Name: online size-exclusion and ion-exchange chromatography on a saxs beamline
Uploaded: 2017-01-05T12:30:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline at JoVE.com

We acknowledge financial support for the project from the French grant REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 and by research grants from the Service de Sant&#233; des Arm&#233;es and the D&#233;l&#233;gation G&#233;n&#233;rale pour l'Armement. We are thankful to the ESRF for the SAXS beam time. We thank Andrew McCarthy, Gordon Leonard, Wim Burmeister, and Guy Schoehn for financial and scientific support.

<ol>
	<li>Graewert, M. A., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+and+progress+in+small+and+wide+angle+X-ray+scattering+(SAXS+and+WAXS).">Impact and progress in small and wide angle X-ray scattering (SAXS and WAXS).</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 23, 748-754 (2013).</li><li>Jacques, D. A., Trewhella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-angle+scattering+for+structural+biology-Expanding+the+frontier+while+avoiding+the+pitfalls.">Small-angle scattering for structural biology-Expanding the frontier while avoiding the pitfalls.</a> Protein Sci. 19, 642-657 (2010).</li><li>Kikhney, A. G., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+small+angle+X-ray+scattering+(SAXS)+of+flexible+and+intrinsically+disordered+proteins.">A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins.</a> FEBS Lett. 589, 2570-2577 (2015).</li><li>Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+solution+scattering+(SAXS)+combined+with+crystallography+and+computation:+defining+accurate+macromolecular+structures,+conformations+and+assemblies+in+solution.">X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution.</a> Q. Rev. Biophys. 40, 191-285 (2007).</li><li>Vestergaard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+biostructural+changes,+dynamics,+and+interactions+-+Small-angle+X-ray+scattering+to+the+rescue.">Analysis of biostructural changes, dynamics, and interactions - Small-angle X-ray scattering to the rescue.</a> Arch. Biochem. Biophys. , (2016).</li><li>David, G., P&#233;rez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+sampler+robot+and+high-performance+liquid+chromatography:+a+fully+automated+system+for+biological+small-angle+X-ray+scattering+experiments+at+the+Synchrotron+SOLEIL+SWING+beamline.">Combined sampler robot and high-performance liquid chromatography: a fully automated system for biological small-angle X-ray scattering experiments at the Synchrotron SOLEIL SWING beamline.</a> J. Appl. Crystallogr. 42, 892-900 (2009).</li><li>Graewert, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Pipeline+for+Purification,+Biophysical+and+X-Ray+Analysis+of+Biomacromolecular+Solutions.">Automated Pipeline for Purification, Biophysical and X-Ray Analysis of Biomacromolecular Solutions.</a> Sci. Rep. 5, (2015).</li><li>Lambright, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+techniques+enhance+the+quality+and+scope+of+information+obtained+from+SAXS.">Complementary techniques enhance the quality and scope of information obtained from SAXS.</a> ACA Trans. , 1-12 (2013).</li><li>Mathew, E., Mirza, A., Menhart, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-chromatography-coupled+SAXS+for+accurate+sizing+of+aggregating+proteins.">Liquid-chromatography-coupled SAXS for accurate sizing of aggregating proteins.</a> J. Synchrotron Radiat. 11, 314-318 (2004).</li><li>Round, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+GH3.+12+protein+conformation+through+HPLC-integrated+SAXS+measurements+combined+with+X-ray+crystallography.">Determination of the GH3. 12 protein conformation through HPLC-integrated SAXS measurements combined with X-ray crystallography.</a> Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 69, 2072-2080 (2013).</li><li>Watanabe, Y., Inoko, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-exclusion+chromatography+combined+with+small-angle+X-ray+scattering+optics.">Size-exclusion chromatography combined with small-angle X-ray scattering optics.</a> J. Chromatogr. 1216, 7461-7465 (2009).</li><li>Hutin, S., Brennich, M. E., Maillot, B., Round, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+ion-exchange+chromatography+for+small+angle+X-ray+scattering.">Online ion-exchange chromatography for small angle X-ray scattering.</a> Acta Cryst. , (2016).</li><li>Selkirk, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion-exchange+chromatography.">Ion-exchange chromatography.</a> Protein Purification Protocols. , 125-131 (2004).</li><li>Yigzaw, Y., Hinckley, P., Hewig, A., Vedantham, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+exchange+chromatography+of+proteins+and+clearance+of+aggregates.">Ion exchange chromatography of proteins and clearance of aggregates.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 10, 421-426 (2009).</li><li>Pernot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upgraded+ESRF+BM29+beamline+for+SAXS+on+macromolecules+in+solution.">Upgraded ESRF BM29 beamline for SAXS on macromolecules in solution.</a> J. Synchrotron Radiat. 20, 660-664 (2013).</li><li>Iyer, L. M., Koonin, E. V., Leipe, D. D., Aravind, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+evolution+of+the+archaeo-eukaryotic+primase+superfamily+and+related+palm-domain+proteins:+structural+insights+and+new+members.">Origin and evolution of the archaeo-eukaryotic primase superfamily and related palm-domain proteins: structural insights and new members.</a> Nucleic Acids Res. 33, 3875-3896 (2005).</li><li>Singleton, M. R., Dillingham, M. S., Wigley, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+helicases+and+nucleic+acid+translocases.">Structure and mechanism of helicases and nucleic acid translocases.</a> Annu. Rev. Biochem. 76, 23-50 (2007).</li><li>Hutin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+organization+of+vaccinia+virus+helicase-primase+D5.">Domain organization of vaccinia virus helicase-primase D5.</a> J. Virol. , 4604-4613 (2016).</li><li>Round, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioSAXS+Sample+Changer:+a+robotic+sample+changer+for+rapid+and+reliable+high-throughput+X-ray+solution+scattering+experiments.">BioSAXS Sample Changer: a robotic sample changer for rapid and reliable high-throughput X-ray solution scattering experiments.</a> Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 71, 67-75 (2015).</li><li>De Maria Antolinos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISPyB+for+BioSAXS,+the+gateway+to+user+autonomy+in+solution+scattering+experiments.">ISPyB for BioSAXS, the gateway to user autonomy in solution scattering experiments.</a> Acta Crystallographica Section D. 71, 76-85 (2015).</li><li>Brennich, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+data+analysis+at+the+ESRF+bioSAXS+beamline,+BM29.">Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29.</a> J. Appl. Crystallogr. 49, (2016).</li><li>Petoukhov, M. V., Konarev, P. V., Kikhney, A. G., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATSAS+2.1-towards+automated+and+web-supported+small-angle+scattering+data+analysis.">ATSAS 2.1-towards automated and web-supported small-angle scattering data analysis.</a> J. Appl. Crystallogr. 40, 223-228 (2007).</li><li>Franke, D., Jeffries, C. M., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+Map,+a+goodness-of-fit+test+for+one-dimensional+X-ray+scattering+spectra.">Correlation Map, a goodness-of-fit test for one-dimensional X-ray scattering spectra.</a> Nat. Methods. 12, 419-422 (2015).</li><li>Schrodinger, LLC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8. , (2015).</li><li>Jensen, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+SAXS+measurements+facilitated+by+online+HPLC+buffer+exchange.">Time-resolved SAXS measurements facilitated by online HPLC buffer exchange.</a> J. Synchrotron Radiat. 17, 769-773 (2010).</li><li>Hynson, R. M., Duff, A. P., Kirby, N., Mudie, S., Lee, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ultracentrifugation+coupled+to+small-angle+X-ray+scattering+on+macromolecular+complexes.">Differential ultracentrifugation coupled to small-angle X-ray scattering on macromolecular complexes.</a> J. Appl. Crystallogr. 48, 769-775 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Voor veel macromoleculen, wordt een laatste zuiveringsstap met behulp van chromatografie vereist voor SAX het verzamelen van gegevens om een ​​goede kwaliteit dataset te verkrijgen. Echter, niet alle monsters stabiel; zij kunnen gevoelig zijn voor aggregatie of opnieuw evenwicht zijn om een ​​mengsel van oligomerisatie staten. Daarom is een laatste keer zuiveringsstap de bundellijn nodig is om de tijd tussen zuivering en gegevensverzameling minimaliseren om de beste kwaliteit SAXS gegevens. Afhankelijk van de biofysische eigenschappen van het eiwit van belang kunnen SEC-SAXS of IEC-SAX worden gekozen om een ​​optimale kwaliteit van het monster te verkrijgen. Hier, op een eiwit construct afgeleid van de helicase / primase D5, beide technieken zijn toegelicht en besproken. Overname van SEC-SAX data wordt steeds meer en meer gestandaardiseerd en is beschikbaar op veel BioSAXS beamlines. Gegevensanalyse name achtergrond aftrek, is relatief eenvoudig en gemakkelijk. Echter, een stabiele buffer signaalen de voldoende scheiding van de macromoleculaire soorten blijft essentieel. Daarom is het essentieel dat voldoende tijd voor de kolom grondig equilibreren reserveren. Falen van deze werkwijze kan het gevolg afbreekbare verontreinigingen van overeenkomstige grootte als het eiwit van belang, lage concentraties en stralingsgevoelige buffers. In de praktijk aanvankelijk SEC-SAXS waarschijnlijk wordt gebruikt als de methode van keuze voor de meeste macromoleculaire monsters. Nog veel zuiveringsprotocollen een voorafgaande IEC-stap door de aanwezigheid van verontreinigingen of aggregatie. Aangezien elke concentratie en chromatografie stap gaat gepaard met verlies van monster (geschat op 30-50%) en de tijd direct IEC-SAXS gunstig. Voor monsters die niet kunnen worden gezuiverd door SEC, hetzij door de aanwezigheid van vergelijkbare grootte &quot;contaminanten&quot; of omdat ze sterk geaggregeerde onder voldoende concentraties IEC-SAXS zou altijd beter geschikt benadering. Verder ondersteund de hogere stroomsnelhedendoor vele IEC kolommen kunnen helpen de transittijd tussen zuivering en meting verminderen. In het hier gepresenteerde voorbeeld, werd gebruikt met een IEC stap elutie, waardoor de scheiding van de nauwe toppen van D5 323-785 van verontreinigingen door het zorgvuldig kiezen van de zoutconcentratie stappen. In principe is het aantal stappen is onbeperkt, maar praktisch wordt ten minste 1 stap per piek vereist, en niet te veel moet worden gekozen. Voor de achtergrond aftrek hierboven beschreven, is het cruciaal om een ​​relatief groot aantal verschillende buffersamenstellingen meten om de overeenkomende vinden. Een gemeenschappelijk nadeel van beide technieken is een onnauwkeurige eiwitconcentratie informatie. Als gevolg van deze nauwkeurige bepaling van de massa op basis van forward verstrooiing is niet mogelijk. Voor bolvormige eiwitten zoals D5 323-785, de Porod volume biedt een alternatief, zij het minder nauwkeurige, massa schatting, maar voor zeer flexibel of ontvouwen eiwittenDeze aanpak zou niet geldig zijn. Een variatie van de stapsgewijze gradiënt IEC-SAX hier gepresenteerde methode is het gebruik van een lineaire gradiënt plaats. Hoewel het mogelijk is met zoveel stappen werken als gewenst sub-pieken te isoleren onder toepassing van een stapsgewijze elutie met lineaire gradiënt benadering, is het vereist om de gradiëntvoorwaarden zorgvuldig optimaliseren om de pieken te scheiden volledig alvorens de SAXS experiment. Achtergrond aftrekken in deze benadering kan worden gedaan frame wijs en kan worden gecontroleerd door de vergelijking van de afzonderlijke frames, maar het vereist meer geavanceerde verwerking van gegevens, en een speciale software bestaat nog niet. De keuze van een geschikte kolom essentieel is voor beide technieken, zoals de scheiding van de macromoleculaire species bepaalt. Size-exclusiekolommen verschillen laadvermogen, het groottebereik scheidbare macromoleculen en resolutie, terwijl ionenuitwisselingskolommen verschillen in de aard en de dichtheidhun geïmmobiliseerd kosten. Terwijl de hier gepresenteerde protocol beschrijft het ESRF bundellijn BM29, aanpassing aan andere SAXS bundellijn is in principe eenvoudig. De belangrijkste eisen zijn een voldoende hoge röntgenstralen flux en een geschikte detector (idealiter enkel-foton-counting), redelijke signaal-geluidsgegevens te verkrijgen in het traject van seconden of minder, en een online Vloeistofchromatografiesysteem staat het creëren hellingen. De precieze uitvoering zal uiteraard afhangen van de lokale omgeving bundellijn. De verkregen op D5 323-785 met behulp van de twee methoden resultaten verschillen enigszins. De gyrostraal iets kleiner voor de IEC gegevens dan de SEC data en de lokale minima van de verstrooiing curve verschoven iets grotere verstrooiing vectoren. Dit betekent dat de D5 323-785 gemeten IEC-SAX iets compacter dan D5 323-785 gemeten met SEC-SAXS. Dit kan be gevolg van verschillen in de monsterbereiding, de tijd tussen zuivering en meting (IEC sneller), of, minder vaak, een verontreiniging in de SEC-gezuiverde monster. De kraal modellen verkregen volledig zelfstandig met beide methoden vergelijkbaar (Figuur 1H). D5 323-785 toont de verwachte holle, hexamere structuur 18. Concluderend online ionenuitwisseling en online size-exclusiechromatografie belangrijke biochemische zuiveringswerkwijzen die direct SAX 6,7,9-12,25,26 kunnen worden gekoppeld. De achtergrond aftrek van IEC-SAX data is iets moeilijker en dubbelzinnige dan SEC-SAXS, maar is het toch mogelijk. Afhankelijk van de biofysische eigenschappen van het eiwit van belang, zowel SEC en IEC-SAXS oog op het optimaliseren van soorten scheiding met inherente voordelen. Mits de validatiestappen (zoals beschreven) correct worden waargenomen, kan de verkregen data te analyseren with vertrouwen en modellen kan worden bepaald met behulp van de standaard beschikbare instrumenten binnen de gemeenschap. Samen, beide technieken mogelijk online scheiding voor een breed scala van biologische macromoleculen, waardoor gegevens niet toegankelijk zijn via standaard statische metingen.

BioSAXS is een krachtig hulpmiddel om de vorm van nano-sized objecten 1-4 te bepalen. De verstrooiing van röntgenstraling door een oplossing met macromoleculen, grootte in het nm wordt opgenomen bij zeer lage hoeken. Dit hoekbereik bevat informatie over globale parameters: de straal van winding; de grootste intraparticle afstand; het deeltje vorm; en de mate van vouwen, denaturatie of aandoening. De techniek is niet vereist kristallen, en het macromolecuul in oplossing blijft en dus in bepaalde omstandigheden nabootsen belangrijke parameters van de cel, zoals ionsterkte, pH, enz. De kennis van deze elementen gehouden kunnen helpen om, bijvoorbeeld, de fysiologisch relevante oligomere toestand van een eiwit van belang of om een ​​voorgestelde model van een complex te valideren. De karakterisering van proteïne-proteïne interacties in verschillende bufferomstandigheden, het creëren van modellen ontbrekende domeinen, de verfijning van homologie modellen en debeëindiging van discrete gevouwen en ontvouwen toestanden kunnen snel en eenvoudig 5 worden uitgevoerd. Zoals met elke techniek, BioSAXS intrinsieke tekortkomingen: geaggregeerde of gedenatureerde monsters, mengsels van deeltjes, heterogene monsters, stralingsschade en buffer mismatches kan leiden tot niet-interpreteerbare gegevens. Voor veel analysemethoden wordt impliciet aangenomen dat het monster monodisperse, een vereiste dat vaak moeilijk te verkrijgen in de praktijk. In veel gevallen, de afbraak van het monster is subtiel en kan niet in de gegevens op zichzelf worden gedetecteerd en elke poging om de gegevens te interpreteren geeft onnauwkeurige of misleidende resultaten. Om deze hindernissen te overwinnen, de combinatie van grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) en SAXS werd uitgevoerd op vele bundellijnen datakwaliteit te waarborgen en deze techniek toegankelijker voor steeds moeilijker monsters 6-11 maken. Onlangs hebben we een nieuwe methode voor het repertoire van ontwikkeling online ionenuitwisselingchromatografie (IEC) -gekoppelde SAXS 12. Beide technieken zijn het openen van SAX om een ​​breed scala van biologische deeltjes die vroeger onmogelijk te analyseren. De keuze van de methode om te gebruiken is afhankelijk van de biofysische eigenschappen van de deeltjes van belang. SEC scheidt macromoleculen door hun omvang, waarbij ten minste 10% verschil in schijnbare molecuulmassa nodig voor de scheiding. Fysieke beperkingen van de kolom en fysiologische eigenschappen van de monsters, zoals hydrofobe oppervlakken, flexibiliteit, en het gebrek aan stabiliteit, ook bemoeilijken het verzamelen van gegevens, analyse en interpretatie. Ionenuitwisselingschromatografie, welke moleculen op basis van hun lading te scheiden, dus hun bindingsaffiniteit aan de kolom IEC, kan worden gebruikt in plaats van of naast SEC. De totale lading kan gemakkelijk worden gemanipuleerd door het veranderen van de pH of het variëren van de zoutconcentratie van de buffer, voor een relatief eenvoudige werkwijze voor de gecontroleerde elution van de moleculen van de kolom IEC. Via de lading, de scheiding van soortgelijke en groottes van moleculen die anders moeilijk te scheiden zou kunnen worden routinematig uitgevoerd IEC. Bovendien IEC heeft het voordeel te kunnen gaan met verdunde monsters, zodat men de concentratiestappen, waarbij het potentiële risico van denatureren van het eiwit dragen voorkomen. Helaas, als de ladingsverdeling sterk sample-afhankelijke, IEC vereist optimalisatie met betrekking tot de pH en zoutconcentraties 13,14. Voor veel proteïnen die moeilijk uit te drukken, zuiveren, of beide, slechts geringe hoeveelheden monster beschikbaar te bestuderen. Het is van belang efficiënt en het aantal zuiveringsstappen de verliezen te minimaliseren en derhalve. Daarom is de laatste zuiveringsstap online direct vóór SAXS data acquisitie, teneinde de waarschijnlijkheid van het verzamelen van een goede dataset verhogen. HierPresenteren wij en vergelijk online SEC-SAX en IEC-SAXS. Beide technieken werden uitgevoerd op BioSAXS bundellijn BM29 aan de European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) in Grenoble, Frankrijk 15. Als een test case, gebruikten we de D5N en helicase domein van de vaccinia virus eiwit D5, die vrij moeilijk te analyseren structureel met andere methoden was. De vaccinia virus is een lid van de familie Poxviridae en is 98% identiek aan het variolavirus, de oorzaak van pokken. Met behulp van de vaccinia-systeem, bestuderen we de replicatie machines, met de nadruk hier op de essentiële helicase-primase D5. D5 is een 95-kDa eiwit met een N-terminale archeo-eukaryote primase (AEP) domein 16 gevolgd door een cysteïne clustergebied (res. 240-345) 16. Verder naar de C-terminus heeft een D5N domein (res. 340-460), die altijd geassocieerd met D5-type helicasen, en tenslotte een superfamilie 3 (SF3) helicasedomein (res. 460-785) 17 (Figure 1A). De helicase domein van D5 bouwt een hexamere ringstructuur die nodig is voor sterke binding aan DNA. Dankzij de recente SAX en EM-studies, worden de lage resolutie structuren van de primase en de helicase domeinen nu bekend 18. Hier laten we zien hoe de geïmplementeerde online chromatografie technieken te gebruiken op de BioSAXS bundellijn BM29 bij ESRF om inzicht te krijgen in de structuur van het C-terminale fragment (residu 323-785) van D5.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4 dithiothreitol [DTT]</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gel</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>4561033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Phusion Flash PCR Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>F 548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetic acid glacial</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>20104.298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose D-5</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>LF45130653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra -15 Centrifugal filters Ultracel -30K</td>
			<td>Millipore Ltd</td>
			<td>UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0400-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Novagene</td>
			<td>70750-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue&#160;</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>8122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete protease inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11231400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Pac 10 DG Desalting column</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>732-2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>24388.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-6405-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HindIII</td>
			<td>Roche</td>
			<td>656313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisSelect HF Nickel Affinity Gel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>20252.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>AppliChem Panreac</td>
			<td>A1073,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth Miller</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>L3152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc.</td>
			<td>191421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>27808.297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>ER0571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>C6010-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pProEx HTb vector&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>10711018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer</td>
			<td>&#160;Eurofins mwg operon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel extraction kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification kid</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>75746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 6 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5172-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA gel stain</td>
			<td>Invitrogen life technology</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 ligase</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>home made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOP 10</td>
			<td>Invitrogen life technology</td>
			<td>C404003&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uno Q 1R column&#160;</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>720 0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>MPBiomedicals, LLC</td>
			<td>194834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beamline control software BsXCuBE</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camserver software</td>
			<td>Dectris</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>detector control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAMAVER</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>program to align ab initio models&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAMMIF</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>ab initio&#160; model reconstruction programm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC program Biologic Duo Flow</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC program LabSolutions</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPyB</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85.</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMUS</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>program, which performs the manipulation with experimental SAXS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyMOL</td>
			<td>DeLano Scientific LLC</td>
			<td>https://www.pymol.org/</td>
			<td>software for visualization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPCOMB</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>program to superimpose 3D structures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLogic Duo Flow</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLogic Biofrac Fraction collector</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC system</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labsonic P</td>
			<td>Sartorius Stedim biotech</td>
			<td>BBI8535108</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

online size-exclusion and ion-exchange chromatography on a saxs beamline

Biologische kleine hoek röntgen verstrooiing (BioSAXS) is een krachtige techniek moleculaire en structurele biologie gebruikt oplossingsstructuur, grootte en vorm deeltjesgrootte en oppervlak-tot-volumeverhouding van macromoleculen te bepalen. De techniek is toepasbaar op een breed scala van oplossingsomstandigheden spanning een breed bereik van concentraties, pH, ionische sterkte, temperatuur, additieven, enz., Maar het monster vereist monodispers zijn. Deze waarschuwing heeft geleid tot de uitvoering van vloeistofchromatografie systemen op SAXS beamlines. Hier beschrijven we de stroomopwaartse integratie van grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) en ionenuitwisselingschromatografie (IEC) een bundellijn verschillende werkwijzen voor optimale achtergrond aftrek en gegevensreductie. Als voorbeeld beschrijven we hoe we SEC- en IEC-SAXS op een fragment van de essentiële vaccinia virus eiwit D5, bestaande uit een D5N helicase domein. We bepalen de algehele vorm en moleculair gewicht, die de hexamere structuur van the eiwit.

De resultaten van de model-vrije invariante analyse zijn weergegeven in Tabel 1. De analyse van de D5 323-785 SEC-SAX gegevens toonden een molecuulmassa schatting (een Porod analyse) van 345 kDa versus 338 kDa waargenomen onder toepassing van IEC-SAXS. Beide zijn in overeenstemming met de verwachte massa van 6 keer 53,5 kDa (321 kDa) voor een hexameer. De ab initio modellering van beide datasets werd ondernomen zonder opgelegde symmetrie (SEC-SAX: χ 2 = 0,88, IEC-SAX: χ 2 = 3,1) en het gebruik van C6 symmetrie (SEC-SAX: χ 2 = 1,0, IEC-SAXS : χ 2 = 4). Aangezien de algemene fit voor de verstrooiing gegevens voor beide reconstructies zijn vergelijkbaar in beide gevallen (figuur 1D en E), kan worden aangenomen C6 symmetrie. Dus het model overeen met een hexagonale kegel-achtige structuur met een centraal kanaal, die gedeeltelijk belemmerd wordt (SEC Figuur 1F; IEC: <strong&gt; Figuur 1G, overlay figuur 1H). Een onderzoek van individuele modellen voor middeling blijkt dat dit obstructie is waarschijnlijk een artefact van de middeling proces. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54861/54861fig1x.jpg" /> Figuur 1: SAX data analyse en vergelijking van D5 323 -785 (figuur aangepast van referenties 12 en 18). A) Schematische domeinstructuur van D5 eiwit en D5 323-785. B) Offline ionenwisseling chromatogram met de aanduiding van de drie pieken. Oranje curve: absorptie bij 280 nm (au), blauwe curve: percentage buffer B. Percentages buffer B bij de pieken zijn aangegeven. C) Online ionenwisseling chromatogram. Toets zoals in B. Bovendien is de gemeten intensiteit wordt groen aangegeven. De experimentele curve een verstrooiingnd berekende curve van de verkregen door SEC-SAXS D) en IEC E) data-analyse van de D5 323-785 model. F) Bead model van D5 323-785 gebaseerd op SEC data en G) IEC gegevens. H) Overlay van de SEC en IEC modellen. De panelen in F) tot H) werden gemaakt met behulp van een moleculaire visualisatie software 24. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54861/54861fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Gegevensverzameling parameters </td><td></td></tr><tr><td> Instrument: </td><td> ESRF BM29 </td></tr><tr><td> Golflengte (A) </td><td> 0.99 </td></tr><tr><td> Q-range (-1) </td><td> ,0032-,49 </td></tr><tr><td> Sample-to-detectorafstand </td><td> 2.864 m </td></tr><tr><td> tijdopname (sec) </td><td> 1 per frame </td></tr><tr><td> concentratiegebied </td><td> nvt </td></tr><tr><td> (K) </td><td> 293 </td></tr><tr><td> Detector </td><td> Pilatus 1M (Dectris) </td></tr><tr><td> Flux (fotonen / s) </td><td> 1 x 10 12 </td></tr><tr><td> Bundelbreedte (um 2) </td><td> 700 × 700 </td></tr><tr><td> Structurele parameters voor D5 323-785, SEC </td><td></td></tr><tr><td> I 0 (cm -1) [Van Guinier] </td><td> 0,0237 </td></tr><tr><td> Rg (A) [van Guinier] </td><td> 48 </td></tr><tr><td> q min Rg - Qmax Rg gebruikt Guinier </td><td> 0,77-1,24 </td></tr><tr><td> Dmax (A) [P (r)] </td><td> 145 </td></tr><tr><td> q-range gebruikt voor p (r) (-1)</td><td> 0,02-0,17 </td></tr><tr><td> Porod volume V p (A3) [van Scatter] </td><td> (570 ± 5) × 10 3 </td></tr><tr><td> Moleculaire massa M r (kDa) [van V p] </td><td> 345 </td></tr><tr><td> Berekend monomeer heer van sequentie (kDa) </td><td> 321 </td></tr><tr><td> Structurele parameters voor D5 323-785, IEC </td><td></td></tr><tr><td> I 0 (cm -1) [Van Guinier] </td><td> 0,386 </td></tr><tr><td> Rg (A) [van Guinier] </td><td> 46,5 ± 0,1 </td></tr><tr><td> q min Rg - Qmax Rg gebruikt Guinier </td><td> 0,44-1,29 </td></tr><tr><td> Dmax (A) [P (r)] </td><td> 120 </td></tr><tr><td> q-range gebruikt voor p (r) (-1) </td><td> 0,03-0,18 </td></tr><tr><td> Porod volume Vp (&amp; #197; 3) [van Scatter] </td><td> (577 ± 5) × 10 3 </td></tr><tr><td> Moleculaire massa M r (kDa) [van V p] </td><td> 339 </td></tr><tr><td> Berekend hexameric heer van sequentie (kDa) </td><td> 321 </td></tr></tbody></table> Tabel 1: SAXS gegevensparameters. De tabel geeft een overzicht van de parameters van SAXS data-acquisitie en analyse.

Watch this Scientific Journal Video about Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline at JoVE.com

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

De bepaling van de oplossing structuur van een eiwit door kleine hoek röntgen verstrooiing (SAXS) vereist monodisperse monsters. Hier presenteren we twee mogelijkheden te verzekeren minimale vertragingen tussen monstervoorbereiding en data acquisitie: online size-exclusion chromatography (SEC) en online ionenuitwisselingschromatografie (IEC).

Online Grootte-uitsluiting en ionenuitwisselingschromatografie op een SAX Beamline

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Een eenvoudige methode voor High Throughput chemische Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Vertering van eiwitten, ultrafiltratie en Size Exclusion Chromatography voor het optimaliseren van het isolement van Exosomes uit menselijk bloed Plasma en Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

Ionenwisselingschromatografie (IEX) gekoppeld aan meerdere hoek lichtverstrooiing (MALS) voor eiwit scheiding en karakterisering

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Karakterisering van eiwitten door grootte-uitsluiting chromatografie gekoppeld aan multi-angle lichtverstrooiing (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Celkweek op siliciumnitride membranen en Cryopreparation voor Synchrotron X-Ray fluorescentie nano-analyse

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Ongerichte vloeibare chromatografie-massaspectrometrie-gebaseerde metabolomics analyse van tarwekorrel

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

Analyse van SEC-SAXS-gegevens via EFA-deconvolution en Scatter

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Semi-kwantitatieve analyse van peptidoglycaan door vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en bio-informatica

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Een monstervoorbereidingspijplijn voor microkristallen op de VMXm Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...