Name: online size-exclusion and ion-exchange chromatography on a saxs beamline
Uploaded: 2017-01-05T12:30:00
Duration: 11 min 9 s
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We acknowledge financial support for the project from the French grant REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 and by research grants from the Service de Sant&#233; des Arm&#233;es and the D&#233;l&#233;gation G&#233;n&#233;rale pour l'Armement. We are thankful to the ESRF for the SAXS beam time. We thank Andrew McCarthy, Gordon Leonard, Wim Burmeister, and Guy Schoehn for financial and scientific support.

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	<li>Graewert, M. A., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+and+progress+in+small+and+wide+angle+X-ray+scattering+(SAXS+and+WAXS).">Impact and progress in small and wide angle X-ray scattering (SAXS and WAXS).</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 23, 748-754 (2013).</li><li>Jacques, D. A., Trewhella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-angle+scattering+for+structural+biology-Expanding+the+frontier+while+avoiding+the+pitfalls.">Small-angle scattering for structural biology-Expanding the frontier while avoiding the pitfalls.</a> Protein Sci. 19, 642-657 (2010).</li><li>Kikhney, A. G., Svergun, D. 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Biophys. , (2016).</li><li>David, G., P&#233;rez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+sampler+robot+and+high-performance+liquid+chromatography:+a+fully+automated+system+for+biological+small-angle+X-ray+scattering+experiments+at+the+Synchrotron+SOLEIL+SWING+beamline.">Combined sampler robot and high-performance liquid chromatography: a fully automated system for biological small-angle X-ray scattering experiments at the Synchrotron SOLEIL SWING beamline.</a> J. Appl. Crystallogr. 42, 892-900 (2009).</li><li>Graewert, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Pipeline+for+Purification,+Biophysical+and+X-Ray+Analysis+of+Biomacromolecular+Solutions.">Automated Pipeline for Purification, Biophysical and X-Ray Analysis of Biomacromolecular Solutions.</a> Sci. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+data+analysis+at+the+ESRF+bioSAXS+beamline,+BM29.">Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29.</a> J. Appl. Crystallogr. 49, (2016).</li><li>Petoukhov, M. V., Konarev, P. V., Kikhney, A. G., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATSAS+2.1-towards+automated+and+web-supported+small-angle+scattering+data+analysis.">ATSAS 2.1-towards automated and web-supported small-angle scattering data analysis.</a> J. Appl. Crystallogr. 40, 223-228 (2007).</li><li>Franke, D., Jeffries, C. M., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+Map,+a+goodness-of-fit+test+for+one-dimensional+X-ray+scattering+spectra.">Correlation Map, a goodness-of-fit test for one-dimensional X-ray scattering spectra.</a> Nat. Methods. 12, 419-422 (2015).</li><li>Schrodinger, LLC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8. , (2015).</li><li>Jensen, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+SAXS+measurements+facilitated+by+online+HPLC+buffer+exchange.">Time-resolved SAXS measurements facilitated by online HPLC buffer exchange.</a> J. Synchrotron Radiat. 17, 769-773 (2010).</li><li>Hynson, R. M., Duff, A. P., Kirby, N., Mudie, S., Lee, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ultracentrifugation+coupled+to+small-angle+X-ray+scattering+on+macromolecular+complexes.">Differential ultracentrifugation coupled to small-angle X-ray scattering on macromolecular complexes.</a> J. Appl. Crystallogr. 48, 769-775 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

많은 고분자를 들어, 크로마토 그래피를 이용하여 최종 정제 단계는 양질의 데이터 세트를 획득 할 SAXS 데이터 수집에 앞서 요구된다. 그러나 모든 샘플은 안정적으로 유지; 그들은 올리고머 상태의 혼합물에 통합 또는 재 평형하는 경향이있을 수 있습니다. 따라서, 빔라인에 온라인 최종 정제 단계는 최고 품질 SAXS 데이터를 얻기 위해서 정제 및 데이터 수집 사이의 시간을 최소화하기 위해 요구된다. 관심 단백질의 생물 리 학적 특성에 따라 SEC-SAXS 또는 IEC-SAXS 최적 샘플 품질을 얻기 위해 선택 될 수있다. 여기서, 헬리 케이즈 / 프리 메이스 D5 유래의 단백질 구조에서 두 가지 기술이 설명되고 논의된다. SEC-SAXS 데이터의 수집은 점점 더 표준화되고 많은 BioSAXS의 빔라인에 사용할 수 있습니다. 데이터 분석, 특히 배경 뺄셈은 비교적 간단하고 쉽습니다. 그러나, 안정된 버퍼 신호및 거대 분자 화학 종의 충분한 분리가 필수적 남아있다. 따라서, 충분히 열을 평형화하기에 충분한 시간을 확보하는 것이 중요하다. 이 방법의 실패이자, 낮은 농도, 방사선에 민감한 버퍼의 단백질과 유사한 크기의 영구적 인 오염 물질에 기인 할 수있다. 실제로, 초기 SEC-SAXS 대부분의 고분자 샘플 선택의 방법으로 사용될 가능성이 높다. 여전히, 많은 정제 프로토콜은 오염물 또는 응집의 존재로 인해 종래 IEC 단계를 필요로한다. 각 농도 및 크로마토 그래피 단계 (30 % ~ 50 %로 추정) 샘플 및 시간 손실과 연관되어 있음을 감안할 때, 직접 IEC-SAXS 유리하다. SEC에 의해 정제 할 수없는 샘플 인해 비슷한 크기의 &quot;오염&quot;의 존재 또는 필요한 농도 심각 골재 IEC-SAXS 항상 더 적합한 방법이 될 것이기 때문에 그 것이다. 또한, 높은 유속 지원많은 IEC 칼럼 정제 및 측정 사이의 전송 시간을 줄일 수있다. 여기에 제시된 실시 예에서, IEC 신중 염 농도 단계를 선택하여 오염물로부터 D5의 323-785 가까운 피크의 분리를 허용하는 단계 용출로 사용 하였다. 원칙적으로, 단계의 수는 무제한이지만, 사실상, 피크 당 적어도 한 단계가 필요하며, 너무 많은 생략 선택되어야한다. 전술 한 배경 차감 법의 경우, 매칭을 찾기 위해 다른 버퍼 조성물의 상대적으로 높은 수를 측정하는 것이 중요하다. 두 기술의 공유 단점은 정확한 단백질 농도 정보의 부족이다. 이 때문에, 앞으로 산란을 기반으로 정확한 질량 측정 할 수 없습니다. 예 D5 323-785 같은 구형 단백질의 Porod 부피는 매우 유연 또는 무질서 단백질하지만 덜 정확한 질량 추정 불구 대안을 제공한다이 방법은 유효하지 않습니다. 여기에 제시된 단계적 구배 IEC-SAXS 방법의 변형 대신에 선형 구배를 사용하는 것이다. 이 단계적인 용출을 이용하여 서브 - 피크를 분리 할 목적으로 상기 선형 그라데이션 방법에서 많은 단계에서 작동하는 것이 가능하지만, 이는 전적으로 SAXS 시작 전에 피크를 분리하기 위해 신중 구배 조건을 최적화 할 필요 실험. 이 방법에 배경 차감 프레임 현명 할 수 있고, 각각의 프레임들의 비교에 의해 확인 될 수 있지만,보다 고급 데이터 처리를 요구하고, 전용 소프트웨어는 아직 존재하지 않는다. 그것은 거대 분자 종의 분리를 결정한 적당한 컬럼의 선택은 두 가지 기술에 중요하다. 이온 교환 컬럼 종류 및 밀도에 변화하면서 크기 배제 컬럼은, 적재 능력, 분리 거대 분자의 크기 범위 및 해상도에 차이가자신의 고정 요금. 여기에 제시된 프로토콜은 간단 원칙적으로 다른 SAXS 빔라인 인에 ESRF 빔라인 BM29, 적응, 특정된다. 주요 요건은 생성 할 수있는 충분히 높은 X 선 광속 초 이하의 범위에서 합리적인 신호 - 대 - 잡음 데이터를 획득하기에 적합한 검출기 (이상적인 단일 광자 카운팅), 온라인 액체 크로마토 그래피 시스템이다 그라디언트. 정확한 구현은 물론, 로컬 빔라인 환경에 의존 할 것이다. 두 가지 방법을 사용 D5 323-785에서 얻어진 결과는 약간 다르다. 관성 반경은 SEC 데이터보다 IEC 데이터 약간 작고, 산란 곡선의 국부 최소치는 약간 큰 산란 벡터로 전환된다. 이는 IEC-SAXS으로 측정 D5 323-785 약간 더 작고 SEC-SAXS으로 측정 D5 323-785 이상임을 의미한다. 이 ㄱ 있습니다SEC에 정제 된 시료 중의 오염물에 덜 정제과 측정 사이의 시간에서 샘플 준비의 차이 (IEC 빠른 경우), 또는,에 의한 전자. 두 가지 방법으로 완전히 독립적으로 얻어진 비드 모델 (그림 1H) 비교할 수 있습니다. D5 323-785은 예상 중공, hexameric 구조 (18)를 보여줍니다. 결론적으로, 온라인으로 이온 교환 및 온라인 크기 배제 크로마토 그래피 SAXS 6,7,9-12,25,26에 직접 결합 될 수있다 중요한 생화학 적 정제 방법이다. IEC-SAXS 데이터의 배경 차감 약간 SEC-SAXS보다 더 어려운 애매한이지만, 그럼에도 불구하고있다. 관심 단백질의 생물 리 학적 특성에 따라 SEC 및 IEC-SAXS 모두 고유의 장점 종 분리의 최적화를 허용한다. 유효성 검증 단계 (설명) 정확하게 관찰되어, 결과 데이터를 분석 할 수있는 재치 제공H 신뢰도 및 모델은 커뮤니티 내에서 사용 가능한 표준 도구를 사용하여 결정될 수있다. 함께, 두 가지 기술 표준 정적 측정을 통해 액세스 할 수없는 데이터를 산출, 생물학적 거대 분자의 광범위한 온라인 분리 할 수 ​​있습니다.

BioSAXS는 나노 크기의 물체 1-4의 형상을 결정하기위한 강력한 도구이다. 나노 크기 범위에서 고분자를 함유 한 용액에 의한 X 선의 산란이 매우 낮은 각도로 기록된다. 이 각도 범위는 글로벌 매개 변수에 대한 정보가 포함되어 관성 반경을; 가장 큰 입자 내 거리; 입자 형상; 및 폴딩, 변성, 또는 장애의 정도. 결정하는데 도움이되는 기술의 결정을 필요로하지 않고, 거대 분자가 이온 성 등 강도, pH가 이러한 요인의 지식 셀 특정 중요 파라미터를 흉내 낸 상태로 유지 될 수있다, 따라서 용액 내에서 유지하고, 예를 들면, 또는 관심의 단백질의 생리 학적으로 관련 올리고머 상태는 복잡한의 제안 된 모델의 유효성을 검사합니다. 다른 버퍼 조건에서 단백질 - 단백질 상호 작용의 특성 누락 도메인 모델의 작성, 상 동성 모델을 정제하고, 디이산 접혀 펼친 상태의 종료가 빠르고 쉽게 5 행할 수있다. 유엔 해석 데이터가 발생할 수 있습니다 집계 또는 변성 샘플, 입자의 혼합물, 이기종 샘플, 방사선 손상, 버퍼 불일치 : 어떤 기술과 마찬가지로, BioSAXS는 본질적인 약점을 가지고있다. 많은 분석 방법의 경우, 묵시적 샘플을 실제로 얻는 것이 종종 어렵다 요구가 단 분산 인 것으로한다. 많은 경우에, 시료의 열화 미묘한 자체의 데이터를 검출 할 수없고, 데이터를 해석하는 시도가 부정확 또는 잘못된 결과를 제공한다. 이러한 장애를 극복하기 위해, 크기 배제 크로마토 그래피 (SEC) 및 SAXS의 조합은 데이터 품질을 보장하고 어려워 시료 6-11이 기술은 더 접근 할 수 있도록 다수의 빔라인에서 구현 하였다. 최근에, 우리는 온라인으로 이온 교환을 개발하여 레퍼토리에 새로운 방법을 추가크로마토 그래피 (IEC)는 SAXS 12 -coupled. 두 기술은 분석하기 이전에 불가능한 생물학적 입자들의 광범위한 SAXS를 개방한다. 사용되는 방법의 선택은 관심의 입자의 생물 리 학적 특성에 의존한다. SEC는 겉보기 분자 질량의 적어도 10 % 차이가 분리된다 필요한 크기에 의해 고분자를 분리한다. 칼럼과 시료의 생리 학적 특성의 물리적 제한은 소수성 표면, 유연성, 안정성의 부족과 같이 또한 데이터 수집, 분석과 해석을 복잡. 은 IEC 칼럼, 따라서, 그들의 결합 친화도를 그 전하에 기초하여 분자를 분리하고, 이온 교환 크로마토 그래피는 대신 또는 SEC에 더하여 사용될 수있다. 총 전하를 용이하게 제어 EL 비교적 간단한 방법을 pH를 변경 또는 버퍼의 염 농도를 변화 제공함으로써 조작 될 수있다은 IEC 열에서 분자의 ution. 전하를 사용함으로써, 별도로 분리하기 어렵 유사한 종류 및 크기의 분자의 분리는, IEC에 일상적으로 수행 될 수있다. 또한, IEC 하나의 단백질을 변성의 위험을 가지고 농도 단계를 피할 수 있도록 희석하여 시료를 처리 할 수 ​​있다는 장점을 갖는다. 전하 분포가 높은 샘플에 의존 불행히도, IEC는 pH와 염 농도 (13, 14)에 대한 최적화가 필요합니다. 표현 정화, 또는 두 가지 모두 어려운 많은 단백질의 경우, 샘플의 낮은 양의 공부를 할 수 있습니다. 이는 효율적으로하고, 따라서, 손실을 정제 단계의 수를 최소화하는 것이 중요하다. 이 때문에, 최종 정제 단계는 양호한 데이터 세트를 수집 할 가능성을 증가시키기 위해, 온라인 SAXS 데이터 취득 직접 종래이다. 이리우리는 선물 및 온라인 SEC-SAXS 및 IEC-SAXS를 비교합니다. 두 기술은 그르노블, 프랑스 15 유럽 방사광 시설 (ESRF)에서 BioSAXS 빔라인 BM29에 구현되었다. 테스트 케이스로서, 우리는 다른 방법을 이용하여 구조적으로 분석 오히려 곤란했던 백시 니아 바이러스 단백질 D5의 D5N 및 헬리 케이즈 도메인을 사용 하였다. 백시 니아 바이러스는 Poxviridae 가족의 일원이며, 천연두 바이러스, 천연두의 원인으로 98 % 동일하다. 백시 니아 시스템을 사용하여, 우리는 필수 헬리 케이즈 - 프리 메이스의 D5에 여기에 집중 복제 장치를 연구한다. D5는 시스테인 클러스터 영역 (입술. 240-345) (16) 다음에 N 말단 archeo 진핵 프리 메이스 (AEP) 도메인 (16) 95-kDa 단백질이다. 또한 C 말단쪽으로 D5N 도메인 (입술. 340-460)을 제공 항상 D5 형 헬리과 관련된, 그리고 마지막 세 수퍼 패밀리 (SF3) 헬리 케이즈 도메인된다 (입술. 460-785)을 17 (Figur전자 1A). D5의 헬리 케이즈 도메인 꽉 DNA에 결합하는 데 필요한 hexameric 환 구조를 구축한다. 감사 및 EM SAXS 최근 연구에 상기 프리 메이스의 저해상도 구조 및 헬리 케이즈 도메인은 이제 18 알려져있다. 여기, 우리는 D5의 (323-785 잔류 물) C- 말단 단편의 구조에 대한 통찰력을 얻을 수 ESRF의 BioSAXS 빔라인 BM29에 구현 된 온라인 크로마토 그래피 기술을 사용하는 방법을 보여줍니다.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4 dithiothreitol [DTT]</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gel</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>4561033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Phusion Flash PCR Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>F 548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetic acid glacial</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>20104.298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose D-5</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>LF45130653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra -15 Centrifugal filters Ultracel -30K</td>
			<td>Millipore Ltd</td>
			<td>UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0400-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Novagene</td>
			<td>70750-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue&#160;</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>8122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete protease inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11231400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Pac 10 DG Desalting column</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>732-2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>24388.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-6405-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HindIII</td>
			<td>Roche</td>
			<td>656313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisSelect HF Nickel Affinity Gel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>20252.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>AppliChem Panreac</td>
			<td>A1073,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth Miller</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>L3152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc.</td>
			<td>191421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>27808.297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>ER0571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>C6010-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pProEx HTb vector&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>10711018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer</td>
			<td>&#160;Eurofins mwg operon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel extraction kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification kid</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>75746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 6 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5172-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA gel stain</td>
			<td>Invitrogen life technology</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 ligase</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>home made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOP 10</td>
			<td>Invitrogen life technology</td>
			<td>C404003&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uno Q 1R column&#160;</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>720 0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>MPBiomedicals, LLC</td>
			<td>194834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beamline control software BsXCuBE</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camserver software</td>
			<td>Dectris</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>detector control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAMAVER</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>program to align ab initio models&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAMMIF</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>ab initio&#160; model reconstruction programm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC program Biologic Duo Flow</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC program LabSolutions</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPyB</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85.</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMUS</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>program, which performs the manipulation with experimental SAXS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyMOL</td>
			<td>DeLano Scientific LLC</td>
			<td>https://www.pymol.org/</td>
			<td>software for visualization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPCOMB</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>program to superimpose 3D structures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLogic Duo Flow</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLogic Biofrac Fraction collector</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC system</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labsonic P</td>
			<td>Sartorius Stedim biotech</td>
			<td>BBI8535108</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

online size-exclusion and ion-exchange chromatography on a saxs beamline

생물학적 소각 X 선 산란 (BioSAXS)의 용액 구조, 입자 크기 및 형상, 및 고분자의 표면 대 부피 비율을 결정하는 데 사용되는 분자 구조 생물학에서 강력한 기술이다. 기술 등의 농도, pH 값, 이온 세기, 온도, 첨가제, 넓은 범위에 걸쳐 용액 상태의 매우 다양한 적용이지만, 단 분산 샘플 할 필요가있다. 이주의해야 할 점은 SAXS 빔라인에 액체 크로마토 그래피 시스템의 구현되었다. 여기서, 우리는 빔라인의 크기 - 배제 (SEC), 이온 교환 크로마토 그래피 (IEC)의 상류의 통합을 설명하는 최적 배경 차감하고, 데이터 감소하는 다른 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 우리는 우리가 D5N의 헬리 케이즈 도메인으로 구성된 필수 우두 바이러스 단백질 D5의 단편에 사항을 유의 및 IEC-SAXS를 사용하는 방법에 대해 설명합니다. 우리 번째의 hexameric 구조를 보여주는 전체적인 형상 및 분자량을 결정전자 단백질.

모델없이 불변 분석의 결과는 표 1에 나열되어있다. D5 323-785 SEC-SAXS 데이터의 분석은 338 kDa의 대 345 kDa의의 (a Porod 분석)에서 분자 질량 추정을 보였다 IEC-SAXS을 사용하여 관찰 하였다. 둘 다 헥사 6 회 53.5 kDa의 (321 kDa의)의 예상 질량과 일치한다. 두 데이터 세트의 순이 론적 모델링은 더 부과 대칭으로 수행되었다 (SEC-SAXS : χ 2 = 0.88, IEC-SAXS : χ 2 = 3.1) 및 C6 대칭을 사용하여 (SEC-SAXS를 : χ 2 = 1.0, IEC-SAXS : χ (2) = 4). 모두 복원을위한 산란 데이터 전체 맞는 두 가지 경우 (도 1D 및 E)에 비교할 때, C6 대칭을 가정 할 수있다. 따라서, 모델 (SEC 부분적으로 차단 된 중앙 채널 표시와 육각 콘형 구조에 대응한다 :도 1 층;을 IEC : <str옹&gt; 그림 1G, 오버레이 그림 1H). 평균화 전에 개별 모델 시험이 방해가 평균화 처리의 이슈가 될 가능성이 있음을 보여준다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54861/54861fig1x.jpg" /> 그림 1 : SAXS 데이터 분석 및 비교 D5 (323)의 -785 (그림 참조 12 및 18에서 적응). D5 단백질 및 D5 323-785의 A) 도식 도메인 구조. B)이 세 개의 피크의 표시와 함께 오프라인 이온 교환 크로마토. 오렌지 곡선 : 280 nm의 (노소), 파란색 곡선에서 흡광도 : 피크에서 버퍼 B의 버퍼 B. 백분율의 비율이 표시됩니다. C) 온라인 이온 교환 크로마토 그램. B.에서와 같은 색상 키 또한, 측정 된 강도는 녹색으로 표시됩니다. 실험 산란 곡선 AND SEC-SAXS D) 및 IEC E) 323-785 D5의 데이터 분석에 의해 얻어진 모델 곡선을 계산 하였다. SEC 데이터와 G) IEC 데이터에 기초 D5 323-785의 F) 비드 모델. 증권 거래위원회 (SEC)와 IEC 모델 H) 오버레이. F의 패널) H에)는 분자 시각화 소프트웨어 (24)를 사용하여 만들어졌습니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54861/54861fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 데이터 수집 매개 변수 </td><td></td></tr><tr><td> 악기: </td><td> ESRF BM29 </td></tr><tr><td> 파장 (Å) </td><td> 0.99 </td></tr><tr><td> Q-범위 (A-1) </td><td> 0.0032-0.49 </td></tr><tr><td> 샘플 대 검출기 거리는 </td><td> 2.864 m </td></tr><tr><td> 노출 시간 (초) </td><td> 프레임 당 1 </td></tr><tr><td> 농도 범위 </td><td> NA </td></tr><tr><td> 온도 (K) </td><td> 293 </td></tr><tr><td> 탐지기 </td><td> 필라투스 1M (Dectris) </td></tr><tr><td> 플럭스 (광자 / s의) </td><td> 1 × 10 (12) </td></tr><tr><td> 빔 크기 (μm의 2) </td><td> 700 × 700 </td></tr><tr><td> D5 323-785, 삼성 전자 구조 매개 변수 </td><td></td></tr><tr><td> I 0 (cm -1) 기니 어에서] </td><td> 0.0237 </td></tr><tr><td> RG (Å)에서 기니 어] </td><td> (48) </td></tr><tr><td> R의 g 분 Q - 기니 어에 사용되는 Q 최대 R의 g </td><td> 0.77-1.24 </td></tr><tr><td> D 최대 (Å) 페이지에서 (R)] </td><td> (145) </td></tr><tr><td> 페이지에 사용되는 Q-범위 (R) (A-1)</td><td> 0.02-0.17 </td></tr><tr><td> Porod 볼륨 V p를 (3) 분산에서] </td><td> (570 ± 5) (10) (3) × </td></tr><tr><td> 분자 질량 M의 R (kDa의) [V 피에서] </td><td> (345) </td></tr><tr><td> 시퀀스에서 단량체 미스터 계산 (kDa의) </td><td> (321) </td></tr><tr><td> D5 323-785, IEC에 대한 구조 매개 변수 </td><td></td></tr><tr><td> I 0 (cm -1) 기니 어에서] </td><td> 0.386 </td></tr><tr><td> RG (Å)에서 기니 어] </td><td> 46.5 ± 0.1 </td></tr><tr><td> R의 g 분 Q - 기니 어에 사용되는 Q 최대 R의 g </td><td> 0.44-1.29 </td></tr><tr><td> D 최대 (Å) 페이지에서 (R)] </td><td> (120) </td></tr><tr><td> 페이지에 사용되는 Q-범위 (R) (A-1) </td><td> 0.03-0.18 </td></tr><tr><td> Porod 볼륨 V 피 (&amp; #197; 3) 분산에서] </td><td> (577 ± 5) (10) (3) × </td></tr><tr><td> 분자 질량 M의 R (kDa의) [V 피에서] </td><td> 339 </td></tr><tr><td> 시퀀스에서 hexameric 미스터 계산 (kDa의) </td><td> (321) </td></tr></tbody></table> 표 1 : SAXS 데이터 파라미터. SAXS 표는 데이터 수집 및 분석의 파라미터를 요약 한 것이다.

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Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

소각 X 선 산란 (SAXS)에 의한 단백질의 용액 구조의 결정은 단 분산 샘플을 필요로한다. 여기에서는, 샘플 준비 및 데이터 수집 간의 최소 지연을 보장하기 위해 두 가지 가능성을 제시 : 온라인 크기 배제 크로마토 그래피 (SEC) 및 온라인 이온 교환 크로마토 그래피 (IEC).

SAXS 빔라인에 온라인 크기 배제 및 이온 교환 크로마토 그래피

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

연구

생화학

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

꼬마 선 충 에서 높은 처리량 화학 심사 하는 간단한 방법

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

단백질 소화, 한, 및 크기 배제 크로마토그래피 인간의 혈장 및 혈 청에서 Exosomes의 절연을 최적화 하

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

단백질 분리 및 특성에 대 한 다 각 산란 (MALS)를 결합 하는 이온 교환 크로마토그래피 (전류 구동)

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

다각형 광 산란에 결합된 크기 배제 크로마토그래피에 의한 단백질의 특성 (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

싱크로트론 X선 형광 나노 분석을 위한 실리콘 질화물 멤브레인의 세포 배양 및 저온 준비

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

밀 곡물의 비표적 액체 크로마토그래피 질량 분광계 기반 대사체학 분석

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

EFA 감소 및 분산을 통한 SEC-SAXS 데이터 분석

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

액체 크로마토그래피, 질량 분석법 및 생물정보학에 의한 펩티도글리칸의 반정량 분석

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

VMXm 빔라인의 미세 결정을 위한 샘플 준비 파이프라인

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...