><tr><td> q min R g - q max Rg anvendes til Guinier </td><td> 0,44-1,29 </td></tr><tr><td> D max (Å) [fra P (R)] </td><td> 120 </td></tr><tr><td> q-måleområder for p (r) (Å -1) </td><td> 0,03-0,18 </td></tr><tr><td> Porod volumen V p (&amp; #197; 3) [fra Scatter] </td><td> (577 ± 5) × 10 3 </td></tr><tr><td> Molekylær masse M r (kDa) [fra V p] </td><td> 339 </td></tr><tr><td> Beregnet hexamere hr fra sekvensen (kDa) </td><td> 321 </td></tr></tbody></table> Tabel 1: SAXS data parametre. Tabellen opsummerer parametrene for SAXS indsamling og analyse af data.

Watch this Scientific Journal Video about Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline at JoVE.com

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

Bestemmelsen af ​​opløsningen struktur af et protein ved lille vinkel røntgenspredning (SAXS) kræver monodisperse prøver. Her præsenterer vi to muligheder for at sikre minimale forsinkelser mellem prøveforberedelse og dataopsamling: online størrelse-(SEC) og online ionbytningskromatografi (IEC).

Online Size-udelukkelse og ionbytningskromatografi på en SAXS Beamline

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrosprayioniserings Brint-deuterium Exchange-massespektrometri til at studere proteiners struktur og Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En simpel metode til High Throughput kemisk Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Protein fordøjelse, ultrafiltrering og størrelse udstødelse kromatografi at optimere Isolation af Exosomes fra humant blod Plasma og Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

Ionbytning kromatografi (IEX) koblet til multi-vinkel lysspredning (MALS) for Protein adskillelse og karakterisering

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Karakterisering af proteiner efter størrelse-eksklusions kromatografi koblet til multi-vinkel Light spredning (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Cellekultur på silicium nitrid membraner og Cryopreparation for Synchrotron røntgen fluorescens Nano-analyse

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Umålrettet flydende kromatografi-massespektrometri-baserede metabolomiske analyse af hvedekorn

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

Analyse af SEC-SAXS-data via EFA-deconvolution og Scatter

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Semikvantitativ analyse af peptidoglycan ved væskekromatografi, massespektrometri og bioinformatik

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

En prøveforberedelsespipeline til mikrokrystaller på VMXm Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...