Name: online size-exclusion and ion-exchange chromatography on a saxs beamline
Uploaded: 2017-01-05T12:30:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline at JoVE.com

We acknowledge financial support for the project from the French grant REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 and by research grants from the Service de Sant&#233; des Arm&#233;es and the D&#233;l&#233;gation G&#233;n&#233;rale pour l'Armement. We are thankful to the ESRF for the SAXS beam time. We thank Andrew McCarthy, Gordon Leonard, Wim Burmeister, and Guy Schoehn for financial and scientific support.

<ol>
	<li>Graewert, M. A., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+and+progress+in+small+and+wide+angle+X-ray+scattering+(SAXS+and+WAXS).">Impact and progress in small and wide angle X-ray scattering (SAXS and WAXS).</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 23, 748-754 (2013).</li><li>Jacques, D. A., Trewhella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-angle+scattering+for+structural+biology-Expanding+the+frontier+while+avoiding+the+pitfalls.">Small-angle scattering for structural biology-Expanding the frontier while avoiding the pitfalls.</a> Protein Sci. 19, 642-657 (2010).</li><li>Kikhney, A. G., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+small+angle+X-ray+scattering+(SAXS)+of+flexible+and+intrinsically+disordered+proteins.">A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins.</a> FEBS Lett. 589, 2570-2577 (2015).</li><li>Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+solution+scattering+(SAXS)+combined+with+crystallography+and+computation:+defining+accurate+macromolecular+structures,+conformations+and+assemblies+in+solution.">X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution.</a> Q. Rev. Biophys. 40, 191-285 (2007).</li><li>Vestergaard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+biostructural+changes,+dynamics,+and+interactions+-+Small-angle+X-ray+scattering+to+the+rescue.">Analysis of biostructural changes, dynamics, and interactions - Small-angle X-ray scattering to the rescue.</a> Arch. Biochem. Biophys. , (2016).</li><li>David, G., P&#233;rez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+sampler+robot+and+high-performance+liquid+chromatography:+a+fully+automated+system+for+biological+small-angle+X-ray+scattering+experiments+at+the+Synchrotron+SOLEIL+SWING+beamline.">Combined sampler robot and high-performance liquid chromatography: a fully automated system for biological small-angle X-ray scattering experiments at the Synchrotron SOLEIL SWING beamline.</a> J. Appl. Crystallogr. 42, 892-900 (2009).</li><li>Graewert, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Pipeline+for+Purification,+Biophysical+and+X-Ray+Analysis+of+Biomacromolecular+Solutions.">Automated Pipeline for Purification, Biophysical and X-Ray Analysis of Biomacromolecular Solutions.</a> Sci. Rep. 5, (2015).</li><li>Lambright, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+techniques+enhance+the+quality+and+scope+of+information+obtained+from+SAXS.">Complementary techniques enhance the quality and scope of information obtained from SAXS.</a> ACA Trans. , 1-12 (2013).</li><li>Mathew, E., Mirza, A., Menhart, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-chromatography-coupled+SAXS+for+accurate+sizing+of+aggregating+proteins.">Liquid-chromatography-coupled SAXS for accurate sizing of aggregating proteins.</a> J. Synchrotron Radiat. 11, 314-318 (2004).</li><li>Round, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+GH3.+12+protein+conformation+through+HPLC-integrated+SAXS+measurements+combined+with+X-ray+crystallography.">Determination of the GH3. 12 protein conformation through HPLC-integrated SAXS measurements combined with X-ray crystallography.</a> Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 69, 2072-2080 (2013).</li><li>Watanabe, Y., Inoko, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-exclusion+chromatography+combined+with+small-angle+X-ray+scattering+optics.">Size-exclusion chromatography combined with small-angle X-ray scattering optics.</a> J. Chromatogr. 1216, 7461-7465 (2009).</li><li>Hutin, S., Brennich, M. E., Maillot, B., Round, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+ion-exchange+chromatography+for+small+angle+X-ray+scattering.">Online ion-exchange chromatography for small angle X-ray scattering.</a> Acta Cryst. , (2016).</li><li>Selkirk, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion-exchange+chromatography.">Ion-exchange chromatography.</a> Protein Purification Protocols. , 125-131 (2004).</li><li>Yigzaw, Y., Hinckley, P., Hewig, A., Vedantham, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+exchange+chromatography+of+proteins+and+clearance+of+aggregates.">Ion exchange chromatography of proteins and clearance of aggregates.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 10, 421-426 (2009).</li><li>Pernot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upgraded+ESRF+BM29+beamline+for+SAXS+on+macromolecules+in+solution.">Upgraded ESRF BM29 beamline for SAXS on macromolecules in solution.</a> J. Synchrotron Radiat. 20, 660-664 (2013).</li><li>Iyer, L. M., Koonin, E. V., Leipe, D. D., Aravind, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+evolution+of+the+archaeo-eukaryotic+primase+superfamily+and+related+palm-domain+proteins:+structural+insights+and+new+members.">Origin and evolution of the archaeo-eukaryotic primase superfamily and related palm-domain proteins: structural insights and new members.</a> Nucleic Acids Res. 33, 3875-3896 (2005).</li><li>Singleton, M. R., Dillingham, M. S., Wigley, D. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+data+analysis+at+the+ESRF+bioSAXS+beamline,+BM29.">Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29.</a> J. Appl. Crystallogr. 49, (2016).</li><li>Petoukhov, M. V., Konarev, P. V., Kikhney, A. G., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATSAS+2.1-towards+automated+and+web-supported+small-angle+scattering+data+analysis.">ATSAS 2.1-towards automated and web-supported small-angle scattering data analysis.</a> J. Appl. Crystallogr. 40, 223-228 (2007).</li><li>Franke, D., Jeffries, C. M., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+Map,+a+goodness-of-fit+test+for+one-dimensional+X-ray+scattering+spectra.">Correlation Map, a goodness-of-fit test for one-dimensional X-ray scattering spectra.</a> Nat. Methods. 12, 419-422 (2015).</li><li>Schrodinger, LLC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8. , (2015).</li><li>Jensen, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+SAXS+measurements+facilitated+by+online+HPLC+buffer+exchange.">Time-resolved SAXS measurements facilitated by online HPLC buffer exchange.</a> J. Synchrotron Radiat. 17, 769-773 (2010).</li><li>Hynson, R. M., Duff, A. P., Kirby, N., Mudie, S., Lee, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ultracentrifugation+coupled+to+small-angle+X-ray+scattering+on+macromolecular+complexes.">Differential ultracentrifugation coupled to small-angle X-ray scattering on macromolecular complexes.</a> J. Appl. Crystallogr. 48, 769-775 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

多くの巨大分子は、クロマトグラフィーを用いて、最終的な精製工程は、良質のデータセットを取得するためにSAXSデータ収集の前に必要とされます。しかしながら、全てのサンプルは安定したままで、彼らは、オリゴマー化状態の混合物に凝集または再平衡化する傾向があります。したがって、ビームラインの最終オンライン精製工程は、最高の品質のSAXSデータを得るために、精製し、データ収集の間の時間を最小化するために必要とされます。関心対象のタンパク質の生物物理学的特性に依存して、SEC-SAXSまたはIEC-SAXSは、最適なサンプル品質が得られるように選択されるかもしれません。ここでは、ヘリカーゼ/プライマーゼD5由来タンパク質構築に、両方の技術を説明し、議論されています。 SEC-SAXSデータの取得は、より多くの標準化になって、多くのBioSAXSビームラインで使用可能です。データ分析、特にバックグラウンド減算は、比較的単純で簡単です。しかし、安定したバッファ信号そして、高分子種の十分な分離が不可欠まま。したがって、完全にカラムを平衡化するのに十分な時間を確保することが重要です。この方法の失敗は、目的のタンパク質と同様のサイズ、低濃度、および放射線に敏感なバッファの永続的な汚染物質であることができます。 実際には、最初に、SEC-SAXSは、ほとんどの高分子試料のための選択の方法として使用される可能性があります。それでも、多くの精製プロトコルは、汚染物質または凝集の存在による前IECステップを必要とします。各濃縮およびクロマトグラフィー工程は、試料（30〜50％と推定される）と、時間の損失と関連していることを考えると、直接IEC-SAXSが有利です。 SECによって精製することができないサンプルについては、原因で同様の大きさの「汚染物質」の存在又はそれが必要な濃度で激しく集約、IEC-SAXSは、常により良い適したアプローチになるので、それをすること。また、より高い流量がサポート多くのIECカラムによって精製および測定間の通過時間を減らすのを助けることができます。ここで紹介する例では、IECは慎重に塩濃度のステップを選択することにより、汚染物質からD5 323から785の近いピークの分離を可能にする段階溶出で使用されました。原理的には、ステップの数は無制限ですが、実用上、ピークごとに少なくとも1ステップが必要であり、あまりにも多くはないが選択されるべきです。上述の背景差分法の場合は、一致するものを見つけるために別のバッファ組成物の比較的高い数を測定することが重要です。 両方の技術の共有欠点は、正確なタンパク質濃度情報の欠如です。これにより、前方散乱に基づいた正確な質量決意は不可能です。このようなD5 323から785のような球状タンパク質の場合、Porod量はあまり正確で、質量推定いえますが、非常に柔軟なまたは無秩序なタンパク質のために、代替手段を提供します、このアプローチは有効ではありません。 ここで提示段階的勾配IEC-SAXS法の変化ではなく、線形勾配を使用することです。段階的溶出を用いてサブピークを単離するために、所望の直線勾配法で、完全にSAXSを開始する前にピークを分離するために慎重に勾配条件を最適化するために必要とされることは、多くのステップで動作することが可能であるが実験。このアプローチでバックグラウンド減算は、フレーム単位に行うことができ、個々のフレームを比較することにより確認することができ、それは、より高度なデータ処理を必要とし、専用のソフトウェアがまだ存在していません。 それは巨大分子種の分離を決定するなどの適切な列の選択は、両方の技術のために重要です。イオン交換カラムは、種類や濃度が変化しながら、サイズ排除カラムは、充填容量、分離可能な巨大分子のサイズ範囲、および解像度が異なりますその固定化された電荷の。 ここで紹介するプロトコルはESRFビームラインBM29に固有のものですが、他のSAXSビームラインへの適応は、原理的には、簡単です。主な要件は、作成することができる十分に高いX線束秒以下の範囲内で合理的な信号対ノイズデータを取得するための適切な検出器（理想的には単一光子計数）、およびオンライン液体クロマトグラフィーシステムでありますグラデーション。正確な実装は、もちろん、ローカルビームラインの環境に依存します。 2つの方法を使用してD5 323から785に得られた結果が若干異なります。回転半径は、SECデータよりもIECデータに対して僅かに小さく、かつ散乱曲線の極小値は、わずかに大きい散乱ベクトルにシフトされます。これは、IEC-SAXSで測定D5 323から785は、SEC-SAXSでもう少しコンパクトD5 323から785よりも測定されることを意味します。これは、bの可能性がありますSEC精製したサンプル中の汚染物質への精製および測定の間の時間における試料調製の違いに起因する電子（IECが高速です）、または、可能性が低いです、。両方の方法で完全に独立して得られたビーズのモデルは（ 図1H）程度です。 D5 323から785までは期待中空、六量構造18を示しています。 結論として、オンラインイオン交換およびオンラインサイズ排除クロマトグラフィーは、SAXS 6,7,9-12,25,26に直接結合することができる重要な生化学的精製法です。 IEC-SAXSデータのバックグラウンド減算は、SEC-SAXSのためのよりもわずかに困難とあいまいですが、それにもかかわらず可能です。目的のタンパク質の生物物理学的特性に応じて、SECおよびIEC-SAXSの両方が固有の利点を有する種の分離の最適化を可能にします。検証ステップは、（説明したように）正確に観察されること、得られたデータを分析することができるウィットを提供H自信、およびモデルは、コミュニティ内で利用可能な標準ツールを使用して決定することができます。一緒に、両方の技術は、標準的な静的測定を介してアクセスされないデータを得、生体高分子の広い範囲のためのオンライン分離を可能にします。

BioSAXSは、ナノサイズの物体1-4の形状を決定するための強力なツールです。 nmの範囲内の大きさの巨大分子を含む溶液によるX線の散乱は、非常に低い角度で記録されます。この角度範囲は、グローバルパラメータに関する情報が含まれています：回転半径を、最大の粒子内の距離。粒子形状。そして、折りたたみ、変性、または障害の程度。技術は、結晶を必要とせず、高分子が溶液中に留まり、従って、例えば、これらの要因の知識を判断するのに役立つ可能性がある等のイオン強度、pH、などの細胞の特定の重要なパラメータを模倣する条件下で維持することができ、または、目的のタンパク質の生理学的に関連性のオリゴマー状態は、複合体の提案モデルの妥当性を検証します。異なる緩衝液条件でのタンパク質 - タンパク質相互作用の特徴付け、不足しているドメインのモデルの作成、相同性モデルの改良、およびデ個別の折り畳まれ展開状態の終了を迅速かつ容易5行うことができます。 未解釈のデータを生じ得る凝集または変性試料は、粒子の混合物を、不均質サンプル、放射線損傷、およびバッファの不一致：任意の技術と同様に、BioSAXSは、固有の弱点を有しています。多くの分析法のために、暗黙のうちに、試料は、実際に得ることはしばしば困難である要件は、単分散であることが想定されます。多くの場合、サンプルの分解は微妙であり、独自のデータで検出することができず、データを解釈しようとすると、不正確な、あるいは誤った結果を与えます。これらの障害を克服するために、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）およびSAXSの組み合わせは、データの品質を保証するために、ますます困難試料6-11については、この技術をよりアクセス可能にする多数のビームライン上で実施されました。最近、我々はオンラインでのイオン交換を開発することによって、レパートリーに新しいメソッドを追加しましたクロマトグラフィー（IEC）は、SAXS 12共役型。両方の技術は分析する以前は不可能生物学的粒子の広い範囲にSAXSを開いています。使用する方法の選択は、目的の粒子の生物物理学的特性に依存します。 SECは、見かけの分子量の少なくとも10％の差が分離のために必要とされるサイズ、によって高分子を分離します。カラムとサンプルの生理学的特性の物理的な限界は、疎水性表面、柔軟性、および安定性の欠如のように、また、データの収集、分析、および解釈を複雑にします。 従って、それらの電荷に基づいて分子を分離し、イオン交換クロマトグラフィーは、IECカラムへの結合親和性は、代わりに、またはSECに加えて使用することができます。全電荷は容易に制御エルための比較的簡単な方法を提供し、pHを変化させる、または緩衝液の塩濃度を変化させることによって操作することができますIECカラムから分子のution。電荷を用いて、他の方法で分離することが困難であろう類似の種類や分子の大きさの分離は、IECで日常的に行うことができます。また、IECは、一つのタンパク質を変性させるの潜在的リスクを伴う濃縮工程を回避することができ、希釈した試料を扱うことができるという利点を有します。電荷分布は非常にサンプルに依存しているとして残念ながら、IECは、pHや塩濃度13,14についての最適化が必要。 発現、精製、またはその両方することは困難であり、多くのタンパク質については、サンプルの唯一の低量は勉強するために利用可能です。効率的であることがあり、したがって、損失を精製工程の数を最小化しすることが重要です。この理由のために、最後の精製工程は、良好なデータセットを収集する可能性を高めるために、従来のSAXSデータ取得に直接オンラインです。 ここに、我々は提示し、オンラインSEC-SAXSとIEC-SAXSを比較します。両方の技術はグルノーブル、フランス15の欧州放射光施設（ESRF）でBioSAXSビームラインBM29上に実装されました。テストケースとして、我々は他の方法を用いて構造的に分析することはかなり困難であったワクシニアウイルスタンパク質D5のD5Nおよびヘリカーゼドメインを使用していました。ワクシニアウイルスは、ポックスウイルス科のファミリーのメンバーであり、痘瘡ウイルス、天然痘の原因98％同一です。ワクシニアシステムを使用して、我々は本質的なヘリカーゼプライマーゼD5にここに焦点を当て、複製機構を研究しています。 D5は、システインクラスター領域（解像度。240から345）16に続いて、N末端archeo-真核生物ゼ（AEP）ドメイン16と95-kDaのタンパク質です。さらに（RES。460から785）C末端がD5Nドメイン常にD5型ヘリカーゼと関連している（RES。340から460）、そして最後にスーパーファミリー3（SF3）ヘリカーゼドメインを来に向けて17（FigurEの1A）。 D5のヘリカーゼドメインはタイトなDNAへの結合のために必要とされる六量体環構造を構築します。最近SAXSおよびEM研究のおかげで、プライマーゼおよびヘリカーゼドメインの低解像度構造は、現在18知られています。 ここでは、D5のC末端断片（残基323から785）の構造への洞察を得るためにESRFでBioSAXSビームラインBM29上に実装され、オンラインでのクロマトグラフィー技術を使用する方法を示しています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4 dithiothreitol [DTT]</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gel</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>4561033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Phusion Flash PCR Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>F 548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetic acid glacial</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>20104.298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose D-5</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>LF45130653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra -15 Centrifugal filters Ultracel -30K</td>
			<td>Millipore Ltd</td>
			<td>UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0400-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Novagene</td>
			<td>70750-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue&#160;</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>8122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete protease inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11231400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Pac 10 DG Desalting column</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>732-2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>24388.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-6405-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HindIII</td>
			<td>Roche</td>
			<td>656313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisSelect HF Nickel Affinity Gel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>20252.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>AppliChem Panreac</td>
			<td>A1073,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth Miller</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>L3152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc.</td>
			<td>191421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>27808.297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>ER0571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>C6010-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pProEx HTb vector&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>10711018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer</td>
			<td>&#160;Eurofins mwg operon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel extraction kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification kid</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>75746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 6 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5172-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA gel stain</td>
			<td>Invitrogen life technology</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 ligase</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>home made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOP 10</td>
			<td>Invitrogen life technology</td>
			<td>C404003&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uno Q 1R column&#160;</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>720 0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>MPBiomedicals, LLC</td>
			<td>194834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beamline control software BsXCuBE</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camserver software</td>
			<td>Dectris</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>detector control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAMAVER</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>program to align ab initio models&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAMMIF</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>ab initio&#160; model reconstruction programm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC program Biologic Duo Flow</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC program LabSolutions</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPyB</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85.</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMUS</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>program, which performs the manipulation with experimental SAXS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyMOL</td>
			<td>DeLano Scientific LLC</td>
			<td>https://www.pymol.org/</td>
			<td>software for visualization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPCOMB</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>program to superimpose 3D structures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLogic Duo Flow</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLogic Biofrac Fraction collector</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC system</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labsonic P</td>
			<td>Sartorius Stedim biotech</td>
			<td>BBI8535108</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

online size-exclusion and ion-exchange chromatography on a saxs beamline

生物学的な小角X線散乱（BioSAXS）を溶液構造、粒子のサイズおよび形状、および高分子の表面対体積比を決定するために使用される分子および構造生物学における強力な技術です。技術は、濃度、pH値、イオン強度、温度、添加剤などの広範囲にわたる溶液条件の非常に広範囲に適用可能であるが、試料が単分散であることが必要です。この警告は、SAXSのビームライン上の液体クロマトグラフィーシステムの導入につながりました。ここでは、ビームラインにサイズ排除（SEC）、イオン交換クロマトグラフィー（IEC）の上流の統合を説明する、最適なバックグラウンド減算、およびデータ整理のための種々の方法。例として、我々はD5Nヘリカーゼドメインからなる、本質的なワクシニアウイルスタンパク質D5の断片上sec-およびIEC-SAXSを使用方法について説明します。我々は番目の六量体構造を示し、その全体的な形状及び分子量を決定しますEタンパク質。

モデルフリー不変分析の結果を表1に記載されています。 D5 323から785 SEC-SAXSデータの分析は、338 kDaの対345キロダルトンの（Porod分析からの）分子量の推定値を示し、IEC-SAXSを用いて観察しました。両方とも、ヘキサマーのための6倍の53.5キロダルトン（321キロダルトン）の予想質量と一致しています。両方のデータセットの第一原理モデリングはなし課さ対称で行われた（SEC-SAXS：χ2 = 0.88、IEC-SAXS：χ2 = 3.1）とC6の対称性を用いて、（SEC-SAXSを：χ2 = 1.0、IEC-SAXS ：χ2 = 4）。両方の再構成のための散乱データの全体的な適合が、両方の場合（ 図1D及びE）に匹敵するように、C6対称性を仮定することができます。したがって、このモデルは、部分的に（SEC遮ら表示され、中央チャネル、と六角形の円錐状の構造に対応します。 図1F; IEC： <strオング&gt;図1G、オーバーレイ図1H）。平均化の前に、個々のモデルの検査は、この障害は、平均化処理のアーチファクトである可能性が高いことを示しています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54861/54861fig1x.jpg" /> 図1：SAXS データ分析およびD5 323 -785（参考文献12および18から適応図） の比較 。 D5タンパク質とD5 323から785のA）概略ドメイン構造。 B）3のピークの表示とオフラインイオン交換クロマトグラム。オレンジ色の曲線：280nmの（AU）、青色の曲線の吸光度：ピークのバッファBのバッファB.パーセンテージの割合が示されています。 C）オンラインイオン交換クロマトグラム。 B.のようにカラーキーはさらに、測定された強度は、緑色で表示されます。実験的散乱曲線aND SEC-SAXS D）及びIEC E）D5 323から785までのデータの解析によって得られたモデルの曲線を計算しました。 SECデータとG）IECデータに基づいて、D5 323から785のF）ビーズモデル。 SECおよびIECモデルのH）オーバーレイ。 F内のパネル）Hへ）は、分子可視化ソフトウェア24を使用して作成されました。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54861/54861fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> データ収集パラメータ </td><td></td></tr><tr><td>楽器： </td><td> ESRF BM29 </td></tr><tr><td>波長（Å） </td><td> 150 </td></tr><tr><td> Q-範囲（Å-1） </td><td> 0.0032から0.49 </td></tr><tr><td>サンプル・ツー・検出器までの距離</td><td> 2.864メートル</td></tr><tr><td>露出時間（秒） </td><td>フレームあたり1 </td></tr><tr><td>濃度域</td><td>ナ</td></tr><tr><td>温度（K） </td><td> 293 </td></tr><tr><td>検出器</td><td>ピラトゥス1M（Dectris） </td></tr><tr><td>フラックス（光子/秒） </td><td> 1×10 12 </td></tr><tr><td>ビームサイズ（μmの2） </td><td> 700×700 </td></tr><tr><td> D5 323から785、SECのための構造パラメータ </td><td></td></tr><tr><td> I 0（-1）[ギニエから] </td><td> 0.0237 </td></tr><tr><td> RG（Å）[ギニエから] </td><td> 48 </td></tr><tr><td> R gの最小 Q -ギニエに使用Q 最大 R gの</td><td> 0.77から1.24 </td></tr><tr><td> D 最大 （Å）[P（R）から] </td><td> 145 </td></tr><tr><td> P（R）（Å-1）のために使用されるQ-範囲</td><td> 0.02から0.17 </td></tr><tr><td> Porod体積V P（A 3）[散布から] </td><td> （570±5）10×3 </td></tr><tr><td>分子質量M R（kDaの）[V pから] </td><td> 345 </td></tr><tr><td>シーケンスから計算された単量体氏（kDaの） </td><td> 321 </td></tr><tr><td> D5 323から785、IECのための構造パラメータ </td><td></td></tr><tr><td> I 0（-1）[ギニエから] </td><td> 0.386 </td></tr><tr><td> RG（Å）[ギニエから] </td><td> 46.5±0.1 </td></tr><tr><td> R gの最小 Q -ギニエに使用Q 最大 R gの</td><td> 0.44から1.29 </td></tr><tr><td> D 最大 （Å）[P（R）から] </td><td> 120 </td></tr><tr><td> P（R）（Å-1）のために使用されるQ-範囲</td><td> 0.03から0.18 </td></tr><tr><td> Porod体積V P（＆＃197; 3）[散布から] </td><td> （577±5）10×3 </td></tr><tr><td>分子質量M R（kDaの）[V pから] </td><td> 339 </td></tr><tr><td>シーケンスから計算された六量氏（kDaの） </td><td> 321 </td></tr></tbody></table> 表1：SAXS データパラメータ。テーブルには、SAXSデータ収集と分析のパラメータをまとめたものです。

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Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

小角X線散乱（SAXS）によるタンパク質の溶液構造の決意は、単分散のサンプルを必要とします。オンラインサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）とオンラインイオン交換クロマトグラフィー（IEC）：ここでは、2つのサンプル調製およびデータ収集の間の最小遅延を保証する可能性を提示します。

SAXSビームライン上のオンラインサイズ排除およびイオン交換クロマトグラフィー

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

時間分解エレクトロスプレーイオン化水素 - 重水素交換質量分析タンパク質の構造とダイナミクスを学ぶために

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

カエノラブディティス ・ エレガンスにおけるハイスループット化合物スクリーニングのための簡単な方法

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

エクソソームおよび人間の血液からの分離を最適化するためにタンパク質の消化が、限外濾過、サイズ排除クロマトグラフィー

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Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

イオン交換クロマトグラフィー (IEX) 蛋白質の分離とキャラクタリゼーションの多角度光散乱 (MALS) に結合

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

多角光散乱に結合したサイズ排除クロマトグラフィーによるタンパク質の特性化(SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

窒化ケイ素膜上の細胞培養とシンクロトロンX線蛍光ナノ分析のための凍結製剤

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

無標的液体クロマトグラフィー-質量分析法ベースの小麦粒のメタボロミクス分析

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

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EFAデコンボリューションとスキャッタによるSEC-SAXSデータの分析

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Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

液体クロマトグラフィー質量分析とバイオインフォマティクスによるペプチドグリカンの半定量分析

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VMXmビームラインにおける微結晶のサンプル調製パイプライン

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...