Name: online size-exclusion and ion-exchange chromatography on a saxs beamline
Uploaded: 2017-01-05T12:30:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline at JoVE.com

We acknowledge financial support for the project from the French grant REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 and by research grants from the Service de Sant&#233; des Arm&#233;es and the D&#233;l&#233;gation G&#233;n&#233;rale pour l'Armement. We are thankful to the ESRF for the SAXS beam time. We thank Andrew McCarthy, Gordon Leonard, Wim Burmeister, and Guy Schoehn for financial and scientific support.

<ol>
	<li>Graewert, M. A., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+and+progress+in+small+and+wide+angle+X-ray+scattering+(SAXS+and+WAXS).">Impact and progress in small and wide angle X-ray scattering (SAXS and WAXS).</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 23, 748-754 (2013).</li><li>Jacques, D. A., Trewhella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-angle+scattering+for+structural+biology-Expanding+the+frontier+while+avoiding+the+pitfalls.">Small-angle scattering for structural biology-Expanding the frontier while avoiding the pitfalls.</a> Protein Sci. 19, 642-657 (2010).</li><li>Kikhney, A. G., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+small+angle+X-ray+scattering+(SAXS)+of+flexible+and+intrinsically+disordered+proteins.">A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins.</a> FEBS Lett. 589, 2570-2577 (2015).</li><li>Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+solution+scattering+(SAXS)+combined+with+crystallography+and+computation:+defining+accurate+macromolecular+structures,+conformations+and+assemblies+in+solution.">X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution.</a> Q. Rev. Biophys. 40, 191-285 (2007).</li><li>Vestergaard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+biostructural+changes,+dynamics,+and+interactions+-+Small-angle+X-ray+scattering+to+the+rescue.">Analysis of biostructural changes, dynamics, and interactions - Small-angle X-ray scattering to the rescue.</a> Arch. Biochem. Biophys. , (2016).</li><li>David, G., P&#233;rez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+sampler+robot+and+high-performance+liquid+chromatography:+a+fully+automated+system+for+biological+small-angle+X-ray+scattering+experiments+at+the+Synchrotron+SOLEIL+SWING+beamline.">Combined sampler robot and high-performance liquid chromatography: a fully automated system for biological small-angle X-ray scattering experiments at the Synchrotron SOLEIL SWING beamline.</a> J. Appl. Crystallogr. 42, 892-900 (2009).</li><li>Graewert, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Pipeline+for+Purification,+Biophysical+and+X-Ray+Analysis+of+Biomacromolecular+Solutions.">Automated Pipeline for Purification, Biophysical and X-Ray Analysis of Biomacromolecular Solutions.</a> Sci. Rep. 5, (2015).</li><li>Lambright, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+techniques+enhance+the+quality+and+scope+of+information+obtained+from+SAXS.">Complementary techniques enhance the quality and scope of information obtained from SAXS.</a> ACA Trans. , 1-12 (2013).</li><li>Mathew, E., Mirza, A., Menhart, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-chromatography-coupled+SAXS+for+accurate+sizing+of+aggregating+proteins.">Liquid-chromatography-coupled SAXS for accurate sizing of aggregating proteins.</a> J. Synchrotron Radiat. 11, 314-318 (2004).</li><li>Round, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+GH3.+12+protein+conformation+through+HPLC-integrated+SAXS+measurements+combined+with+X-ray+crystallography.">Determination of the GH3. 12 protein conformation through HPLC-integrated SAXS measurements combined with X-ray crystallography.</a> Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 69, 2072-2080 (2013).</li><li>Watanabe, Y., Inoko, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-exclusion+chromatography+combined+with+small-angle+X-ray+scattering+optics.">Size-exclusion chromatography combined with small-angle X-ray scattering optics.</a> J. Chromatogr. 1216, 7461-7465 (2009).</li><li>Hutin, S., Brennich, M. E., Maillot, B., Round, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+ion-exchange+chromatography+for+small+angle+X-ray+scattering.">Online ion-exchange chromatography for small angle X-ray scattering.</a> Acta Cryst. , (2016).</li><li>Selkirk, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion-exchange+chromatography.">Ion-exchange chromatography.</a> Protein Purification Protocols. , 125-131 (2004).</li><li>Yigzaw, Y., Hinckley, P., Hewig, A., Vedantham, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+exchange+chromatography+of+proteins+and+clearance+of+aggregates.">Ion exchange chromatography of proteins and clearance of aggregates.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 10, 421-426 (2009).</li><li>Pernot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upgraded+ESRF+BM29+beamline+for+SAXS+on+macromolecules+in+solution.">Upgraded ESRF BM29 beamline for SAXS on macromolecules in solution.</a> J. Synchrotron Radiat. 20, 660-664 (2013).</li><li>Iyer, L. M., Koonin, E. V., Leipe, D. D., Aravind, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+evolution+of+the+archaeo-eukaryotic+primase+superfamily+and+related+palm-domain+proteins:+structural+insights+and+new+members.">Origin and evolution of the archaeo-eukaryotic primase superfamily and related palm-domain proteins: structural insights and new members.</a> Nucleic Acids Res. 33, 3875-3896 (2005).</li><li>Singleton, M. R., Dillingham, M. S., Wigley, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+helicases+and+nucleic+acid+translocases.">Structure and mechanism of helicases and nucleic acid translocases.</a> Annu. Rev. Biochem. 76, 23-50 (2007).</li><li>Hutin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+organization+of+vaccinia+virus+helicase-primase+D5.">Domain organization of vaccinia virus helicase-primase D5.</a> J. Virol. , 4604-4613 (2016).</li><li>Round, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioSAXS+Sample+Changer:+a+robotic+sample+changer+for+rapid+and+reliable+high-throughput+X-ray+solution+scattering+experiments.">BioSAXS Sample Changer: a robotic sample changer for rapid and reliable high-throughput X-ray solution scattering experiments.</a> Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 71, 67-75 (2015).</li><li>De Maria Antolinos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISPyB+for+BioSAXS,+the+gateway+to+user+autonomy+in+solution+scattering+experiments.">ISPyB for BioSAXS, the gateway to user autonomy in solution scattering experiments.</a> Acta Crystallographica Section D. 71, 76-85 (2015).</li><li>Brennich, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+data+analysis+at+the+ESRF+bioSAXS+beamline,+BM29.">Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29.</a> J. Appl. Crystallogr. 49, (2016).</li><li>Petoukhov, M. V., Konarev, P. V., Kikhney, A. G., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATSAS+2.1-towards+automated+and+web-supported+small-angle+scattering+data+analysis.">ATSAS 2.1-towards automated and web-supported small-angle scattering data analysis.</a> J. Appl. Crystallogr. 40, 223-228 (2007).</li><li>Franke, D., Jeffries, C. M., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+Map,+a+goodness-of-fit+test+for+one-dimensional+X-ray+scattering+spectra.">Correlation Map, a goodness-of-fit test for one-dimensional X-ray scattering spectra.</a> Nat. Methods. 12, 419-422 (2015).</li><li>Schrodinger, LLC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8. , (2015).</li><li>Jensen, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+SAXS+measurements+facilitated+by+online+HPLC+buffer+exchange.">Time-resolved SAXS measurements facilitated by online HPLC buffer exchange.</a> J. Synchrotron Radiat. 17, 769-773 (2010).</li><li>Hynson, R. M., Duff, A. P., Kirby, N., Mudie, S., Lee, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ultracentrifugation+coupled+to+small-angle+X-ray+scattering+on+macromolecular+complexes.">Differential ultracentrifugation coupled to small-angle X-ray scattering on macromolecular complexes.</a> J. Appl. Crystallogr. 48, 769-775 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

For mange makromolekyler, er en avsluttende rensetrinn ved hjelp av kromatografi nødvendig før SAXS datainnsamling for å oppnå en god kvalitet datasett. Men ikke alle prøvene holde seg stabil; de kan være tilbøyelige til aggregering eller re-ekvilibrering av en blanding av oligomerisering tilstander. Derfor er en avsluttende rensetrinn nettet på beamline som kreves for å minimere tiden mellom rensingen og datainnsamling for å oppnå den beste kvalitet SAXS-data. Avhengig av de biofysiske egenskapene til proteinet av interesse, kan SEC-SAXS eller IEC-SAXS velges for å oppnå optimal kvalitet prøven. Her, på en protein-konstruksjon avledet fra helikasen / primase D5, blir begge teknikkene beskrevet og diskutert. Oppkjøp av SEC-SAXS data blir mer og mer standardisert og er tilgjengelig på mange BioSAXS beamlines. Dataanalyse, spesielt bakgrunn subtraksjon, er relativt grei og enkel. Imidlertid er en stabil buffersignalog tilstrekkelig separasjon av de makromolekylære arter som er fortsatt vesentlig. Derfor er det viktig å reservere tilstrekkelig tid til å ekvilibrere kolonnen grundig. Svikt i denne fremgangsmåten kan være på grunn av vedvarende forurensninger av tilsvarende størrelse til proteinet av interesse, lave konsentrasjoner, og strålingsfølsomme buffere. I praksis, i første omgang, er SEC-SAXS sannsynligvis vil bli brukt som metoden for valg for de fleste makromolekylære prøver. Likevel, flere renseprotokoller krever en forutgående IEC skritt på grunn av tilstedeværelsen av forurensninger eller aggregering. Gitt at hver konsentrasjon og kromatografitrinn er forbundet med tap av prøven (anslått til 30-50%) og tid, er direkte IEC-SAXS fordelaktig. For prøver som ikke kan renses ved SEC, det være seg på grunn av tilstedeværelsen av tilsvarende størrelse &quot;forurensninger&quot;, eller fordi de sterkt aggregert ved de nødvendige konsentrasjoner, vil IEC-SAXS alltid være bedre egnet tilnærming. Også de høyere strømningshastigheter støttesav mange IEC kolonner kan bidra til å redusere transporttiden mellom rensing og måling. I det eksempel som er presentert her, ble IEC brukt sammen med et trinn eluering, som tillater separasjon av de nære toppene av D5 323-785 fra forurensninger ved omhyggelig valg av saltkonsentrasjonstrinn. I prinsippet er det antall trinn ubegrenset, men i praksis er i det minste ett trinn pr peak nødvendig, og ikke for mange bør velges. For bakgrunnen subtraksjon fremgangsmåten beskrevet ovenfor, er det viktig å måle et relativt høyt antall forskjellige buffersammensetninger for å finne den samsvarende ett. En felles ulempe for begge teknikkene er mangelen på nøyaktig proteinkonsentrasjon informasjon. På grunn av dette, er nøyaktig massebestemmelse basert på forover spredning ikke mulig. For globular proteiner som D5 323-785, gir Porod volum en alternativ, om enn mindre presis, masse anslag, men for svært fleksible eller uordnede proteinerDenne tilnærmingen ville ikke være gyldig. En variant av den trinnvise gradient IEC-SAXS-metoden presentert her er anvendelse av en lineær gradient i stedet. Selv om det er mulig å arbeide med så mange trinn som ønsket for å isolere under topper ved anvendelse av en trinnvis eluering, i den lineære gradient tilnærming, er det nødvendig å optimalisere gradient betingelsene nøye for å separere toppene fullstendig før man starter SAXS eksperiment. Bakgrunn subtraksjon i denne tilnærmingen kunne gjøres ramme-klok og kunne bekreftes ved sammenligning av enkeltbilder, men det krever mer avansert datahåndtering, og en dedikert programvare ikke finnes ennå. Valget av en egnet kolonne er kritisk for begge teknikkene, da det bestemmer separasjon av de makromolekylære arter. Størrelseseksklusjonskolonner skiller seg i lastekapasitet, størrelsesområdet separerbare makromolekyler, og oppløsning, mens ione-utvekslingskolonner variere i type og tetthetav sine immobilisert kostnader. Mens protokollen som presenteres her er spesifikk for ESRF beamline BM29, tilpasning til en hvilken som helst annen SAXS beamline er i prinsippet enkel. De viktigste krav er tilstrekkelig høy røntgen fluks og en passende detektor (helst enkelt-foton-telle), for å skaffe gunstige signal-til-støydata i størrelsesorden av noen sekunder eller mindre, og en elektronisk væskekromatografi systemet i stand til å skape gradienter. Den nøyaktige oppbygning vil, selvfølgelig, være avhengig av den lokale beamline miljø. De oppnådde på D5 323-785 ved hjelp av de to metodene resultatene avvike noe. Rotasjonsradien er litt mindre for IEC data enn for SEC-data, og den lokale minima av spredningskurven forskyves til litt større sprednings vektorer. Dette betyr at D5 323-785 målt med IEC-SAXS er noe mer kompakt enn D5 323-785 målt ved hjelp av SEC-SAXS. Dette kan be på grunn av forskjeller i prøveopparbeidelse, i tiden mellom rensing og måling (IEC er raskere), eller, mindre sannsynlig, til en forurensning i SEC-rensede prøven. De kule-modeller som oppnås fullstendig uavhengig av hverandre med begge metoder er sammenlignbare (figur 1 H). D5 323-785 viser ventet hul, heksa struktur 18. I konklusjonen, online ion-exchange og online størrelse-kromatografi er viktige biokjemiske rensemetoder som kan kobles direkte til SAXS 6,7,9-12,25,26. Bakgrunnen subtraksjon av IEC-SAXS data er litt vanskeligere og tvetydig enn for SEC-SAXS, men det er ikke desto mindre mulig. Avhengig av de biofysiske egenskapene til proteinet av interesse, både SEC og IEC-SAXS tillate optimalisering av arten separasjon med iboende fordeler. Forutsatt at validerings trinnene (som beskrevet) er korrekt observeres, kan de resulterende data skal analyseres vetth tillit, og modellene kan bestemmes ved hjelp av standard verktøy tilgjengelig i samfunnet. Sammen, begge teknikker tillater nettet separasjon for et bredt spekter av biologiske makromolekyler, noe som ga data ikke er tilgjengelige via standard statiske målinger.

BioSAXS er et kraftig verktøy for å bestemme formen på nanostørrelse stedene 1-4. Spredningen av røntgenstråler med en oppløsning inneholdende makromolekyler, størrelse i nm, føres ved meget lave vinkler. Dette vinkelområde inneholder informasjon om globale parametere: treghetsradier; den største intrapartikulær avstand; partikkelformen; og graden av folding, denaturering, eller uorden. Teknikken krever ikke krystaller, og den makromolekylet forblir i løsning, og således kan holdes under betingelser som etterligner visse viktige parametre for cellen, slik som ionestyrke, pH, etc. kunnskap om disse faktorer kan bidra til å bestemme, for eksempel, det fysiologisk relevante oligomere tilstand av et protein av interesse, eller for å validere en foreslått modell av et kompleks. Karakterisering av protein-protein interaksjoner i forskjellige bufferbetingelsene, etablering av modeller av manglende domener, avgrensningen av homologi modeller, og deopphør av diskrete brettes og utfoldet tilstander kan utføres raskt og enkelt 5. Som med alle teknikk, har BioSAXS iboende svakheter: aggregerte eller denaturert prøver, blandinger av partikler, heterogene prøver, stråleskader, og buffer uoverensstemmelser kan føre til un-tolkbare data. For mange analysemetoder, er det implisitt antatt at prøven er monodisperse, et krav som ofte er vanskelig å oppnå i praksis. I mange tilfeller er det degradering av prøven subtile og kan ikke detekteres i data på egen hånd, og ethvert forsøk på å tolke dataene gir unøyaktige, eller til og med misvisende resultater. For å overvinne disse hindringene, ble en kombinasjon av størrelse-eksklusjonskromatografi (SEC) og SAXS implementeres på mange beamlines for å sikre datakvalitet og for å gjøre denne teknikken mer tilgjengelig for stadig vanskeligere prøvene 6-11. Nylig la vi en ny metode for å repertoaret ved å utvikle online ion-exchangekromatografi (IEC) -koblet SAXS 12. Begge teknikker er åpne SAXS til et bredt spekter av biologiske partikler tidligere umulig å analysere. Valget av hvilken metode som skal brukes avhenger av biofysiske egenskapene til partiklene av interesse. SEC skiller makromolekyler av deres størrelse, hvorved er nødvendig minst en 10% forskjell i tilsynelatende molekylmasse for separasjon. Fysiske begrensninger av kolonnen og fysiologiske egenskaper av prøvene, som hydrofobe overflater, fleksibilitet, mangel på stabilitet, også komplisere datainnsamling, analyse og fortolkning. Ionebytte-kromatografi, som separerer molekyler basert på deres ladning og dermed deres bindingsaffinitet til IEC kolonne, kan brukes i stedet for eller i tillegg til SEC. Den totale ladningen kan lett manipuleres ved å endre pH-verdien, eller varierende saltkonsentrasjonen i bufferen, og gir en forholdsvis enkel metode for regulert elution av molekyler fra den IEC kolonnen. Ved å bruke ladning, separasjon av lignende typer og størrelser av molekyler, som ellers ville være vanskelig å separere, kan utføres rutinemessig med IEC. I tillegg har IEC fordelen av å være i stand til å håndtere fortynnede prøver, slik at man for å unngå konsentrasjonstrinn, som bærer den potensielle risiko for denaturering av proteinet. Dessverre, som det ladningsfordeling er meget sample-avhengige, krever IEC optimalisering med hensyn til pH og saltkonsentrasjoner 13,14. For mange proteiner som er vanskelig å uttrykke, rense, eller begge deler, bare lave mengder av prøven er tilgjengelige for å studere. Det er viktig å være effektive og for å minimere antall rensetrinn, og derfor tapene. Av denne grunn er det siste rensetrinnet elektronisk direkte før SAXS datainnsamling, for å øke sannsynligheten for å samle inn en god datasett. HerPresenterer vi og sammenligne online SEC-SAXS og IEC-SAXS. Begge teknikker ble gjennomført på BioSAXS beamline BM29 ved European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) i Grenoble, Frankrike 15. Som en test, vi brukte D5N og helikasen domene av vaccinia-virus-protein D5, som var temmelig vanskelig å analysere strukturelt ved hjelp av andre metoder. Vaccinia viruset er et medlem av familien Poxviridae, og er 98% identisk med Variola virus, årsaken til små pox. Bruke vaccinia systemet, studerer vi replikering maskiner, med fokus her på essensielle helicase-primase D5. D5 er et 95-kDa-protein med en N-terminal Archeo-eukaryote primase (AEP) domene 16 etterfulgt av en cystein klynge region (res. 240-345) 16. Videre mot C-terminalen kommer en D5N domene (res. 340-460), som er alltid forbundet med D5-type heli, og til slutt en super 3 (SF3) helicase domene (res. 460-785) 17 (Figure 1A). Den helikase domene av D5 bygger en heksaringstruktur som er nødvendig for tett binding til DNA. Takket være de siste SaXs og EM-studier, er lavoppløste strukturer av primase og helicase domener nå kjent 18. Her viser vi hvordan du bruker de gjennomførte online kromatografiteknikker på BioSAXS beamline BM29 ved ESRF å få innsikt i strukturen i C-terminale fragment (rest 323-785) av D5.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4 dithiothreitol [DTT]</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gel</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>4561033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Phusion Flash PCR Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>F 548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetic acid glacial</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>20104.298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose D-5</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>LF45130653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra -15 Centrifugal filters Ultracel -30K</td>
			<td>Millipore Ltd</td>
			<td>UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0400-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Novagene</td>
			<td>70750-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue&#160;</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>8122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete protease inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11231400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Pac 10 DG Desalting column</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>732-2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>24388.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-6405-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HindIII</td>
			<td>Roche</td>
			<td>656313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisSelect HF Nickel Affinity Gel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>20252.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>AppliChem Panreac</td>
			<td>A1073,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth Miller</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>L3152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc.</td>
			<td>191421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>27808.297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>ER0571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>C6010-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pProEx HTb vector&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>10711018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer</td>
			<td>&#160;Eurofins mwg operon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel extraction kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification kid</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>75746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 6 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5172-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA gel stain</td>
			<td>Invitrogen life technology</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 ligase</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>home made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOP 10</td>
			<td>Invitrogen life technology</td>
			<td>C404003&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uno Q 1R column&#160;</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>720 0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>MPBiomedicals, LLC</td>
			<td>194834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beamline control software BsXCuBE</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camserver software</td>
			<td>Dectris</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>detector control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAMAVER</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>program to align ab initio models&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAMMIF</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>ab initio&#160; model reconstruction programm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC program Biologic Duo Flow</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC program LabSolutions</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPyB</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85.</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMUS</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>program, which performs the manipulation with experimental SAXS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyMOL</td>
			<td>DeLano Scientific LLC</td>
			<td>https://www.pymol.org/</td>
			<td>software for visualization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPCOMB</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>program to superimpose 3D structures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLogic Duo Flow</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLogic Biofrac Fraction collector</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC system</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labsonic P</td>
			<td>Sartorius Stedim biotech</td>
			<td>BBI8535108</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

online size-exclusion and ion-exchange chromatography on a saxs beamline

Biologisk liten vinkel røntgen-spredning (BioSAXS) er en kraftfull teknikk i molekylær biologi og struktur benyttet for å bestemme oppløsning struktur, partikkelstørrelse og form, og overflate-til-volum-forholdet av makromolekyler. Teknikken kan anvendes på et svært bredt spekter av oppløsningsbetingelser som strekker seg over et bredt område av konsentrasjoner, pH-verdier, ionestyrker, temperaturer, additiver, etc., men prøven er nødvendig for å være monodisperse. Dette forbeholdet førte til gjennomføringen av væskekromatografi systemer på SaXs beamlines. Her beskriver vi oppstrøms integrasjon av størrelsesutelukkelses (SEC) og ionebytterkromatografi (IEC) på en beamline, forskjellige metoder for optimal bakgrunn subtraksjon, og datareduksjon. Som et eksempel, vil vi beskrive hvordan vi bruker sek- og IEC-SAXS på et fragment av de essensielle vaccinia virus protein D5, som består av en D5N helikase domene. Vi bestemmer dens totale form og molekylvekt, som viser heksa struktur av the protein.

Resultatene av modellfrie invariant analyse er oppført i tabell 1. Analysen av D5 323-785 SEC-SAXS data viste en molekylvekt anslag (fra en Porod analyse) av 345 kDa versus 338 kDa, observert ved anvendelse av IEC-SAXS. Begge er i overensstemmelse med den forventede masse av 6 ganger 53,5 kDa (321 kDa) for en hexamer. Den ab initio modellering av begge datasettene ble gjennomført uten pålagt symmetri (SEC-SAXS: χ 2 = 0.88, IEC-SAXS: χ 2 = 3,1) og bruk C6 symmetri (SEC-SAXS: χ 2 = 1,0, IEC-SAXS : χ 2 = 4). Ettersom den samlede passer til spredningsdata for både rekonstruksjoner er sammenlignbare i begge tilfeller (figur 1D og E), kan antas C6 symmetri. Således tilsvarer modellen til et sekskantet kjegle-lignende struktur med en sentral kanal, som vises delvis hindret (SEC: Figur 1F; IEC: <strong&gt; Figur 1G, overlay Figur 1 H). En undersøkelse av enkelte modeller før i snitt viser at dette gir grunn til å være et produkt av den gjennomsnitts prosessen. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/54861/54861fig1x.jpg" /> Figur 1: SAXS dataanalyse og sammenligning av D5 323 -785 (figur tilpasset fra Referanser 12 og 18). A) Skjematisk domenestruktur av D5 protein og D5 323-785. B) Offline ion-exchange kromatogram med angivelse av de tre toppene. Orange kurve: Absorbans ved 280 nm (AU), blå kurve: Prosent av buffer B. Prosentvise buffer B på toppene er angitt. C) Online ion-exchange kromatogram. Farge nøkkel som i B. I tillegg er den målte intensitet angitt i grønt. Den eksperimentelle spredning kurve ennd beregnet kurve av modellen oppnådd ved SEC-SAXS D) og IEC E) dataanalyse av D5 323-785. F) Bead modell av D5 323-785 basert på SEC-data og G) IEC data. H) Overlay av SEC og IEC-modeller. Panelene i F) til H) ble opprettet ved hjelp av en molekylær visualisering programvare 24. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54861/54861fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Datainnsamling parametere </td><td></td></tr><tr><td> Instrument: </td><td> ESRF BM29 </td></tr><tr><td> Bølgelengde (Å) </td><td> 0.99 </td></tr><tr><td> q-range (-1) </td><td> 0,0032 til 0,49 </td></tr><tr><td> Prøve-å-detektor avstand </td><td> 2,864 m </td></tr><tr><td> Eksponeringstid (sek) </td><td> 1 per ramme </td></tr><tr><td> konsentrasjonsområde </td><td> na </td></tr><tr><td> Temperatur (K) </td><td> 293 </td></tr><tr><td> Detector </td><td> Pilatus 1M (Dectris) </td></tr><tr><td> Flux (fotoner / s) </td><td> 1 × 10 12 </td></tr><tr><td> Bjelke størrelse (um 2) </td><td> 700 × 700 </td></tr><tr><td> Strukturelle parametere for D5 323-785, SEC </td><td></td></tr><tr><td> I 0 (cm -1) [fra Guinier] </td><td> 0,0237 </td></tr><tr><td> Rg (A) [fra Guinier] </td><td> 48 </td></tr><tr><td> q min R g - q max R g brukt for Guinier </td><td> 0,77 til 1,24 </td></tr><tr><td> D max (A) [fra p (r)] </td><td> 145 </td></tr><tr><td> q-serien brukes for p (r) (-1)</td><td> 0,02 til 0,17 </td></tr><tr><td> Porod volum V P (A 3) [fra Scatter] </td><td> (570 ± 5) × 10 3 </td></tr><tr><td> Molekylvekt M r (KDA) [fra V p] </td><td> 345 </td></tr><tr><td> Beregnet monomere Mr fra sekvens (KDA) </td><td> 321 </td></tr><tr><td> Strukturelle parametere for D5 323-785, IEC </td><td></td></tr><tr><td> I 0 (cm -1) [fra Guinier] </td><td> 0,386 </td></tr><tr><td> Rg (A) [fra Guinier] </td><td> 46,5 ± 0,1 </td></tr><tr><td> q min R g - q max R g brukt for Guinier </td><td> 0,44 til 1,29 </td></tr><tr><td> D max (A) [fra p (r)] </td><td> 120 </td></tr><tr><td> q-serien brukes for p (r) (-1) </td><td> 0,03 til 0,18 </td></tr><tr><td> Porod volum V p (&amp; #197; 3) [fra Scatter] </td><td> (577 ± 5) × 10 3 </td></tr><tr><td> Molekylvekt M r (KDA) [fra V p] </td><td> 339 </td></tr><tr><td> Beregnet heksa Mr fra sekvens (KDA) </td><td> 321 </td></tr></tbody></table> Tabell 1: SAXS dataparametre. Tabellen oppsummerer de parametrene for SAXS datainnsamling og analyse.

Watch this Scientific Journal Video about Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline at JoVE.com

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

Bestemmelsen av strukturen oppløsning av et protein ved liten vinkel røntgen-spredning (SAXS) krever monodisperse prøver. Her presenterer vi to muligheter for å sikre minimale forsinkelser mellom prøveopparbeidelse og datainnsamling: online size-kromatografi (SEC) og online ionebytterkromatografi (IEC).

Online Size-eksklusjon og ionebytterkromatografi på en SAXS tros

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrospray-ionisering Hydrogen-deuterium Veksling massespektrometri for å studere Protein struktur og dynamikk

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En enkel metode for høy gjennomstrømning kjemiske Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Protein fordøyelse, ultrafiltrasjon og størrelse utelukkelse kromatografi å optimalisere isolering av Exosomes fra menneskelig blod Plasma og Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

Ionebytte kromatografi (IEX) koblet til multi-Angle lysspredning (MALS) for proteiner og karakterisering

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Karakterisering av proteiner etter størrelses-ekskludering kromatografi koblet til multi-vinkel lysspredning (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Cell kultur på Silicon nitride membraner og Cryopreparation for Synchrotron X-ray fluorescens nano-analyse

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Umålrettet flytende kromatografi-massespektrometribasert metabolomikkanalyse av hvetekorn

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

Analyse av SEC-SAXS-data via EFA-overføring og spredning

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Semi-kvantitativ analyse av peptidoglykan ved væskekromatografi, massespektrometri og bioinformatikk

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

En prøveforberedelsesrørledning for mikrokrystaller ved VMXm-strålelinjen

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...