Name: online size-exclusion and ion-exchange chromatography on a saxs beamline
Uploaded: 2017-01-05T12:30:00
Duration: 11 min 9 s
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We acknowledge financial support for the project from the French grant REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 and by research grants from the Service de Sant&#233; des Arm&#233;es and the D&#233;l&#233;gation G&#233;n&#233;rale pour l'Armement. We are thankful to the ESRF for the SAXS beam time. We thank Andrew McCarthy, Gordon Leonard, Wim Burmeister, and Guy Schoehn for financial and scientific support.

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	<li>Graewert, M. A., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+and+progress+in+small+and+wide+angle+X-ray+scattering+(SAXS+and+WAXS).">Impact and progress in small and wide angle X-ray scattering (SAXS and WAXS).</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 23, 748-754 (2013).</li><li>Jacques, D. A., Trewhella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-angle+scattering+for+structural+biology-Expanding+the+frontier+while+avoiding+the+pitfalls.">Small-angle scattering for structural biology-Expanding the frontier while avoiding the pitfalls.</a> Protein Sci. 19, 642-657 (2010).</li><li>Kikhney, A. G., Svergun, D. 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Biophys. 40, 191-285 (2007).</li><li>Vestergaard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+biostructural+changes,+dynamics,+and+interactions+-+Small-angle+X-ray+scattering+to+the+rescue.">Analysis of biostructural changes, dynamics, and interactions - Small-angle X-ray scattering to the rescue.</a> Arch. Biochem. Biophys. , (2016).</li><li>David, G., P&#233;rez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+sampler+robot+and+high-performance+liquid+chromatography:+a+fully+automated+system+for+biological+small-angle+X-ray+scattering+experiments+at+the+Synchrotron+SOLEIL+SWING+beamline.">Combined sampler robot and high-performance liquid chromatography: a fully automated system for biological small-angle X-ray scattering experiments at the Synchrotron SOLEIL SWING beamline.</a> J. Appl. Crystallogr. 42, 892-900 (2009).</li><li>Graewert, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Pipeline+for+Purification,+Biophysical+and+X-Ray+Analysis+of+Biomacromolecular+Solutions.">Automated Pipeline for Purification, Biophysical and X-Ray Analysis of Biomacromolecular Solutions.</a> Sci. Rep. 5, (2015).</li><li>Lambright, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+techniques+enhance+the+quality+and+scope+of+information+obtained+from+SAXS.">Complementary techniques enhance the quality and scope of information obtained from SAXS.</a> ACA Trans. , 1-12 (2013).</li><li>Mathew, E., Mirza, A., Menhart, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-chromatography-coupled+SAXS+for+accurate+sizing+of+aggregating+proteins.">Liquid-chromatography-coupled SAXS for accurate sizing of aggregating proteins.</a> J. Synchrotron Radiat. 11, 314-318 (2004).</li><li>Round, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+GH3.+12+protein+conformation+through+HPLC-integrated+SAXS+measurements+combined+with+X-ray+crystallography.">Determination of the GH3. 12 protein conformation through HPLC-integrated SAXS measurements combined with X-ray crystallography.</a> Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 69, 2072-2080 (2013).</li><li>Watanabe, Y., Inoko, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-exclusion+chromatography+combined+with+small-angle+X-ray+scattering+optics.">Size-exclusion chromatography combined with small-angle X-ray scattering optics.</a> J. Chromatogr. 1216, 7461-7465 (2009).</li><li>Hutin, S., Brennich, M. E., Maillot, B., Round, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+ion-exchange+chromatography+for+small+angle+X-ray+scattering.">Online ion-exchange chromatography for small angle X-ray scattering.</a> Acta Cryst. , (2016).</li><li>Selkirk, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion-exchange+chromatography.">Ion-exchange chromatography.</a> Protein Purification Protocols. , 125-131 (2004).</li><li>Yigzaw, Y., Hinckley, P., Hewig, A., Vedantham, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+exchange+chromatography+of+proteins+and+clearance+of+aggregates.">Ion exchange chromatography of proteins and clearance of aggregates.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 10, 421-426 (2009).</li><li>Pernot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upgraded+ESRF+BM29+beamline+for+SAXS+on+macromolecules+in+solution.">Upgraded ESRF BM29 beamline for SAXS on macromolecules in solution.</a> J. Synchrotron Radiat. 20, 660-664 (2013).</li><li>Iyer, L. M., Koonin, E. V., Leipe, D. D., Aravind, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+evolution+of+the+archaeo-eukaryotic+primase+superfamily+and+related+palm-domain+proteins:+structural+insights+and+new+members.">Origin and evolution of the archaeo-eukaryotic primase superfamily and related palm-domain proteins: structural insights and new members.</a> Nucleic Acids Res. 33, 3875-3896 (2005).</li><li>Singleton, M. R., Dillingham, M. S., Wigley, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+helicases+and+nucleic+acid+translocases.">Structure and mechanism of helicases and nucleic acid translocases.</a> Annu. Rev. Biochem. 76, 23-50 (2007).</li><li>Hutin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+organization+of+vaccinia+virus+helicase-primase+D5.">Domain organization of vaccinia virus helicase-primase D5.</a> J. Virol. , 4604-4613 (2016).</li><li>Round, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioSAXS+Sample+Changer:+a+robotic+sample+changer+for+rapid+and+reliable+high-throughput+X-ray+solution+scattering+experiments.">BioSAXS Sample Changer: a robotic sample changer for rapid and reliable high-throughput X-ray solution scattering experiments.</a> Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 71, 67-75 (2015).</li><li>De Maria Antolinos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISPyB+for+BioSAXS,+the+gateway+to+user+autonomy+in+solution+scattering+experiments.">ISPyB for BioSAXS, the gateway to user autonomy in solution scattering experiments.</a> Acta Crystallographica Section D. 71, 76-85 (2015).</li><li>Brennich, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+data+analysis+at+the+ESRF+bioSAXS+beamline,+BM29.">Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29.</a> J. Appl. Crystallogr. 49, (2016).</li><li>Petoukhov, M. V., Konarev, P. V., Kikhney, A. G., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATSAS+2.1-towards+automated+and+web-supported+small-angle+scattering+data+analysis.">ATSAS 2.1-towards automated and web-supported small-angle scattering data analysis.</a> J. Appl. Crystallogr. 40, 223-228 (2007).</li><li>Franke, D., Jeffries, C. M., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+Map,+a+goodness-of-fit+test+for+one-dimensional+X-ray+scattering+spectra.">Correlation Map, a goodness-of-fit test for one-dimensional X-ray scattering spectra.</a> Nat. Methods. 12, 419-422 (2015).</li><li>Schrodinger, LLC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8. , (2015).</li><li>Jensen, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+SAXS+measurements+facilitated+by+online+HPLC+buffer+exchange.">Time-resolved SAXS measurements facilitated by online HPLC buffer exchange.</a> J. Synchrotron Radiat. 17, 769-773 (2010).</li><li>Hynson, R. M., Duff, A. P., Kirby, N., Mudie, S., Lee, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ultracentrifugation+coupled+to+small-angle+X-ray+scattering+on+macromolecular+complexes.">Differential ultracentrifugation coupled to small-angle X-ray scattering on macromolecular complexes.</a> J. Appl. Crystallogr. 48, 769-775 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

कई बड़े अणुओं के लिए, एक अंतिम शुद्धि क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कदम के लिए एक अच्छी गुणवत्ता डेटा सेट प्राप्त करने के लिए SAXS डेटा संग्रह करने से पहले आवश्यक है। हालांकि, सभी नमूने स्थिर रहते हैं; वे oligomerization राज्यों का एक मिश्रण करने के लिए एकत्रीकरण या फिर से संतुलन के लिए खतरा हो सकता है। इसलिए, beamline पर अंतिम ऑनलाइन शुद्धि कदम क्रम में सबसे अच्छा गुणवत्ता SAXS डेटा प्राप्त करने के लिए शुद्धि और डेटा संग्रह के बीच के समय को कम करने के लिए आवश्यक है। ब्याज की प्रोटीन की biophysical गुणों पर निर्भर करता है, एसईसी-SAXS या आईईसी SAXS इष्टतम नमूना गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए चुना जा सकता है। इधर, एक प्रोटीन का निर्माण helicase / primase D5 से निकाली गई पर, दोनों तकनीकों के बारे में बताया और चर्चा कर रहे हैं। एसईसी-SAXS डेटा के अधिग्रहण के लिए अधिक से अधिक मानकीकृत बनने और कई BioSAXS beamlines पर उपलब्ध है। डेटा विश्लेषण, विशेष रूप से पृष्ठभूमि घटाव, अपेक्षाकृत सरल और आसान है। हालांकि, एक स्थिर बफर संकेतऔर macromolecular प्रजातियों की पर्याप्त जुदाई आवश्यक रहता है। इसलिए, यह कॉलम अच्छी तरह से संतुलित करने के लिए पर्याप्त समय आरक्षित करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस विधि की विफलता ब्याज, कम सांद्रता, और विकिरण के प्रति संवेदनशील buffers की प्रोटीन के समान आकार की लगातार contaminants के कारण हो सकता है। अभ्यास में, शुरू में, एसईसी-SAXS सबसे macromolecular नमूने के लिए पसंद की विधि के रूप में इस्तेमाल किए जाने की संभावना है। फिर भी, कई शुद्धि प्रोटोकॉल एक पूर्व आईईसी contaminants या एकत्रीकरण की उपस्थिति के कारण कदम की आवश्यकता है। यह देखते हुए कि प्रत्येक एकाग्रता और क्रोमैटोग्राफी कदम नमूना (30-50% का अनुमान) और समय की हानि के साथ जुड़ा हुआ है, प्रत्यक्ष आईईसी SAXS फायदेमंद है। नमूने है कि एसईसी द्वारा शुद्ध नहीं किया जा सकता है, यह समान आकार &quot;contaminants&quot; की उपस्थिति के कारण या क्योंकि वे गंभीर रूप से आवश्यक मात्रा में कुल, आईईसी SAXS हमेशा बेहतर अनुकूल दृष्टिकोण हो जाएगा। इसके अलावा, उच्च प्रवाह दरों का समर्थन कियाकई ने आईईसी कॉलम शुद्धि और माप के बीच पारगमन के समय को कम करने में मदद कर सकते हैं। यहाँ प्रस्तुत उदाहरण में, आईईसी एक कदम क्षालन, जो ध्यान से नमक एकाग्रता कदम का चयन करके contaminants से D5 323-785 के करीब चोटियों के अलग होने के लिए अनुमति देता है के साथ इस्तेमाल किया गया था। सिद्धांत रूप में, चरणों की संख्या असीमित है, लेकिन व्यावहारिक रूप से, शिखर के अनुसार कम से कम 1 कदम की आवश्यकता है, और भी कई नहीं चुना जाना चाहिए। ऊपर वर्णित पृष्ठभूमि घटाव विधि के लिए, यह क्रम मिलान एक खोजने के लिए अलग-अलग बफर रचनाओं की एक अपेक्षाकृत उच्च संख्या को मापने के लिए महत्वपूर्ण है। दोनों तकनीकों का एक साझा नकारात्मक पक्ष सटीक प्रोटीन एकाग्रता जानकारी का अभाव है। इस के कारण, सटीक जन आगे बिखरने के आधार पर दृढ़ संकल्प संभव नहीं है। ऐसे D5 323-785 के रूप में गोलाकार प्रोटीन के लिए, Porod मात्रा लेकिन अत्यधिक लचीला या अव्यवस्थित प्रोटीन के लिए, एक वैकल्पिक, कम सटीक, जन अनुमान यद्यपि प्रदान करता है, इस दृष्टिकोण मान्य नहीं होगा। कदम वार ढाल आईईसी SAXS यहाँ प्रस्तुत विधि के एक बदलाव के लिए एक रेखीय ढाल के बजाय का उपयोग है। हालांकि यह संभव है रैखिक ढाल दृष्टिकोण में, के रूप में एक कदम वार क्षालन का उपयोग करते हुए उप चोटियों को अलग-थलग करने के लिए वांछित के रूप में कई कदम के साथ काम करने के लिए, यह क्रम चोटियों को अलग करने में सावधानी से ढाल शर्तों का अनुकूलन करने के लिए आवश्यक है पूरी तरह SAXS शुरू करने से पहले प्रयोग। इस दृष्टिकोण में पृष्ठभूमि घटाव फ्रेम के लिहाज से किया जा सकता है और व्यक्तिगत तख्ते की तुलना द्वारा सत्यापित किया जा सकता है, लेकिन इसे और अधिक उन्नत डेटा से निपटने की आवश्यकता है, और एक समर्पित सॉफ्टवेयर अभी तक मौजूद नहीं है। के रूप में यह macromolecular प्रजातियों की जुदाई निर्धारित करता है एक उपयुक्त स्तंभ की पसंद, दोनों तकनीकों के लिए महत्वपूर्ण है। आकार अपवर्जन कॉलम, लदान क्षमता, वियोज्य अणुओं के आकार की सीमा, और संकल्प में मतभेद है, जबकि आयन एक्सचेंज कॉलम तरह की और घनत्व में भिन्नताउनकी स्थिर आरोपों की। जबकि यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल ESRF beamline BM29, अनुकूलन किसी अन्य SAXS beamline है, सिद्धांत रूप में, सीधा करने के लिए विशिष्ट है। मुख्य आवश्यकताओं एक पर्याप्त उच्च एक्स-रे प्रवाह और एक उपयुक्त डिटेक्टर (आदर्श एकल फोटान गिनती), सेकंड या उससे कम की रेंज में उचित संकेत करने वाली शोर डेटा प्राप्त करने के लिए, और एक ऑनलाइन तरल क्रोमैटोग्राफी प्रणाली बनाने में सक्षम हैं ढ़ाल। सटीक क्रियान्वयन, ज़ाहिर है, स्थानीय beamline पर्यावरण पर निर्भर करेगा। दो विधियों का उपयोग D5 323-785 पर प्राप्त परिणामों से थोड़ा भिन्न होते हैं। परिचलन की त्रिज्या एसईसी डेटा के लिए की तुलना में आईईसी डेटा के लिए थोड़ा छोटा होता है, और बिखरने की अवस्था का स्थानीय minima थोड़ा बड़ा बिखरने वैक्टर करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं। इसका मतलब यह है कि D5 323-785 आईईसी SAXS के साथ मापा थोड़ा D5 323-785 एसईसी-SAXS के साथ मापा तुलना में अधिक कॉम्पैक्ट है। इस ख हो सकता हैशुद्धि और माप के बीच के समय में (आईईसी तेजी से होता है) या एसईसी-शुद्ध नमूने में एक contaminant के लिए नमूना तैयार करने में मतभेद, कम होने की संभावना के कारण ई। मनका दोनों तरीकों के साथ पूरी तरह से स्वतंत्र रूप से प्राप्त मॉडल तुलनीय (चित्रा 1H) कर रहे हैं। D5 323-785 उम्मीद खोखले, hexameric संरचना 18 से पता चलता है। अंत में, ऑनलाइन आयन एक्सचेंज और ऑनलाइन आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी महत्वपूर्ण जैव रासायनिक शुद्धि तरीकों कि सीधे SAXS 6,7,9-12,25,26 करने के लिए मिलकर किया जा सकता हैं। आईईसी SAXS डेटा की पृष्ठभूमि घटाव से थोड़ा अधिक कठिन और एसईसी-SAXS लिए की तुलना में अस्पष्ट है, लेकिन यह फिर भी संभव है। ब्याज की प्रोटीन की biophysical गुणों पर निर्भर करता है, दोनों एसईसी और आईईसी SAXS निहित लाभ के साथ प्रजाति जुदाई के अनुकूलन के लिए अनुमति देते हैं। प्रदान करना है कि सत्यापन के कदम (के रूप में वर्णित) सही ढंग से मनाया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप डेटा का विश्लेषण किया जा सकता है बुद्धिज आत्मविश्वास, और मॉडल मानक उपकरण समुदाय के भीतर उपलब्ध का उपयोग निर्धारित किया जा सकता है। साथ में, दोनों तकनीकों जैविक अणुओं का एक व्यापक रेंज के लिए ऑनलाइन जुदाई की अनुमति है, मानक स्थिर माप के माध्यम से सुलभ नहीं डेटा उपज।

BioSAXS नैनो आकार की वस्तुओं 1-4 के आकार निर्धारित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। एक समाधान अणुओं, एनएम रेंज में आकार युक्त द्वारा एक्स-रे का बिखरने, बहुत कम कोण पर दर्ज की गई है। इस कोणीय रेंज वैश्विक मानकों के बारे में जानकारी होती है: परिचलन की त्रिज्या; सबसे बड़ा intraparticle दूरी; कण आकार; और तह, विकृतीकरण, या विकार की डिग्री। तकनीक क्रिस्टल की आवश्यकता नहीं है, और macromolecule समाधान में रहता है और इस तरह इस तरह के ईओण ताकत, पीएच, आदि इन कारकों के ज्ञान के रूप में सेल के कुछ महत्वपूर्ण पैरामीटर, नकल उतार परिस्थितियों में रखा जा सकता है निर्धारित करने के लिए मदद कर सकता है, उदाहरण के लिए, या ब्याज की एक प्रोटीन की physiologically प्रासंगिक oligomeric राज्य के एक परिसर के प्रस्तावित मॉडल को मान्य करने के लिए। अलग बफर की स्थिति में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के लक्षण वर्णन, लापता डोमेन के मॉडल का निर्माण, अनुरूपता मॉडल के शोधन, और डीअसतत मुड़ा और सामने आया राज्यों की समाप्ति जल्दी और आसानी से 5 प्रदर्शन किया जा सकता है। एकत्रित या विकृत नमूने, कणों का मिश्रण, विषम नमूने, विकिरण क्षति, और बफर बेमेल संयुक्त राष्ट्र के व्याख्या डेटा में परिणाम हो सकता है: किसी भी तकनीक के साथ के रूप में, BioSAXS आंतरिक कमजोरियों है। कई विश्लेषण के तरीकों के लिए, यह संकेत भी माना जाता है कि नमूना monodisperse है, एक आवश्यकता है कि व्यवहार में प्राप्त करने के लिए अक्सर मुश्किल होता है। कई मामलों में, नमूना की गिरावट सूक्ष्म है और अपने दम पर डेटा में पता नहीं किया जा सकता है, और डेटा की व्याख्या करने के लिए किसी भी प्रयास को गलत या भ्रामक भी परिणाम देता है। इन बाधाओं को दूर करने के लिए, आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) और SAXS के संयोजन में कई beamlines पर लागू किया गया था डेटा की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए और तेजी से मुश्किल नमूने 6-11 के लिए इस तकनीक को और अधिक सुलभ बनाने के लिए। हाल ही में, हम ऑनलाइन आयन एक्सचेंज के विकास के द्वारा प्रदर्शनों की सूची के लिए एक नई विधि का जोड़ाक्रोमैटोग्राफी (आईईसी) SAXS 12 -coupled। दोनों तकनीकों जैविक कणों का विश्लेषण करने के लिए पूर्व में असंभव की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए SAXS खोल रहे हैं। जो विधि का उपयोग करने का विकल्प ब्याज के कणों की biophysical गुणों पर निर्भर करता है। एसईसी उनके आकार, जिससे कम से कम स्पष्ट आणविक द्रव्यमान में 10% का अंतर जुदाई के लिए आवश्यक है द्वारा बड़े अणुओं को अलग करती है। स्तंभ और नमूने के शारीरिक गुणों की भौतिक सीमाओं, हाइड्रोफोबिक सतहों, लचीलापन, और स्थिरता की कमी तरह, यह भी डेटा संग्रह, विश्लेषण और व्याख्या जटिल। आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी, जो आईईसी स्तंभ के लिए अपने आरोप पर आधारित अणुओं को अलग करती है और, इसलिए, उनकी बंधन आत्मीयता के बजाय, या एसईसी के अलावा में इस्तेमाल किया जा सकता है। कुल शुल्क आसानी से नियंत्रित एल के लिए पीएच बदल रहा है, या बफर के नमक एकाग्रता बदलती उपलब्ध कराने, एक अपेक्षाकृत सरल विधि द्वारा हेरफेर किया जा सकताआईईसी स्तंभ से अणुओं के संविधान। प्रभारी का उपयोग करके, समान प्रकार के और अणुओं के आकार, जो अन्यथा अलग करने के लिए मुश्किल होगा की जुदाई, आईईसी के साथ नियमित रूप से किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, आईईसी पतला नमूनों के साथ सौदा करने के लिए, एक एकाग्रता कदम है, जो प्रोटीन denaturing के संभावित खतरे से बचने के लिए ले जाने के लिए अनुमति देने में सक्षम होने का लाभ दिया है। दुर्भाग्य से, के रूप में प्रभार वितरण अत्यधिक नमूना पर निर्भर है, आईईसी पीएच और नमक सांद्रता 13,14 के बारे में अनुकूलन की आवश्यकता है। कई प्रोटीन है कि, एक्सप्रेस को शुद्ध, या दोनों के लिए मुश्किल हो जाता है के लिए, नमूना के ही कम मात्रा में अध्ययन करने के लिए उपलब्ध हैं। यह महत्वपूर्ण कुशल होने के लिए और नुकसान शुद्धि चरणों की संख्या को कम करने के लिए और इसलिए, है। इस कारण से, पिछले शुद्धि कदम ऑनलाइन के क्रम में एक अच्छा डेटा सेट इकट्ठा करने की संभावना को बढ़ाने के लिए सीधे SAXS डाटा अधिग्रहण करने से पहले है। यहाँ, हम वर्तमान और ऑनलाइन एसईसी-SAXS और आईईसी SAXS की तुलना करें। दोनों तकनीकों ग्रेनोबल, फ्रांस में 15 में यूरोपीय सिंक्रोट्रॉन विकिरण सुविधा (ESRF) पर BioSAXS beamline BM29 पर लागू किया गया। एक परीक्षण के मामले के रूप में, हम चेचक वायरस प्रोटीन D5, जो बल्कि अन्य तरीकों का उपयोग कर संरचनात्मक रूप से विश्लेषण करने के लिए मुश्किल था की D5N और helicase डोमेन इस्तेमाल किया। चेचक वायरस Poxviridae परिवार का एक सदस्य है और शीतला वायरस, चेचक के कारण करने के लिए 98% समान है। चेचक प्रणाली का उपयोग करते हुए, हम प्रतिकृति मशीनरी का अध्ययन, आवश्यक helicase-primase D5 पर यहाँ ध्यान दे। D5 एक एन टर्मिनल archeo-यूकेरियोटिक primase (एईपी) डोमेन 16 एक सिस्टीन क्लस्टर क्षेत्र (आरईएस। 240-345) 16 के द्वारा पीछा के साथ एक 95-केडीए प्रोटीन होता है। सी टर्मिनस की दिशा में आगे एक D5N डोमेन (आरईएस। 340-460) आता है, जो हमेशा अंत में एक superfamily 3 (SF3) helicase डोमेन D5 प्रकार helicases साथ जुड़ा हुआ है, और (आरईएस। 460-785) 17 (Figurई 1 ए)। D5 की helicase डोमेन एक hexameric अंगूठी संरचना है कि तंग डीएनए के लिए बाध्य करने के लिए की जरूरत है बनाता है। हाल SAXS और ईएम के अध्ययन के लिए धन्यवाद, primase की कम संकल्प संरचनाओं और helicase डोमेन अब 18 से जाना जाता है। यहाँ, हम कैसे सी टर्मिनल टुकड़ा (छाछ 323-785) D5 की की संरचना में अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए ESRF पर BioSAXS beamline BM29 पर कार्यान्वित ऑनलाइन क्रोमैटोग्राफी तकनीक का उपयोग करने के लिए दिखा।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4 dithiothreitol [DTT]</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gel</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>4561033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Phusion Flash PCR Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>F 548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetic acid glacial</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>20104.298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose D-5</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>LF45130653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra -15 Centrifugal filters Ultracel -30K</td>
			<td>Millipore Ltd</td>
			<td>UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0400-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Novagene</td>
			<td>70750-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue&#160;</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>8122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete protease inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11231400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Pac 10 DG Desalting column</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>732-2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>24388.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-6405-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HindIII</td>
			<td>Roche</td>
			<td>656313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisSelect HF Nickel Affinity Gel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>20252.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>AppliChem Panreac</td>
			<td>A1073,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth Miller</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>L3152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc.</td>
			<td>191421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>27808.297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>ER0571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>C6010-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pProEx HTb vector&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>10711018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer</td>
			<td>&#160;Eurofins mwg operon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel extraction kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification kid</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>75746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 6 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5172-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA gel stain</td>
			<td>Invitrogen life technology</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 ligase</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>home made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOP 10</td>
			<td>Invitrogen life technology</td>
			<td>C404003&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uno Q 1R column&#160;</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>720 0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>MPBiomedicals, LLC</td>
			<td>194834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beamline control software BsXCuBE</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camserver software</td>
			<td>Dectris</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>detector control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAMAVER</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>program to align ab initio models&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAMMIF</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>ab initio&#160; model reconstruction programm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC program Biologic Duo Flow</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC program LabSolutions</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPyB</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85.</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMUS</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>program, which performs the manipulation with experimental SAXS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyMOL</td>
			<td>DeLano Scientific LLC</td>
			<td>https://www.pymol.org/</td>
			<td>software for visualization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPCOMB</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>program to superimpose 3D structures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLogic Duo Flow</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLogic Biofrac Fraction collector</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC system</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labsonic P</td>
			<td>Sartorius Stedim biotech</td>
			<td>BBI8535108</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

online size-exclusion and ion-exchange chromatography on a saxs beamline

जैविक छोटे कोण एक्स-रे बिखरने (BioSAXS) समाधान संरचना, कण आकार और आकार और सतह करने वाली मात्रा अणुओं के अनुपात का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल आणविक और संरचनात्मक जीव विज्ञान में एक शक्तिशाली तकनीक है। तकनीक समाधान की स्थिति सांद्रता, पीएच मान, आयनिक ताकत, तापमान, additives, आदि की एक विस्तृत रेंज में फैले का एक बहुत व्यापक विविधता के लिए लागू है, लेकिन नमूना monodisperse जाने की आवश्यकता है। यह चेतावनी SAXS beamlines पर तरल क्रोमैटोग्राफी प्रणाली के कार्यान्वयन के लिए नेतृत्व किया। यहाँ, हम एक beamline पर आकार अपवर्जन (एसईसी) और आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी (आईईसी) के अपस्ट्रीम एकीकरण का वर्णन है, इष्टतम पृष्ठभूमि घटाव, और डेटा की कमी के लिए विभिन्न तरीकों। एक उदाहरण के रूप में, हम वर्णन कैसे हम सेकंड और आईईसी SAXS का उपयोग आवश्यक चेचक वायरस प्रोटीन D5 का एक टुकड़ा, एक D5N helicase डोमेन से मिलकर। हम उसके समग्र आकार और आणविक वजन का निर्धारण, वीं की hexameric संरचना दिखाई प्रोटीन।

मॉडल-मुक्त अपरिवर्तनीय विश्लेषण के परिणाम तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं। D5 323-785 एसईसी-SAXS डेटा के विश्लेषण के 345 केडीए बनाम 338 केडीए के (एक Porod विश्लेषण से) एक आणविक जन अनुमान से पता चला है, आईईसी SAXS का उपयोग कर मनाया। दोनों एक hexamer के लिए 6 बार 53.5 केडीए (321 केडीए) की उम्मीद जन के साथ समझौते में हैं। दोनों डेटा सेट के प्रभाव के तहत अब मॉडलिंग कोई लगाया समरूपता के साथ किया गया था (एसईसी-SAXS: χ 2 = 0.88, आईईसी SAXS: χ 2 = 3.1) और C6 समरूपता का उपयोग कर (एसईसी-SAXS: χ 2 = 1.0, आईईसी SAXS : χ 2 = 4)। दोनों के रूप में पुनर्निर्माण के लिए बिखरने के आंकड़ों के समग्र फिट बैठता है दोनों ही मामलों (चित्रा -1 और ई) में तुलना कर रहे हैं, C6 समरूपता माना जा सकता है। इस प्रकार, मॉडल एक केंद्रीय चैनल, जो आंशिक रूप से बाधित प्रतीत होता है (एसईसी के साथ एक हेक्सागोनल शंकु की तरह संरचना से मेल खाती है: चित्रा 1F, आईईसी: <strओंग&gt; चित्रा 1G, ओवरले चित्रा 1H)। औसत से पहले अलग-अलग मॉडलों में से एक परीक्षा से पता चलता है कि इस बाधा औसत प्रक्रिया के एक विरूपण साक्ष्य होने की संभावना है। <img alt="आकृति 1" src="/files/ftp_upload/54861/54861fig1x.jpg" /> चित्रा 1: SAXS डेटा विश्लेषण और तुलना D5 323 -785 (आंकड़ा सन्दर्भ 12 और 18 से अनुकूलित)। ए) D5 प्रोटीन और d5 323-785 के योजनाबद्ध डोमेन संरचना। बी) के तीन चोटियों के संकेत के साथ ऑफलाइन आयन एक्सचेंज वर्णलेख। ऑरेंज वक्र: 280 एनएम (एयू), नीले रंग की अवस्था पर absorbance: चोटियों पर बफर बी के बफर बी प्रतिशत का प्रतिशत संकेत कर रहे हैं। सी) ऑनलाइन आयन एक्सचेंज वर्णलेख। बी में के रूप में रंग कुंजी इसके अतिरिक्त, मापा तीव्रता हरे रंग में संकेत दिया है। प्रयोगात्मक बिखरने की अवस्था एकएन डी मॉडल एसईसी-SAXS डी) और आईईसी ई) D5 323-785 के डेटा विश्लेषण के द्वारा प्राप्त की वक्र गणना की थी। D5 323-785 की एफ) मनका मॉडल एसईसी डेटा और जी) आईईसी डेटा पर आधारित है। एच) एसईसी और आईईसी मॉडल के ओवरले। एफ में पैनल) एच) एक आणविक दृश्य सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 24 बनाया गया था। <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54861/54861fig1large.jpg" target="_blank">यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> डाटा संग्रह के मापदंडों </td><td></td></tr><tr><td> साधन: </td><td> ESRF BM29 </td></tr><tr><td> वेवलेंथ (एक) </td><td> 0.99 </td></tr><tr><td> क्यू रेंज (ए -1) </td><td> 0,0032 - 0.49 </td></tr><tr><td> नमूना डिटेक्टर दूरी </td><td> 2.864 मीटर </td></tr><tr><td> जोखिम समय (सेकंड) </td><td> 1 फ्रेम प्रति </td></tr><tr><td> एकाग्रता रेंज </td><td> NA </td></tr><tr><td> तापमान (कश्मीर) </td><td> 293 </td></tr><tr><td> डिटेक्टर </td><td> Pilatus 1M (Dectris) </td></tr><tr><td> फ्लक्स (फोटॉनों / s) </td><td> 1 * 10 से 12 </td></tr><tr><td> बीम आकार (माइक्रोन 2) </td><td> 700 × 700 </td></tr><tr><td> D5 323-785, एसईसी के लिए संरचनात्मक मापदंडों </td><td></td></tr><tr><td> मैं 0 (सेमी -1) [Guinier से] </td><td> 0.0237 </td></tr><tr><td> आरजी (एक) [Guinier से] </td><td> 48 </td></tr><tr><td> आर जी मिनट क्यू - क्यू अधिकतम आर जी Guinier के लिए इस्तेमाल किया </td><td> 0.77 - 1.24 </td></tr><tr><td> डी मैक्स (एक) [पी से (आर)] </td><td> 145 </td></tr><tr><td> क्यू रेंज पी के लिए प्रयोग किया जाता है (r) (क -1)</td><td> 0.02 - 0.17 </td></tr><tr><td> Porod मात्रा वी पी (ए 3) [तितर बितर से] </td><td> (570 ± 5) × 10 3 </td></tr><tr><td> आण्विक जन एम आर (केडीए) [V पी से] </td><td> 345 </td></tr><tr><td> अनुक्रम से monomeric श्री परिकलित (केडीए) </td><td> 321 </td></tr><tr><td> D5 323-785, आईईसी के लिए संरचनात्मक मापदंडों </td><td></td></tr><tr><td> मैं 0 (सेमी -1) [Guinier से] </td><td> 0.386 </td></tr><tr><td> आरजी (एक) [Guinier से] </td><td> 46.5 ± 0.1 </td></tr><tr><td> आर जी मिनट क्यू - क्यू अधिकतम आर जी Guinier के लिए इस्तेमाल किया </td><td> 0.44 - 1.29 </td></tr><tr><td> डी मैक्स (एक) [पी से (आर)] </td><td> 120 </td></tr><tr><td> क्यू रेंज पी के लिए प्रयोग किया जाता है (r) (क -1) </td><td> 0.03 - 0.18 </td></tr><tr><td> Porod मात्रा वी पी (&amp; #197; 3) [तितर बितर से] </td><td> (577 ± 5) × 10 3 </td></tr><tr><td> आण्विक जन एम आर (केडीए) [V पी से] </td><td> 339 </td></tr><tr><td> अनुक्रम से hexameric श्री परिकलित (केडीए) </td><td> 321 </td></tr></tbody></table> तालिका 1: SAXS डेटा मापदंडों। तालिका SAXS डाटा अधिग्रहण और विश्लेषण के मापदंडों का सार।

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Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

छोटे कोण एक्स-रे बिखरने (SAXS) द्वारा एक प्रोटीन का समाधान संरचना के निर्धारण monodisperse के नमूने की आवश्यकता है। यहाँ, हम दो संभावनाएं पेश नमूना तैयार करने और डाटा अधिग्रहण के बीच कम से कम देरी सुनिश्चित करने के लिए: ऑनलाइन आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) और ऑनलाइन आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी (आईईसी)।

ऑनलाइन आकार अपवर्जन और एक SAXS Beamline पर आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

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