Name: online size-exclusion and ion-exchange chromatography on a saxs beamline
Uploaded: 2017-01-05T12:30:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline at JoVE.com

We acknowledge financial support for the project from the French grant REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 and by research grants from the Service de Sant&#233; des Arm&#233;es and the D&#233;l&#233;gation G&#233;n&#233;rale pour l'Armement. We are thankful to the ESRF for the SAXS beam time. We thank Andrew McCarthy, Gordon Leonard, Wim Burmeister, and Guy Schoehn for financial and scientific support.

<ol>
	<li>Graewert, M. A., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+and+progress+in+small+and+wide+angle+X-ray+scattering+(SAXS+and+WAXS).">Impact and progress in small and wide angle X-ray scattering (SAXS and WAXS).</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 23, 748-754 (2013).</li><li>Jacques, D. A., Trewhella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-angle+scattering+for+structural+biology-Expanding+the+frontier+while+avoiding+the+pitfalls.">Small-angle scattering for structural biology-Expanding the frontier while avoiding the pitfalls.</a> Protein Sci. 19, 642-657 (2010).</li><li>Kikhney, A. G., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+small+angle+X-ray+scattering+(SAXS)+of+flexible+and+intrinsically+disordered+proteins.">A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins.</a> FEBS Lett. 589, 2570-2577 (2015).</li><li>Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+solution+scattering+(SAXS)+combined+with+crystallography+and+computation:+defining+accurate+macromolecular+structures,+conformations+and+assemblies+in+solution.">X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution.</a> Q. Rev. Biophys. 40, 191-285 (2007).</li><li>Vestergaard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+biostructural+changes,+dynamics,+and+interactions+-+Small-angle+X-ray+scattering+to+the+rescue.">Analysis of biostructural changes, dynamics, and interactions - Small-angle X-ray scattering to the rescue.</a> Arch. Biochem. Biophys. , (2016).</li><li>David, G., P&#233;rez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+sampler+robot+and+high-performance+liquid+chromatography:+a+fully+automated+system+for+biological+small-angle+X-ray+scattering+experiments+at+the+Synchrotron+SOLEIL+SWING+beamline.">Combined sampler robot and high-performance liquid chromatography: a fully automated system for biological small-angle X-ray scattering experiments at the Synchrotron SOLEIL SWING beamline.</a> J. Appl. Crystallogr. 42, 892-900 (2009).</li><li>Graewert, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Pipeline+for+Purification,+Biophysical+and+X-Ray+Analysis+of+Biomacromolecular+Solutions.">Automated Pipeline for Purification, Biophysical and X-Ray Analysis of Biomacromolecular Solutions.</a> Sci. Rep. 5, (2015).</li><li>Lambright, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+techniques+enhance+the+quality+and+scope+of+information+obtained+from+SAXS.">Complementary techniques enhance the quality and scope of information obtained from SAXS.</a> ACA Trans. , 1-12 (2013).</li><li>Mathew, E., Mirza, A., Menhart, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-chromatography-coupled+SAXS+for+accurate+sizing+of+aggregating+proteins.">Liquid-chromatography-coupled SAXS for accurate sizing of aggregating proteins.</a> J. Synchrotron Radiat. 11, 314-318 (2004).</li><li>Round, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+GH3.+12+protein+conformation+through+HPLC-integrated+SAXS+measurements+combined+with+X-ray+crystallography.">Determination of the GH3. 12 protein conformation through HPLC-integrated SAXS measurements combined with X-ray crystallography.</a> Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 69, 2072-2080 (2013).</li><li>Watanabe, Y., Inoko, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-exclusion+chromatography+combined+with+small-angle+X-ray+scattering+optics.">Size-exclusion chromatography combined with small-angle X-ray scattering optics.</a> J. Chromatogr. 1216, 7461-7465 (2009).</li><li>Hutin, S., Brennich, M. E., Maillot, B., Round, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+ion-exchange+chromatography+for+small+angle+X-ray+scattering.">Online ion-exchange chromatography for small angle X-ray scattering.</a> Acta Cryst. , (2016).</li><li>Selkirk, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion-exchange+chromatography.">Ion-exchange chromatography.</a> Protein Purification Protocols. , 125-131 (2004).</li><li>Yigzaw, Y., Hinckley, P., Hewig, A., Vedantham, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+exchange+chromatography+of+proteins+and+clearance+of+aggregates.">Ion exchange chromatography of proteins and clearance of aggregates.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 10, 421-426 (2009).</li><li>Pernot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upgraded+ESRF+BM29+beamline+for+SAXS+on+macromolecules+in+solution.">Upgraded ESRF BM29 beamline for SAXS on macromolecules in solution.</a> J. Synchrotron Radiat. 20, 660-664 (2013).</li><li>Iyer, L. M., Koonin, E. V., Leipe, D. D., Aravind, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+evolution+of+the+archaeo-eukaryotic+primase+superfamily+and+related+palm-domain+proteins:+structural+insights+and+new+members.">Origin and evolution of the archaeo-eukaryotic primase superfamily and related palm-domain proteins: structural insights and new members.</a> Nucleic Acids Res. 33, 3875-3896 (2005).</li><li>Singleton, M. R., Dillingham, M. S., Wigley, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+helicases+and+nucleic+acid+translocases.">Structure and mechanism of helicases and nucleic acid translocases.</a> Annu. Rev. Biochem. 76, 23-50 (2007).</li><li>Hutin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+organization+of+vaccinia+virus+helicase-primase+D5.">Domain organization of vaccinia virus helicase-primase D5.</a> J. Virol. , 4604-4613 (2016).</li><li>Round, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioSAXS+Sample+Changer:+a+robotic+sample+changer+for+rapid+and+reliable+high-throughput+X-ray+solution+scattering+experiments.">BioSAXS Sample Changer: a robotic sample changer for rapid and reliable high-throughput X-ray solution scattering experiments.</a> Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 71, 67-75 (2015).</li><li>De Maria Antolinos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISPyB+for+BioSAXS,+the+gateway+to+user+autonomy+in+solution+scattering+experiments.">ISPyB for BioSAXS, the gateway to user autonomy in solution scattering experiments.</a> Acta Crystallographica Section D. 71, 76-85 (2015).</li><li>Brennich, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+data+analysis+at+the+ESRF+bioSAXS+beamline,+BM29.">Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29.</a> J. Appl. Crystallogr. 49, (2016).</li><li>Petoukhov, M. V., Konarev, P. V., Kikhney, A. G., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATSAS+2.1-towards+automated+and+web-supported+small-angle+scattering+data+analysis.">ATSAS 2.1-towards automated and web-supported small-angle scattering data analysis.</a> J. Appl. Crystallogr. 40, 223-228 (2007).</li><li>Franke, D., Jeffries, C. M., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+Map,+a+goodness-of-fit+test+for+one-dimensional+X-ray+scattering+spectra.">Correlation Map, a goodness-of-fit test for one-dimensional X-ray scattering spectra.</a> Nat. Methods. 12, 419-422 (2015).</li><li>Schrodinger, LLC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8. , (2015).</li><li>Jensen, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+SAXS+measurements+facilitated+by+online+HPLC+buffer+exchange.">Time-resolved SAXS measurements facilitated by online HPLC buffer exchange.</a> J. Synchrotron Radiat. 17, 769-773 (2010).</li><li>Hynson, R. M., Duff, A. P., Kirby, N., Mudie, S., Lee, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ultracentrifugation+coupled+to+small-angle+X-ray+scattering+on+macromolecular+complexes.">Differential ultracentrifugation coupled to small-angle X-ray scattering on macromolecular complexes.</a> J. Appl. Crystallogr. 48, 769-775 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

לקבלת מקרומולקולות רבות, צעד טיהור סופי באמצעות כרומטוגרפיה נדרש לפני איסוף נתוני SAXS להשיג ערכת נתונים באיכות טובה. עם זאת, לא כל הדגימות להישאר יציבות; הם עשויים להיות מועדים צבירה או מחדש איזון כדי תערובת של מדינות oligomerization. לכן, צעד טיהור באינטרנט סופי על beamline נדרש לצמצם את הזמן בין הטיהור ואיסוף נתונים על מנת לקבל את נתוני SAXS הטוב ביותר באיכות. בהתאם מאפייני biophysical של החלבון של עניין, SEC-SAXS או IEC-SAXS יכול להיבחר להשיג איכות המדגם אופטימלי. כאן, על מבנה חלבון נגזר helicase / primase D5, שתי הטכניקות מוסברות דנו. רכישת נתוני SEC-SAXS אהיה יותר ויותר סטנדרטית נגישה beamlines BioSAXS רב. ניתוח נתונים, במיוחד רקע חיסור, הוא יחסית פשוט וקל. עם זאת, אות חיץ יציבהוההפרדה מספיק של מיני macromolecular נשארת חיונית. לכן, חשוב להזמין מספיק זמן כדי לאזן את העמודה ביסודיות. אי של שיטה זו יכולה להיות עקב מזהמים מתמשכים בסדר גודל דומה לחלבון של עניין, בריכוזים נמוכים, או מאגר רגיש-קרינה. בפועל, בתחילה, SEC-SAXS עשויה לשמש שיטת הבחירה של רוב הדגימות macromolecular. ובכל זאת, פרוטוקולי טיהור רבים דורשים צעד IEC לפני בשל נוכחותם של מזהמים או צבירה. בהינתן שכל צעד ריכוז כרומטוגרפיה קשור פסדים של מדגם (המוערך בכ 30-50%) וזמן, IEC-SAXS הישיר הוא יתרון. לקבלת דוגמיות כי לא יכול להיות מטוהרת על ידי ה- SEC, יהיה זה בשל נוכחותם של בגודל הדומה &quot;מזהמים&quot; או משום שהם המצרפי קשים בריכוזים הצורכים, IEC-SAXS תמיד יהיה הגישה הטובה יותר מתאימה. כמו כן, הספיקה הגבוהה נתמכתבעיני רבים עמודות IEC יכול לעזור להפחית את זמן המעבר בין טיהור ומדידה. בדוגמא המוצגת כאן, IEC שמש עם elution צעד, המאפשר הפרדה של הפסגות הקרובות של D5 323-785 מפני מזהמים בקפידה על ידי בחירת הצעדים ריכוז מלח. באופן עקרוני, את מספר הצעדים הוא בלתי מוגבל, אבל באופן מעשי, לפחות 1 צעד לכל שיא נדרש, ולא יותר מדי צריך להיבחר. לקבלת שיטת חיסור רקע המתוארת לעיל, חשוב לאמוד את מספר גבוה יחסי של יצירות חיץ שונות כדי למצוא את אחד התואם. חסרון משותף של שני הטכניקות הוא חוסר מידע ריכוז חלבון מדויק. בגלל זה, קביעת המסה המדויקת מבוסס על פיזור קדימה אינה אפשרית. עבור חלבונים כדוריים כגון D5 323-785, היקף Porod מספק אלטרנטיבה, אם כי הערכה מדויקת, המוני פחות, אבל עבור חלבונים גמישים או מופרעים מאודגישה, זה לא תהיה תקפה. וריאציה של שיטת IEC-SAXS שיפוע צעד חכם המוצגת כאן היא השימוש שיפוע ליניארית במקום. למרות זאת, ניתן לעבוד עם כצעדים רבים ככל רצוי לבודדים-פסגות תת באמצעות elution צעד חכם, בגישת השיפוע ליניארית, היא נדרשת כדי לייעל את תנאי השיפוע בקפידה על מנת להפריד בין הפסגות לחלוטין לפני תחילת SAXS לְנַסוֹת. רקע חיסור בגישה זו יכול להיעשות מסגרת-חכם יכול להיות מאומת על ידי ההשוואה של המסגרות הנפרדות, אבל זה דורש טיפול נתונים מתקדם יותר, וכן תוכנה ייעודית אינה קיימת עדיין. הבחירה של טור מתאים הוא קריטי עבור שתי הטכניקות, כפי שהוא קובע את הפרדת המינים macromolecular. גודל הדרת עמודות נבדלות קיבולת טעינה, בטווח הגודל של מקרומולקולות להפרדה, ופתרון, תוך עמודות חילוף יונים להשתנות מן הסוג ואת הצפיפותשל החיובים המשותקים שלהם. בעוד הפרוטוקול המובא כאן הוא ספציפי beamline ESRF BM29, הסתגלות לכל beamline SAXS השני הוא, באופן עקרוני, פשוט. הדרישות העיקריות הן שטף רנטגן גבוה מספיק וגלאי מתאים (רצוי פוטון יחידה-יד נטויה), לרכוש נתוני אות לרעש סבירים בטווח של שניות או פחות, ומערכת כרומטוגרפיה נוזלית מקוונת מסוגל לייצר הדרגתי. היישום המדויק היה, כמובן, תלוי בסביבת beamline המקומית. התוצאות שהתקבלו על D5 323-785 באמצעות שתי שיטות שונות במקצת. הרדיוס של הסתובבות הוא מעט קטן עבור נתוני IEC מאשר נתוני SEC, ואת והמינימום המקומי של עקומת הפיזור מועבר וקטורי פיזור מעט גדולים. משמעות הדבר היא כי D5 323-785 נמדד עם IEC-SAXS הוא מעט יותר קומפקטי מאשר D5 323-785 נמדד עם SEC-SAXS. זה עלול bדואר בשל הבדלי הכנת המדגם, בזמן בין הטיהור ומדידה (IEC הוא מהיר יותר), או, פחות סבירים, כדי מזהם במדגם המטוהר SEC. המודלים החרוזים שהושגו באופן עצמאי לחלוטין עם שני השיטות ניתן להשוואה (איור 1H). D5 323-785 מציג את המבנה החלול, hexameric הצפוי 18. לסיכום, חילופי יונים מקוונים כרומטוגרפיה בגודל הדרה באינטרנט שיטות טיהור ביוכימיים חשובים שיכולים להיות מצמידים ישירות SAXS 6,7,9-12,25,26. חיסור רקע נתוני IEC-SAXS הוא מעט יותר קשה ומעורפלת מאשר SEC-SAXS, אבל זה בכל זאת אפשרי. בהתאם מאפייני biophysical של החלבון של עניין, הן SEC ו- IEC-SAXS לאפשר אופטימיזציה של הפרדת מינים עם יתרונות גלומים. מתן שצעדי האימות (כמתואר) הם נצפו כראוי, את הנתונים המתקבלים שנינות ניתן לנתחאמון h, ומודלים ניתן לקבוע באמצעות הכלים הסטנדרטיים הזמינים בתוך הקהילה. יחד, הן טכניקות לאפשר הפרדה באינטרנט עבור מגוון רחב של מקרומולקולות ביולוגיות, מניב נתונים לא נגיש באמצעות מדידות סטטיות רגילות.

BioSAXS הוא כלי רב עוצמה כדי לקבוע את הצורה של אובייקטים בגודל ננו 1-4. הפיזור של קרני X על ידי תמיסה המכילה מולקולות, בגודל בטווח ננומטר, נרשם בזוויות מאוד נמוכה. מגוון זוויתי זה מכיל מידע על פרמטרים גלובליים: רדיוס הסתובבות; מרחק intraparticle הגדול; צורת החלקיקים; והמידה מתקפלים, denaturation, או הפרעה. הטכניקה אינה דורשת גבישים, ואת מקרומולקולה נשאר בתמיסה ובכך יכול להישמר בתנאים מחקו פרמטרים חשובים מסוימים של התא, כגון כוח יוני, pH ועוד ידע של גורמים אלה עשויים לסייע לקבוע, למשל, מדינת oligomeric הרלוונטית מבחינה הפיזיולוגית של חלבון של עניין או כדי לאמת את מודל מוצע של קומפלקס. האפיון של אינטראקציות בין חלבונים בתנאי חיץ שונים, יצירת מודלים של תחומים חסרים, העידון של מודלי הומולוגיה, ואת דהסיום המדינות מקופלות בדידות פרש יכול להתבצע במהירות ובקלות 5. כמו עם כל הטכניקה, יש BioSAXS חולשות פנימי: דגימות מצטברים או מפוגל, תערובות של חלקיקים, דגימות הטרוגניות, נזקי קרינה, ואת חוסר התאמה חיץ עלול לגרום להצגת נתונים בלתי וניתנת לפרשנות. עבור שיטות ניתוח רבות, ההנחה היא במרומז כי המדגם הוא monodisperse, דרישה כי היא לעתים קרובות קשה להשיג בפועל. במקרים רבים, את ההשפלה של המדגם הוא עדין ולא ניתן לאתר את הנתונים בפני עצמה, וכל ניסיון לפרש את הנתונים נותן תוצאות לא מדויקות או אפילו מטעה. כדי להתגבר על המכשולים הללו, השילוב של כרומטוגרפיה בגודל הדרה (SEC) ו SAXS יושם על beamlines רב על מנת להבטיח את איכות נתונים ולעשות את הטכניקה הזו לנגישה יותר עבור דגימות קשות יותר ויותר 6-11. לאחרונה, הוספנו שיטה חדשה לרפרטואר ידי פיתוח-חילוף יונים באינטרנטכרומטוגרפיה (IEC) -coupled 12 SAXS. טכניקות הן פותחות SAXS למגוון רחב של חלקיקים ביולוגיים לשעבר בלתי אפשרי לנתח. הבחירה של איזו שיטה להשתמש תלוי מאפייני biophysical של חלקיקים של עניין. SEC מפריד מקרומולקולות על ידי גודלם, לפיה לפחות הבדל של 10% מסה מולקולרית לכאורה דרוש ההפרדה. מגבלות פיזיות של הטור המאפיינים הפיזיולוגיים של דגימות, כמו משטחים הידרופובי, גמישות, וחוסר יציבות, גם לסבך איסוף נתונים, ניתוח, ופרשנות. יון-חילופי כרומטוגרפיה, המפריד מולקולות מבוססות על התשלום שלהם, ומכאן, הזיקה המחייבת שלהם לעמודת IEC, ניתן להשתמש במקום או בנוסף ל- SEC. המטען הכולל ניתן להשפיע בקלות על ידי שינוי ה- pH, או תשנה את ריכוז המלח של למאגר, מתן שיטה פשוטה יחסית עבור המבוקרת אלution של מולקולות מהעמודה IEC. באמצעות תשלום, הפרדת סוגים דומים וגדלים של מולקולות, אשר שאחרת קשה להפריד, ניתן לבצע באופן שגרתי עם חברת החשמל. בנוסף, IEC יש את היתרון של להיות מסוגל להתמודד עם דגימות מדוללות, המאפשר אחד כדי למנוע את צעדי הריכוז, אשר נושאים את הסיכון הפוטנציאלי של denaturing החלבון. למרבה הצער, כפי המטענים מאוד מדגם תלויים, IEC דורש אופטימיזציה לגבי pH ועל ריכוזי מלח 13,14. עבור חלבונים רבים שקשה לבטא, לטהר, או שניהם, רק בכמויות קטנות של מדגם זמינות ללמוד. חשוב להיות יעיל כדי למזער את מספר צעדי טיהור, ולכן ההפסדים. מסיבה זו, צעד הטיהור האחרון מחובר מוקדם אל רכישת נתוני SAXS, על מנת להגדיל את הסבירות של איסוף ערכת נתונים טובה. כאן, אנו מציגים ולהשוות SEC-SAXS ו- IEC-SAXS באינטרנט. שתי הטכניקות יושמו על beamline BioSAXS BM29 במתקן קרינה Synchrotron האירופי (ESRF) גרנובל, 15 בצרפת. כמקרה מבחן, השתמשנו תחום D5N ו helicase של החלבון וירוס vaccinia D5, שהיה די קשה לנתח בשיטות אחרות מבנית. הווירוס vaccinia הוא חבר של המשפחה Poxviridae והוא 98% זהה לנגיף אֲבַעבּוּעוֹת, הגורם אבעבועות קטנות. השימוש במערכת vaccinia, אנחנו לומדים את מכונות שכפול, התמקדות כאן על D5 helicase-primase חיוני. D5 הוא חלבון 95-kDa עם N-terminal Archeo-איקריוטיים primase (AEP) מושלם 16 ואחריו באזור אשכול ציסטאין (מיל. 240-345) 16. בהמשך לכיוון הסופית- C מגיע מושלם D5N (מיל. 340-460), אשר מזוהה תמיד עם helicases D5-סוג, ולבסוף superfamily 3 (SF3) תחום helicase (מיל. 460-785) 17 (Figurדואר 1A). תחום helicase של D5 בונה מבנה טבעת hexameric מה שדרוש חזק מחייב ל- DNA. בזכות מחקרי SAXS וא&quot;מ האחרונים, את המבנים ברזולוציה הנמוכה של primase ובתחומי helicase כיום ידועים 18. כאן, אנו מראים כיצד להשתמש בטכניקות כרומטוגרפיה באינטרנט מיושם על beamline BioSAXS BM29 בבית ESRF כדי לקבל תובנות לתוך המבנה של שבר בטרמינל C-(שאריות 323-785) של D5.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4 dithiothreitol [DTT]</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gel</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>4561033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Phusion Flash PCR Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>F 548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetic acid glacial</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>20104.298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose D-5</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>LF45130653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra -15 Centrifugal filters Ultracel -30K</td>
			<td>Millipore Ltd</td>
			<td>UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0400-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Novagene</td>
			<td>70750-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue&#160;</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>8122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete protease inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11231400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Pac 10 DG Desalting column</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>732-2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>24388.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-6405-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HindIII</td>
			<td>Roche</td>
			<td>656313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisSelect HF Nickel Affinity Gel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>20252.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>AppliChem Panreac</td>
			<td>A1073,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth Miller</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>L3152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc.</td>
			<td>191421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>27808.297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>ER0571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>C6010-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pProEx HTb vector&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>10711018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer</td>
			<td>&#160;Eurofins mwg operon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel extraction kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification kid</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>75746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 6 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5172-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA gel stain</td>
			<td>Invitrogen life technology</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 ligase</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>home made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOP 10</td>
			<td>Invitrogen life technology</td>
			<td>C404003&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uno Q 1R column&#160;</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>720 0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>MPBiomedicals, LLC</td>
			<td>194834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beamline control software BsXCuBE</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camserver software</td>
			<td>Dectris</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>detector control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAMAVER</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>program to align ab initio models&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAMMIF</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>ab initio&#160; model reconstruction programm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC program Biologic Duo Flow</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC program LabSolutions</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPyB</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85.</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMUS</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>program, which performs the manipulation with experimental SAXS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyMOL</td>
			<td>DeLano Scientific LLC</td>
			<td>https://www.pymol.org/</td>
			<td>software for visualization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPCOMB</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>program to superimpose 3D structures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLogic Duo Flow</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLogic Biofrac Fraction collector</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC system</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labsonic P</td>
			<td>Sartorius Stedim biotech</td>
			<td>BBI8535108</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

online size-exclusion and ion-exchange chromatography on a saxs beamline

רנטגן פיזור זווית קטנה ביולוגית (BioSAXS) היא טכניקה רבת עוצמה בביולוגיה מולקולרית מבניים המשמשים לקביעת מבנה פתרון, גודל החלקיקים וצורה, קרקע-נפח יחס של מקרומולקולות. הטכניקה ישימה מגוון מאוד רחב של מצבי פתרון פורשים מגוון רחב של ריכוזים, ערכי ה- pH, עוצמות יוניות, טמפרטורות, תוספות וכו &#39;, אבל המדגם הוא נדרש להיות monodisperse. אזהרה זו הובילה ליישום מערכות כרומטוגרפיה נוזלית על beamlines SAXS. כאן אנו מתארים את השילוב במעלה הזרם של הדרת גודל (SEC) ואת היון-חילופי כרומטוגרפיה (IEC) על beamline, שיטות שונות עבור חיסור רקע אופטימלי, והפחתת נתונים. כדוגמא, אנו מתארים כיצד אנו משתמשים SEC- ו- IEC-SAXS על שבר של D5 vaccinia וירוס החלבון החיוני, מורכב תחום helicase D5N. אנו קובעים צורה הכללית שלה ועל משקל מולקולרי, המתאר את מבנה hexameric של החלבון ה.

התוצאות של ניתוח משתנה ללא מודל מפורטים בטבלה 1. האנליזה של נתוני D5 323-785 SEC-SAXS הראתה הערכת מסה מולקולרית (מניתוח Porod) של 345 kDa לעומת 338 kDa, ציין באמצעות IEC-SAXS. שניהם תמימי דעים עם המוני צפוי של 6 פעמים 53.5 kDa (321 KDA) עבור hexamer. הדוגמנות מדעיקרא של שתי קבוצות הנתונים בוצע ללא סימטריה שהוטלו (SEC-SAXS: χ 2 = 0.88, IEC-SAXS: χ 2 = 3.1) ושימוש סימטריה C6 (SEC-SAXS: χ 2 = 1.0, IEC-SAXS : χ 2 = 4). כמו ההתקפים הכוללים את נתוני פיזור עבור השחזורים הם דומים בשני המקרים (האיור 1D ו- E), סימטרית C6 ניתן להניח. לפיכך, המודל המתאים למבנה חרוט דמוי משושה עם ערוץ מרכזי, המופיע חסום חלקית (SEC: איור 1F; IEC: <strאונג&gt; 1G איור, כיסוי איור 1H). בחינת דגמים בודדים לפני המיצוע מראה כי חסימה זו עשויה להיות פועל יוצא של תהליך המיצוע. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54861/54861fig1x.jpg" /> איור 1: ניתוח נתוני SAXS והשוואה של D5 323 -785 (איור מותאם הפניות 12 ו -18). א) מבנה תחום סכמטי של חלבון D5 ו D5 323-785. B) מנותק יון-חילופי הכרומתוגרמה עם ציון של שלוש פסגות. עקומת אורנג &#39;: ספיגה ב 280 ננומטר (au), עקומה כחולה: אחוז החיץ ב האחוזים של חיץ B על הפסגות מסומנות. C) chromatogram באינטרנט יון-חליפין. מפתח צבעים כמו ב בנוסף, עוצמת הנמדד הוא מסומנת בירוק. א העקומה הפיזור הניסיוןnd מחושב שהקו של המודל מתקבל על ידי ה- SEC-SAXS D) וחברת החשמל E) ניתוח נתונים של D5 323-785. F) מודל חרוז של D5 323-785 מבוסס על נתוני SEC ו- G) נתוני IEC. H) כיסוי של דגמי SEC וחברת החשמל. הפנלים ב F) ל H) נוצרו באמצעות תוכנה להדמיה מולקולרית 24. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54861/54861fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פרמטרי נתונים אוספים </td><td></td></tr><tr><td> כלי: </td><td> ESRF BM29 </td></tr><tr><td> אורך גל (א) </td><td> 0.99 </td></tr><tr><td> q-טווח (א -1) </td><td> 0,0032 - 0.49 </td></tr><tr><td> לדוגמא אל גלאי מרחק </td><td> 2.864 מ &#39; </td></tr><tr><td> זמן חשיפה (sec) </td><td> 1 לכל מסגרת </td></tr><tr><td> טווח הריכוז </td><td> נה </td></tr><tr><td> טמפרטורה (K) </td><td> 293 </td></tr><tr><td> גַלַאִי </td><td> פילאטוס 1M (Dectris) </td></tr><tr><td> Flux (פוטונים / s) </td><td> 1 × 10 12 </td></tr><tr><td> Beam גודל (מיקרומטר 2) </td><td> 700 × 700 </td></tr><tr><td> פרמטרים מבניים עבור D5 323-785, SEC </td><td></td></tr><tr><td> I 0 (-1 ס&quot;מ) [מן Guinier] </td><td> .0237 </td></tr><tr><td> Rg (א) [מן Guinier] </td><td> 48 </td></tr><tr><td> q דקות g R - q מקסימום R g המשמש Guinier </td><td> 0.77 - 1.24 </td></tr><tr><td> D מקס (א) [מ- p (r)] </td><td> 145 </td></tr><tr><td> q-טווח המשמש p (r) (א -1)</td><td> 0.02 - 0.17 </td></tr><tr><td> Porod נפח V p (א 3) [מן פיזור] </td><td> (570 ± 5) × 10 3 </td></tr><tr><td> R מסה M מולקולרית (KDA) [מ V p] </td><td> 345 </td></tr><tr><td> מחושב monomeric מר מתוך רצף (KDA) </td><td> 321 </td></tr><tr><td> פרמטרים מבניים עבור D5 323-785, IEC </td><td></td></tr><tr><td> I 0 (-1 ס&quot;מ) [מן Guinier] </td><td> .386 </td></tr><tr><td> Rg (א) [מן Guinier] </td><td> 46.5 ± 0.1 </td></tr><tr><td> q דקות g R - q מקסימום R g המשמש Guinier </td><td> 0.44 - 1.29 </td></tr><tr><td> D מקס (א) [מ- p (r)] </td><td> 120 </td></tr><tr><td> q-טווח המשמש p (r) (א -1) </td><td> 0.03 - 0.18 </td></tr><tr><td> נפח V p Porod (&amp; #197; 3) [מן הפיזור] </td><td> (577 ± 5) × 10 3 </td></tr><tr><td> R מסה M מולקולרית (KDA) [מ V p] </td><td> 339 </td></tr><tr><td> מחושב hexameric מר מתוך רצף (KDA) </td><td> 321 </td></tr></tbody></table> טבלה 1: פרמטרי נתוני SAXS. הטבלה מסכמת את הפרמטרים של רכישת נתונים SAXS וניתוח.

Watch this Scientific Journal Video about Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline at JoVE.com

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

קביעת מבנה פתרון של חלבון על ידי פיזור קטן זווית קרני רנטגן (SAXS) דורש דגימות monodisperse. כאן, אנו מציגים שתי אפשרויות על מנת להבטיח עיכובים מינימאליים בין הכנת מדגם ורכישת נתונים: כרומטוגרפיה בגודל הדרה מקוון (SEC) כרומטוגרפיה היון-Exchange Online (IEC).

גודל הדרה מקוונת ו כרומטוגרפיה יון-חליפין על beamline SAXS

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

שיטה פשוטה להקרנה כימי תפוקה גבוהה ב Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

עיכול חלבון אולטראפילטרציה, גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה כדי למטב את ניתוקה של Exosomes פלזמה דם אנושי, סרום

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

יונים כרומטוגרפיה (IEX) מצמידים מרובה זווית פיזור אור (MALS) עבור חלבון הפרדה ואפיון

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

אפיון של חלבונים לפי גודל כרומטוגרפיה הדרה מצמידים לפיזור אור רב זווית (SEC-דוליטל)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

תרבות התא על ממברנות הסיליקון נידהר וקריופיקציה עבור סינכרוטרון X-ray פלואורסצנטית ננו-ניתוח

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

בדיקות מבוססות-כרומטוגרפיה של נוזלים מבוססי-המסה של טבולומיקס חיטה

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

ניתוח נתוני SEC-SAXS באמצעות פירוק ופיזור EFA

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

ניתוח כמותי למחצה של פפטידוגליקן על ידי כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית מסה וביואינפורמטיקה

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

צינור הכנה לדוגמה עבור מיקרוקריסטלים בקו הקרן VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...