Name: online size-exclusion and ion-exchange chromatography on a saxs beamline
Uploaded: 2017-01-05T12:30:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline at JoVE.com

We acknowledge financial support for the project from the French grant REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 and by research grants from the Service de Sant&#233; des Arm&#233;es and the D&#233;l&#233;gation G&#233;n&#233;rale pour l'Armement. We are thankful to the ESRF for the SAXS beam time. We thank Andrew McCarthy, Gordon Leonard, Wim Burmeister, and Guy Schoehn for financial and scientific support.

<ol>
	<li>Graewert, M. A., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+and+progress+in+small+and+wide+angle+X-ray+scattering+(SAXS+and+WAXS).">Impact and progress in small and wide angle X-ray scattering (SAXS and WAXS).</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 23, 748-754 (2013).</li><li>Jacques, D. A., Trewhella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-angle+scattering+for+structural+biology-Expanding+the+frontier+while+avoiding+the+pitfalls.">Small-angle scattering for structural biology-Expanding the frontier while avoiding the pitfalls.</a> Protein Sci. 19, 642-657 (2010).</li><li>Kikhney, A. G., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+small+angle+X-ray+scattering+(SAXS)+of+flexible+and+intrinsically+disordered+proteins.">A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins.</a> FEBS Lett. 589, 2570-2577 (2015).</li><li>Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+solution+scattering+(SAXS)+combined+with+crystallography+and+computation:+defining+accurate+macromolecular+structures,+conformations+and+assemblies+in+solution.">X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution.</a> Q. Rev. Biophys. 40, 191-285 (2007).</li><li>Vestergaard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+biostructural+changes,+dynamics,+and+interactions+-+Small-angle+X-ray+scattering+to+the+rescue.">Analysis of biostructural changes, dynamics, and interactions - Small-angle X-ray scattering to the rescue.</a> Arch. Biochem. Biophys. , (2016).</li><li>David, G., P&#233;rez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+sampler+robot+and+high-performance+liquid+chromatography:+a+fully+automated+system+for+biological+small-angle+X-ray+scattering+experiments+at+the+Synchrotron+SOLEIL+SWING+beamline.">Combined sampler robot and high-performance liquid chromatography: a fully automated system for biological small-angle X-ray scattering experiments at the Synchrotron SOLEIL SWING beamline.</a> J. Appl. Crystallogr. 42, 892-900 (2009).</li><li>Graewert, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Pipeline+for+Purification,+Biophysical+and+X-Ray+Analysis+of+Biomacromolecular+Solutions.">Automated Pipeline for Purification, Biophysical and X-Ray Analysis of Biomacromolecular Solutions.</a> Sci. Rep. 5, (2015).</li><li>Lambright, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+techniques+enhance+the+quality+and+scope+of+information+obtained+from+SAXS.">Complementary techniques enhance the quality and scope of information obtained from SAXS.</a> ACA Trans. , 1-12 (2013).</li><li>Mathew, E., Mirza, A., Menhart, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-chromatography-coupled+SAXS+for+accurate+sizing+of+aggregating+proteins.">Liquid-chromatography-coupled SAXS for accurate sizing of aggregating proteins.</a> J. Synchrotron Radiat. 11, 314-318 (2004).</li><li>Round, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+GH3.+12+protein+conformation+through+HPLC-integrated+SAXS+measurements+combined+with+X-ray+crystallography.">Determination of the GH3. 12 protein conformation through HPLC-integrated SAXS measurements combined with X-ray crystallography.</a> Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 69, 2072-2080 (2013).</li><li>Watanabe, Y., Inoko, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-exclusion+chromatography+combined+with+small-angle+X-ray+scattering+optics.">Size-exclusion chromatography combined with small-angle X-ray scattering optics.</a> J. Chromatogr. 1216, 7461-7465 (2009).</li><li>Hutin, S., Brennich, M. E., Maillot, B., Round, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+ion-exchange+chromatography+for+small+angle+X-ray+scattering.">Online ion-exchange chromatography for small angle X-ray scattering.</a> Acta Cryst. , (2016).</li><li>Selkirk, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion-exchange+chromatography.">Ion-exchange chromatography.</a> Protein Purification Protocols. , 125-131 (2004).</li><li>Yigzaw, Y., Hinckley, P., Hewig, A., Vedantham, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+exchange+chromatography+of+proteins+and+clearance+of+aggregates.">Ion exchange chromatography of proteins and clearance of aggregates.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 10, 421-426 (2009).</li><li>Pernot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upgraded+ESRF+BM29+beamline+for+SAXS+on+macromolecules+in+solution.">Upgraded ESRF BM29 beamline for SAXS on macromolecules in solution.</a> J. Synchrotron Radiat. 20, 660-664 (2013).</li><li>Iyer, L. M., Koonin, E. V., Leipe, D. D., Aravind, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+evolution+of+the+archaeo-eukaryotic+primase+superfamily+and+related+palm-domain+proteins:+structural+insights+and+new+members.">Origin and evolution of the archaeo-eukaryotic primase superfamily and related palm-domain proteins: structural insights and new members.</a> Nucleic Acids Res. 33, 3875-3896 (2005).</li><li>Singleton, M. R., Dillingham, M. S., Wigley, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+helicases+and+nucleic+acid+translocases.">Structure and mechanism of helicases and nucleic acid translocases.</a> Annu. Rev. Biochem. 76, 23-50 (2007).</li><li>Hutin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+organization+of+vaccinia+virus+helicase-primase+D5.">Domain organization of vaccinia virus helicase-primase D5.</a> J. Virol. , 4604-4613 (2016).</li><li>Round, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioSAXS+Sample+Changer:+a+robotic+sample+changer+for+rapid+and+reliable+high-throughput+X-ray+solution+scattering+experiments.">BioSAXS Sample Changer: a robotic sample changer for rapid and reliable high-throughput X-ray solution scattering experiments.</a> Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 71, 67-75 (2015).</li><li>De Maria Antolinos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISPyB+for+BioSAXS,+the+gateway+to+user+autonomy+in+solution+scattering+experiments.">ISPyB for BioSAXS, the gateway to user autonomy in solution scattering experiments.</a> Acta Crystallographica Section D. 71, 76-85 (2015).</li><li>Brennich, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+data+analysis+at+the+ESRF+bioSAXS+beamline,+BM29.">Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29.</a> J. Appl. Crystallogr. 49, (2016).</li><li>Petoukhov, M. V., Konarev, P. V., Kikhney, A. G., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATSAS+2.1-towards+automated+and+web-supported+small-angle+scattering+data+analysis.">ATSAS 2.1-towards automated and web-supported small-angle scattering data analysis.</a> J. Appl. Crystallogr. 40, 223-228 (2007).</li><li>Franke, D., Jeffries, C. M., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+Map,+a+goodness-of-fit+test+for+one-dimensional+X-ray+scattering+spectra.">Correlation Map, a goodness-of-fit test for one-dimensional X-ray scattering spectra.</a> Nat. Methods. 12, 419-422 (2015).</li><li>Schrodinger, LLC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8. , (2015).</li><li>Jensen, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+SAXS+measurements+facilitated+by+online+HPLC+buffer+exchange.">Time-resolved SAXS measurements facilitated by online HPLC buffer exchange.</a> J. Synchrotron Radiat. 17, 769-773 (2010).</li><li>Hynson, R. M., Duff, A. P., Kirby, N., Mudie, S., Lee, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ultracentrifugation+coupled+to+small-angle+X-ray+scattering+on+macromolecular+complexes.">Differential ultracentrifugation coupled to small-angle X-ray scattering on macromolecular complexes.</a> J. Appl. Crystallogr. 48, 769-775 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Für viele Makromolekülen unter Verwendung von Chromatographie eine abschließende Reinigungsschritt erforderlich ist, bevor zu SAXS Datensammlung eine gute Qualität Datensatz zu erhalten. Allerdings sind nicht alle Proben stabil bleiben; sie können zur Aggregation oder Wieder Äquilibrierung zu einer Mischung aus Oligomerisierung Zustände anfällig. Daher wird eine endgültige Online-Reinigungsschritt auf der Strahllinie erforderlich, um die Zeit zwischen Reinigung und Datenerfassung zu minimieren, um die beste Qualität SAXS Daten zu erhalten. In Abhängigkeit von den biophysikalischen Eigenschaften des Proteins von Interesse, SEC-SAXS oder IEC-SAXS könnte optimale Probenqualität zu erhalten gewählt werden. Hier auf einem Proteinkonstrukt abgeleitet von der Helikase / Primase D5 werden beide Techniken erläutert und diskutiert. Erwerb von SEC-SAXS-Daten werden immer mehr standardisiert werden und ist auf vielen BioSAXS Strahlrohre. Die Datenanalyse, insbesondere Untergrundsubtraktion, ist relativ einfach und leicht. Jedoch ist ein stabiles Puffersignalund die ausreichende Trennung der makromolekularen Spezies bleibt unerlässlich. Daher ist es wichtig, genug Zeit zu reservieren, die Säule gründlich zu äquilibrieren. Versagen dieser Methode kann wegen persistent Verunreinigungen von ähnlicher Größe zu dem Protein von Interesse, niedrigen Konzentrationen und strahlungsempfindlichen Puffer sein. In der Praxis wird zunächst ist SEC-SAXS wahrscheinlich als die Methode der Wahl für die meisten hochmolekularen Proben verwendet werden. viele Reinigungsprotokolle erfordern eine vorherige IEC Schritt aufgrund des Vorhandenseins von Verunreinigungen oder Aggregation noch. Da jede Konzentration und Chromatographie-Schritt mit Verlusten von Probe (schätzungsweise 30-50%) zugeordnet ist, und die Zeit ist auch eine direkte IEC-SAXS vorteilhaft. Bei Proben, die nicht durch SEC gereinigt werden, sei es aufgrund der Anwesenheit von ähnlicher Größe &quot;Verunreinigungen&quot; oder weil sie bei den erforderlichen Konzentrationen stark Aggregat, IEC-SAXS würde die besser geeigneten Ansatz immer sein. Auch die höheren Strömungsraten unterstütztdurch viele können IEC Spalten helfen, die Laufzeit zwischen Reinigung und Messung zu reduzieren. In dem hier vorgestellten Beispiel wurde IEC mit einer Stufe Elution verwendet, die durch sorgfältige Auswahl der Salzkonzentration Schritte zur Trennung der Nähe Peaks von D5 323-785 von Verunreinigungen ermöglicht. Im Prinzip ist die Anzahl der Schritte unbegrenzt, praktisch aber mindestens 1 pro Schritt peak erforderlich ist, und nicht zu viele gewählt werden sollte. Für den Hintergrund Subtraktionsverfahren oben beschrieben, ist es wichtig, eine relativ hohe Anzahl von verschiedenen Pufferzusammensetzungen zu messen, um die Anpassung zu finden. Ein gemeinsamer Nachteil beider Techniken ist der Mangel an präzisen Proteinkonzentration Informationen. Aus diesem Grund, und zwar auf Vorwärtsstreuung basierend Massenbestimmung ist nicht möglich. Für globuläre Proteine wie D5 323-785, bietet das Porod Volumen eine Alternative, wenn auch weniger präzise, Massenschätzung, sondern auch für hochflexible oder ungeordnete ProteineDieser Ansatz wäre, nicht gültig sein. Eine Variante der stufenweisen Gradienten IEC-SAXS hier vorgestellten Verfahren ist die Verwendung eines linearen Gradienten statt. Während es möglich ist, mit so vielen Schritten zu arbeiten, wie gewünscht Teilspitzen unter Verwendung eines stufenweisen Elution, in dem linearen Gradienten Ansatz zu isolieren, ist es erforderlich, die Steigung Bedingungen sorgfältig zu optimieren, um die Spitzen vollständig zu trennen, bevor die SAXS Start Experiment. Hintergrund Subtraktion in diesem Ansatz könnte rahmenweise getan werden, und konnte durch den Vergleich der einzelnen Frames überprüft werden, aber es erfordert erweiterte Datenverarbeitung und eine spezielle Software noch nicht existiert. Die Wahl einer geeigneten Säule ist für beide Techniken kritisch, da sie die Trennung der makromolekularen Spezies bestimmt. Größenausschluss-Säulen unterscheiden sich in der Belastbarkeit, dem Größenbereich von trennbaren Makromoleküle und Auflösung, während Ionenaustauschsäulen in der Art variieren und die Dichteihrer immobilisiert Ladungen. Während die hier vorgestellten Protokoll zur ESRF beamline BM29, Anpassung an andere SAXS-Strahllinie spezifisch ist im Prinzip einfach. Die wichtigsten Anforderungen sind eine ausreichend hohe Röntgenfluss und einem geeigneten Detektor (idealerweise Einzelphotonenzählung), vernünftigen Signal-zu-Rausch-Daten im Bereich von Sekunden zu erwerben oder weniger und eine Online-Flüssigkeits-Chromatographie System in der Lage zu schaffen Steigungen. Die genaue Umsetzung wäre natürlich, abhängig von der lokalen Umgebung-Strahlrohr. Die erhaltenen Ergebnisse auf D5 323-785 die beiden Methoden unterscheiden sich geringfügig. Der Gyrationsradius ist etwas kleiner für die IEC-Daten als für die SEC-Daten und der lokalen Minima der Streukurve sind etwas größere Streuvektoren verschoben. Das bedeutet , dass die D5 323-785 gemessen mit IEC-SAXS ist etwas kompakter als die D5 323-785 gemessen mit SEC-SAXS. Dies könnte be aufgrund der Unterschiede in der Probenvorbereitung, in der Zeit zwischen Reinigung und Messung (IEC ist schneller) oder, weniger wahrscheinlich auf eine Verunreinigung in dem SEC-gereinigte Probe. Die Perle Modelle völlig unabhängig mit beiden Verfahren erhalten werden , sind vergleichbar (Abbildung 1H). D5 323-785 zeigt die erwartete hohle, hexameren Struktur 18. Abschließend sind online Ionenaustausch- und Online - Grßenausschlußchromatographie wichtige biochemische Reinigungsverfahren , die direkt mit SAXS 6,7,9-12,25,26 koppelbar ist. Der Hintergrund Subtraktion von IEC-SAXS-Daten ist etwas schwieriger und zweideutig als für SEC-SAXS, aber es ist trotzdem möglich. In Abhängigkeit von den biophysikalischen Eigenschaften des Proteins von Interesse, sowohl SEC und IEC-SAXS ermöglichen die Optimierung der Spezies Trennung mit inhärenten Vorteile. Vorausgesetzt, dass die Validierungsschritte (wie beschrieben) sind wit korrekt beobachtet, können die resultierenden Daten analysiert werden,h Vertrauen und Modelle können mit den Standard-Tools zur Verfügung innerhalb der Gemeinschaft festgelegt werden. Zusammen ermöglichen die beiden Techniken Online-Trennung für eine breite Palette von biologischen Makromolekülen, wodurch man die Daten nicht zugänglich über Standard-statische Messungen.

BioSAXS ist ein leistungsfähiges Werkzeug , um die Form von Nanogröße Objekte 1-4 zu bestimmen. Die Streuung von Röntgenstrahlen durch eine Lösung von Makromolekülen, Größe im nm-Bereich enthält, wird bei sehr niedrigen Winkeln aufgezeichnet. Dieser Winkelbereich enthält Informationen über die globalen Parameter: der Gyrationsradius; die größte Intrapartikelporositäten Abstand; die Partikelform; und der Grad der Faltung, Denaturierung oder einer Störung. Die Technik keine Kristalle erforderlich ist , und das Makromolekül in Lösung bleibt und damit unter Bedingungen nachahmt bestimmte wichtige Parameter der Zelle, wie Ionenstärke, pH, usw. Die Kenntnis dieser Faktoren gehalten werden kann , könnte helfen , zu bestimmen, zum Beispiel, die physiologisch relevanten oligomere Zustand eines Proteins von Interesse oder ein vorgeschlagenes Modell eines Komplexes zu validieren. Die Charakterisierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in verschiedenen Pufferbedingungen, die Schaffung von Modellen von fehlenden Domänen, die Verfeinerung der Homologie-Modelle und die deBeendigung von diskreten gefalteten und entfalteten Zustände können schnell und einfach 5 durchgeführt werden. Wie bei jeder Technik, hat BioSAXS intrinsische Schwächen: aggregiert oder denaturierte Proben, Mischungen von Partikeln, heterogenen Proben, Strahlenschäden und Puffer Mismatches kann in un-interpretierbaren Daten zur Folge haben. Für viele Analyseverfahren wird implizit angenommen, daß die Probe monodispers ist, eine Anforderung, die oft schwierig in der Praxis zu erhalten. In vielen Fällen ist der Abbau der Probe fein und nicht in den Daten auf ihren eigenen erfasst werden kann, und jeder Versuch, die Daten liefert ungenaue oder sogar irreführende Ergebnisse zu interpretieren. Um diese Hindernisse zu überwinden, die Kombination von Grßenausschlußchromatographie (SEC) und SAXS wurde auf vielen Strahlrohren umgesetzt Datenqualität gewährleisten und diese Technik zugänglicher zu machen für immer schwieriger Proben 6-11. Vor kurzem haben wir eine neue Methode, um das Repertoire durch die Entwicklung von Online-IonenaustauschChromatographie (IEC) -gekoppelten SAXS 12. Beide Techniken eröffnen SAXS auf ein breites Spektrum von biologischen Partikeln früher unmöglich zu analysieren. Die Wahl, welche Methode zu verwenden, hängt von den biophysikalischen Eigenschaften der Partikel von Interesse. SEC trennt Makromoleküle durch ihre Größe, wodurch mindestens ein 10% iger Unterschied in der scheinbaren molekularen Masse wird für die Trennung benötigt wird. Physikalischen Grenzen der Säule und physiologischen Eigenschaften der Proben, wie hydrophobe Oberflächen, Flexibilität und fehlender Stabilität, komplizieren auch die Datenerfassung, Analyse und Interpretation. Ionenaustauschchromatographie, die Moleküle basierend auf ihrer Ladung und somit ihre Bindungsaffinität an die IEC-Säule kann trennt, verwendet werden, anstelle von oder zusätzlich zu SEC. Die Gesamtladung kann leicht durch Änderung des pH manipuliert werden, oder durch Variieren der Salzkonzentration des Puffers, ein relativ einfaches Verfahren zur kontrollierten Bereitstellung elution der Moleküle aus der IEC-Säule. Durch die Ladung unter Verwendung der Trennung von ähnlichen Arten und Größen von Molekülen, die sonst schwer zu trennen, kann routinemäßig mit IEC durchgeführt werden. Darüber hinaus hat IEC den Vorteil, mit verdünnten Proben umgehen zu können, so dass man die Konzentration Schritte zu vermeiden, die das potenzielle Risiko der Denaturierung des Proteins führen. Leider, wie die Ladungsverteilung äußerst Probe abhängig ist, erfordert IEC Optimierung hinsichtlich der pH - Wert und die Salzkonzentrationen 13,14. Für viele Proteine, die schwierig zu exprimieren sind, zu reinigen, oder beide, nur geringe Probenmengen zur Verfügung zu studieren. Es ist wichtig, effizient zu sein und die Anzahl der Reinigungsschritte und somit die Verluste zu minimieren. Aus diesem Grund ist der letzte Reinigungsschritt direkt online vor SAXS Datenerfassung, um die Wahrscheinlichkeit der Erfassung einer guten Datensatzes zu erhöhen. Hier, Die wir online SEC-SAXS und IEC-SAXS präsentieren und zu vergleichen. Beide Techniken wurden auf der BioSAXS - Strahlrohr BM29 an der European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) in Grenoble, Frankreich 15 umgesetzt. Als Testfall verwendeten wir das D5N und Helicase-Domäne des Proteins Vacciniavirus D5, die ziemlich schwierig war strukturell mit anderen Verfahren zu analysieren. Das Vaccinia-Virus ist ein Mitglied der Poxviridae Familie und ist zu 98% identisch mit der Variola-Virus, die Ursache der Pocken. Mit dem Vaccinia-System untersuchen wir die Replikationsmaschinerie, die sich hier auf das Wesentliche Helikase-Primase D5. D5 ist ein 95-kDa - Protein mit einem N-terminalen archeo-eukaryotische Primase (AEP) Bereich 16 durch einen Cystein - Cluster - Region gefolgt (res. 240-345) 16. Weiter in Richtung des C-Terminus kommt eine D5N Domain (Res. 340-460), die immer mit D5-Typ - Helikasen zugeordnet ist, und schließlich ein -Superfamilie 3 (SF3) Helicase - Domäne (Res. 460-785) 17 (Figure 1A). Die Helikasedomäne D5 baut einen hexameren Ringstruktur, die für die enge Bindung an DNA benötigt wird. Dank der jüngsten SAXS und EM - Studien, die niedrig auflösenden Strukturen des Primase und die Helikase - Domänen sind jetzt 18 bekannt. Hier zeigen wir, wie die implementierten Online-Chromatographie-Techniken auf dem BioSAXS-Strahlrohr zu verwenden BM29 bei ESRF Erkenntnisse zu gewinnen in die Struktur des C-terminalen Fragment (Rest 323-785) von D5.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4 dithiothreitol [DTT]</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gel</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>4561033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Phusion Flash PCR Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>F 548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetic acid glacial</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>20104.298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose D-5</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>LF45130653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra -15 Centrifugal filters Ultracel -30K</td>
			<td>Millipore Ltd</td>
			<td>UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0400-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Novagene</td>
			<td>70750-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue&#160;</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>8122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete protease inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11231400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Pac 10 DG Desalting column</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>732-2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>24388.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-6405-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HindIII</td>
			<td>Roche</td>
			<td>656313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisSelect HF Nickel Affinity Gel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>20252.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>AppliChem Panreac</td>
			<td>A1073,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth Miller</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>L3152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc.</td>
			<td>191421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>27808.297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>ER0571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>C6010-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pProEx HTb vector&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>10711018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer</td>
			<td>&#160;Eurofins mwg operon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel extraction kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification kid</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>75746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 6 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5172-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA gel stain</td>
			<td>Invitrogen life technology</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 ligase</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>home made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOP 10</td>
			<td>Invitrogen life technology</td>
			<td>C404003&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uno Q 1R column&#160;</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>720 0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>MPBiomedicals, LLC</td>
			<td>194834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beamline control software BsXCuBE</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camserver software</td>
			<td>Dectris</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>detector control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAMAVER</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>program to align ab initio models&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAMMIF</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>ab initio&#160; model reconstruction programm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC program Biologic Duo Flow</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC program LabSolutions</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPyB</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85.</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMUS</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>program, which performs the manipulation with experimental SAXS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyMOL</td>
			<td>DeLano Scientific LLC</td>
			<td>https://www.pymol.org/</td>
			<td>software for visualization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPCOMB</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>program to superimpose 3D structures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLogic Duo Flow</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLogic Biofrac Fraction collector</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC system</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labsonic P</td>
			<td>Sartorius Stedim biotech</td>
			<td>BBI8535108</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

online size-exclusion and ion-exchange chromatography on a saxs beamline

Biologische Kleinwinkel-Röntgenstreuung (BioSAXS) ist eine leistungsfähige Technik, die in der Molekular- und Strukturbiologie verwendet, um Lösungsstruktur, Teilchengröße und Form und Oberfläche-zu-Volumen-Verhältnis von Makromolekülen zu bestimmen. Die Technik ist auf eine sehr breite Vielfalt von Bedingungen Lösung einen breiten Bereich von Konzentrationen, pH - Werte, Ionenstärken Spanning, Temperaturen, Zusätze, etc., aber die Probe erforderlich ist , monodisperse sein. Diese Einschränkung führte zur Durchführung der Flüssigkeitschromatographie-Systeme auf SAXS Strahlrohre. Hier beschreiben wir die stromaufwärtige Integration der Größenausschluss (SEC) und Ionenaustauschchromatographie (IEC) an einem Beamline, verschiedene Methoden zur optimalen Hintergrundsubtraktion und Datenreduktion. Als Beispiel beschreiben wir, wie wir sec- und IEC-SAXS auf einem Fragment des Vaccinia-Virus essentiellen Protein D5 verwenden, bestehend aus einem D5N Helicase-Domäne. Wir bestimmen seine Gesamtform und Molekulargewicht, die hexameren Struktur th zeigte Protein.

Die Ergebnisse des modellfreien invariant Analyse sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die Analyse der D5 323-785 SEC-SAXS - Daten mit einer Molekularmasse Schätzung zeigte (aus einer Analyse Porod) von 345 kDa im Vergleich zu 338 kDa beobachtet IEC-SAXS verwenden. Beide sind in Übereinstimmung mit dem erwarteten Masse von 6 mal 53,5 kDa (321 kDa) für ein Hexamer. (: Χ 2 = 0,88, IEC-SAXS: SEC-SAXS χ 2 = 3,1) Die ab initio Modellierung beider Datensätze wurde ohne auferlegten Symmetrie unternommen und unter Verwendung von C6 Symmetrie (SEC-SAXS: χ 2 = 1,0, IEC-SAXS : χ 2 = 4). Da die Gesamt Anpassungen an die Streudaten für beide Rekonstruktionen in beiden Fällen vergleichbar sind (1D und E) können C6 Symmetrie angenommen werden. Somit entspricht das Modell zu einer hexagonalen kegelförmige Struktur mit einem zentralen Kanal, der teilweise versperrten (SEC scheint: 1F; IEC: <strOng&gt; 1G, Overlay Abbildung 1H). Eine Prüfung der einzelnen Modelle vor der Mittelung zeigt, dass dieses Hindernis wahrscheinlich ein Artefakt des Mittelungsprozesses. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54861/54861fig1x.jpg" /> Abbildung 1: SAXS Datenanalyse und der Vergleich von D5 323 -785 (Figur aus References angepaßt 12 und 18). A) Schematische Domänenstruktur von D5 Protein und D5 323-785. B) Offline Ionenaustausch - Chromatogramm mit der Angabe der drei Spitzen. Orange Kurve: Die Absorption bei 280 nm (au), blaue Kurve: Anzahl von Puffer B Prozentuale Anteile der Puffer B an den Spitzen sind angegeben. C) Online - Ionenaustausch - Chromatogramm. Farbschlüssel wie in B. Zusätzlich wird die gemessene Intensität wird in grün angezeigt. Die experimentelle Streukurve einnd berechnete Kurve des Modells erhalten durch SEC-SAXS D) und IEC E) Datenanalyse von D5 323-785. F) Bead Modell D5 323-785 basierend auf dem SEC - Daten und G) IEC - Daten. H) Overlay der SEC und dem IEC - Modelle. Die Platten in F) bis H) wurden unter Verwendung eines molekularen Visualisierungssoftware 24 angelegt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54861/54861fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54861/54861fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Datenerfassungsparameter </td><td></td></tr><tr><td> Instrument: </td><td> ESRF BM29 </td></tr><tr><td> Wellenlänge (Å) </td><td> 0,99 </td></tr><tr><td> q-Bereich (Å -1) </td><td> ,0032-,49 </td></tr><tr><td> Probe-Detektor-Abstand </td><td> 2.864 m </td></tr><tr><td> Die Belichtungszeit (sec) </td><td> 1 pro Rahmen </td></tr><tr><td> Konzentrationsbereich </td><td> n / a </td></tr><tr><td> Temperatur (K) </td><td> 293 </td></tr><tr><td> Detektor </td><td> Pilatus 1M (Dectris) </td></tr><tr><td> Flux (Photonen / s) </td><td> 1 × 10 12 </td></tr><tr><td> Strahlgröße (&amp; mgr; m 2) </td><td> 700 × 700 </td></tr><tr><td> Strukturparameter für D5 323-785, SEC </td><td></td></tr><tr><td> I 0 (cm -1) [von Guinier] </td><td> 0,0237 </td></tr><tr><td> Rg (Å) [von Guinier] </td><td> 48 </td></tr><tr><td> q min R g - q g max R für Guinier verwendet </td><td> 0,77-1,24 </td></tr><tr><td> D max (Å) [von p (r)] </td><td> 145 </td></tr><tr><td> q-Bereich verwendet , für p (r) (Å -1)</td><td> 0,02-0,17 </td></tr><tr><td> Porod Volumen V p (A 3) [von Scatter] </td><td> (570 ± 5) × 10 3 </td></tr><tr><td> Molekularmasse M r (kDa) [von V p] </td><td> 345 </td></tr><tr><td> Berechnete monomeren Herr von Sequenz (kDa) </td><td> 321 </td></tr><tr><td> Strukturparameter für D5 323-785, IEC </td><td></td></tr><tr><td> I 0 (cm -1) [von Guinier] </td><td> 0,386 </td></tr><tr><td> Rg (Å) [von Guinier] </td><td> 46,5 ± 0,1 </td></tr><tr><td> q min R g - q g max R für Guinier verwendet </td><td> 0,44-1,29 </td></tr><tr><td> D max (Å) [von p (r)] </td><td> 120 </td></tr><tr><td> q-Bereich verwendet , für p (r) (Å -1) </td><td> 0,03-0,18 </td></tr><tr><td> Porod Volumen V p (&amp; #197; 3) [von Scatter] </td><td> (577 ± 5) × 10 3 </td></tr><tr><td> Molekularmasse M r (kDa) [von V p] </td><td> 339 </td></tr><tr><td> Berechnete hexameren Herr von Sequenz (kDa) </td><td> 321 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: SAXS Datenparameter. Die Tabelle fasst die Parameter der SAXS Datenerfassung und Analyse.

Watch this Scientific Journal Video about Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline at JoVE.com

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

Die Bestimmung der Lösungsstruktur eines Proteins durch Kleinwinkelröntgenstreuung (SAXS) erfordert monodisperse Proben. Hier stellen wir zwei Möglichkeiten minimalen Verzögerungen zwischen der Probenvorbereitung und Datenerfassung zu gewährleisten: Online-Größenausschluss-Chromatographie (SEC) und Online-Ionenaustauschchromatographie (IEC).

Online Größenausschluss und Ionenaustausch-Chromatographie auf einem SAXS Strahlrohr

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Forschung

Biochemie

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Eine einfache Methode zur chemischen Hochdurchsatz-Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Proteinverdauung, Ultrafiltration und Größe Ausgrenzung Chromatographie, die Isolation der Exosomen aus menschlichem Blutplasma und Serum zu optimieren

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

Ionenaustausch-Chromatographie (IEX) gekoppelt an Multiwinkel Lichtstreuung (MALS) für Protein Trennung und Charakterisierung

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Charakterisierung von Proteinen durch Größen-Ausschluss-Chromatographie gekoppelt an Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Zellkultur auf Siliziumnitridmembranen und Kryovorbereitung für Synchrotron-Röntgenfluoreszenz Nano-Analyse

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Ungezielte Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-basierte Metabolomik-Analyse von Weizengetreide

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

Analyse von SEC-SAXS-Daten über EFA-Dekonvolution und Streuung

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Semi-quantitative Analyse von Peptidoglycan mittels Flüssigkeitschromatographie, Massenspektrometrie und Bioinformatik

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Eine Probenvorbereitungspipeline für Mikrokristalle an der VMXm-Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...