Name: online size-exclusion and ion-exchange chromatography on a saxs beamline
Uploaded: 2017-01-05T12:30:00
Duration: 11 min 9 s
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We acknowledge financial support for the project from the French grant REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 and by research grants from the Service de Sant&#233; des Arm&#233;es and the D&#233;l&#233;gation G&#233;n&#233;rale pour l'Armement. We are thankful to the ESRF for the SAXS beam time. We thank Andrew McCarthy, Gordon Leonard, Wim Burmeister, and Guy Schoehn for financial and scientific support.

<ol>
	<li>Graewert, M. A., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+and+progress+in+small+and+wide+angle+X-ray+scattering+(SAXS+and+WAXS).">Impact and progress in small and wide angle X-ray scattering (SAXS and WAXS).</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 23, 748-754 (2013).</li><li>Jacques, D. A., Trewhella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-angle+scattering+for+structural+biology-Expanding+the+frontier+while+avoiding+the+pitfalls.">Small-angle scattering for structural biology-Expanding the frontier while avoiding the pitfalls.</a> Protein Sci. 19, 642-657 (2010).</li><li>Kikhney, A. G., Svergun, D. 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Biophys. 40, 191-285 (2007).</li><li>Vestergaard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+biostructural+changes,+dynamics,+and+interactions+-+Small-angle+X-ray+scattering+to+the+rescue.">Analysis of biostructural changes, dynamics, and interactions - Small-angle X-ray scattering to the rescue.</a> Arch. Biochem. 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Rep. 5, (2015).</li><li>Lambright, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+techniques+enhance+the+quality+and+scope+of+information+obtained+from+SAXS.">Complementary techniques enhance the quality and scope of information obtained from SAXS.</a> ACA Trans. , 1-12 (2013).</li><li>Mathew, E., Mirza, A., Menhart, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-chromatography-coupled+SAXS+for+accurate+sizing+of+aggregating+proteins.">Liquid-chromatography-coupled SAXS for accurate sizing of aggregating proteins.</a> J. Synchrotron Radiat. 11, 314-318 (2004).</li><li>Round, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+GH3.+12+protein+conformation+through+HPLC-integrated+SAXS+measurements+combined+with+X-ray+crystallography.">Determination of the GH3. 12 protein conformation through HPLC-integrated SAXS measurements combined with X-ray crystallography.</a> Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 69, 2072-2080 (2013).</li><li>Watanabe, Y., Inoko, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-exclusion+chromatography+combined+with+small-angle+X-ray+scattering+optics.">Size-exclusion chromatography combined with small-angle X-ray scattering optics.</a> J. Chromatogr. 1216, 7461-7465 (2009).</li><li>Hutin, S., Brennich, M. 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Virol. , 4604-4613 (2016).</li><li>Round, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioSAXS+Sample+Changer:+a+robotic+sample+changer+for+rapid+and+reliable+high-throughput+X-ray+solution+scattering+experiments.">BioSAXS Sample Changer: a robotic sample changer for rapid and reliable high-throughput X-ray solution scattering experiments.</a> Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 71, 67-75 (2015).</li><li>De Maria Antolinos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISPyB+for+BioSAXS,+the+gateway+to+user+autonomy+in+solution+scattering+experiments.">ISPyB for BioSAXS, the gateway to user autonomy in solution scattering experiments.</a> Acta Crystallographica Section D. 71, 76-85 (2015).</li><li>Brennich, M. 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I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+Map,+a+goodness-of-fit+test+for+one-dimensional+X-ray+scattering+spectra.">Correlation Map, a goodness-of-fit test for one-dimensional X-ray scattering spectra.</a> Nat. Methods. 12, 419-422 (2015).</li><li>Schrodinger, LLC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8. , (2015).</li><li>Jensen, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+SAXS+measurements+facilitated+by+online+HPLC+buffer+exchange.">Time-resolved SAXS measurements facilitated by online HPLC buffer exchange.</a> J. Synchrotron Radiat. 17, 769-773 (2010).</li><li>Hynson, R. M., Duff, A. P., Kirby, N., Mudie, S., Lee, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ultracentrifugation+coupled+to+small-angle+X-ray+scattering+on+macromolecular+complexes.">Differential ultracentrifugation coupled to small-angle X-ray scattering on macromolecular complexes.</a> J. Appl. Crystallogr. 48, 769-775 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Para muitas macromoléculas, uma etapa final de purificação utilizando cromatografia é necessária antes da coleta de dados de SAXS para obter um bom conjunto de dados de qualidade. No entanto, nem todas as amostras permanecem estáveis; eles podem ser propensos a agregação ou re-equilibração a uma mistura de estados de oligomerização. Portanto, um passo de purificação final online na linha de luz é necessária para minimizar o tempo entre a purificação e a recolha de dados, a fim de obter os dados de SAXS melhor qualidade. Dependendo das propriedades biofísicas da proteína de interesse, sec-SAXS ou IEC-SAXS podem ser escolhidos para se obter a qualidade da amostra óptima. Aqui, sobre uma construção de proteína derivada da helicase / primase D5, ambas as técnicas são explicadas e discutido. Aquisição de dados SEC-SAXS está se tornando mais e mais padronizados e está disponível em muitas linhas de luz BioSAXS. A análise dos dados, especialmente subtração de fundo, é relativamente simples e fácil. No entanto, um sinal de tampão estávele a separação suficiente das espécies macromoleculares continua a ser essencial. Portanto, é crítico para reservar tempo suficiente para equilibrar a coluna exaustivamente. A falha deste método pode ser devido a contaminantes persistentes de tamanho semelhante para a proteína de interesse, em baixas concentrações, e tampões sensíveis à radiação. Na prática, inicialmente, sec-SAXS é susceptível de ser usado como o método de escolha para a maioria das amostras macromoleculares. Ainda assim, muitos protocolos de purificação requer um passo de prévia IEC devido à presença de contaminantes ou de agregação. Dado que a cada passo de concentração e cromatografia está associada a perdas de amostra (estimado em 30-50%) e no tempo, directa IEC-SAXS é vantajosa. Para amostras que não pode ser purificado por SEC, seja devido à presença de &quot;contaminantes&quot; de tamanho similar ou porque severamente agregado nas concentrações necessárias, IEC-SAXS seria sempre a melhor abordagem adequada. Além disso, as taxas de fluxo mais elevadas suportadopor muitos colunas IEC pode ajudar a reduzir o tempo de trânsito entre a purificação e de medição. No exemplo aqui apresentado, IEC foi usado com uma eluição de passo, que permite a separação dos picos próximos de 323-785 D5 de contaminantes, escolhendo cuidadosamente os passos de concentração de sal. Em princípio, o número de passos é ilimitado, mas na prática, é necessário pelo menos um passo de pico por, e não são muitas deve ser escolhido. Para o método de subtracção do fundo descrito acima, é fundamental para medir um número relativamente elevado de composições tampão diferentes a fim de encontrar a uma correspondência. A desvantagem compartilhada de ambas as técnicas é a falta de informações precisas concentração de proteína. Devido a isso, a determinação da massa precisa baseado em dispersão para a frente não é possível. Para as proteínas globulares, tais como D5 323-785, o volume Porod fornece uma alternativa, se bem que menos precisa estimativa, em massa, mas para proteínas altamente flexíveis ou desordenados, Esta abordagem não seria válido. Uma variação do gradiente passo a passo método IEC-SAXS aqui apresentada é a utilização de um gradiente linear em vez disso. Embora seja possível trabalhar com o maior número de passos, como desejado para isolar sub-picos utilizando uma eluição por passos, na abordagem gradiente linear, que é necessária para optimizar as condições de gradiente com cuidado, a fim de separar os picos inteiramente antes de iniciar o SAXS experimentar. A subtração nesta abordagem poderia ser feito frame-sábio e poderia ser verificada por meio da comparação dos quadros individuais, mas requer a manipulação de dados mais avançada e um software dedicado ainda não existe. A escolha de uma coluna adequada é crítica para ambas as técnicas, uma vez que determina a separação das espécies macromoleculares. colunas de exclusão de tamanho diferem na capacidade de carga, a gama de tamanho das macromoléculas separáveis, e resolução, enquanto que as colunas de permuta de iões pode variar com o tipo e a densidadede suas cargas imobilizadas. Embora o protocolo aqui apresentado é específico para a linha de luz ESRF BM29, a adaptação a qualquer outra linha de luz SAXS é, em princípio, simples. Os principais requisitos são um fluxo suficientemente elevado de raios-X e um detector adequado (de preferência um único fotão de contagem), para adquirir dados razoáveis ​​de sinal-para-ruído na gama de segundos ou menos, e um sistema de cromatografia líquida de linha capaz de criar gradientes. A aplicação exacta seria, naturalmente, dependem do ambiente de linha de luz local. Os resultados obtidos na D5 323-785 usando os dois métodos diferem ligeiramente. O raio de rotação é um pouco menor para os dados IEC do que para os dados de SEC, e os mínimos locais da curva de espalhamento são transferidas para vectores de dispersão um pouco maiores. Isto significa que a D5 323-785 medido com a IEC-SAXS é ligeiramente mais compacta do que a D5 323-785 medido com SEC-SAXS. Isto pode be, devido a diferenças na preparação da amostra, no tempo entre a purificação e medição (IEC é mais rápido), ou, menos provável, a um contaminante na amostra SEC-purificado. Os modelos de talão obtidos de forma totalmente independente, com ambos os métodos são comparáveis (Figura 1H). D5 323-785 mostra o, a estrutura hexamérica oca esperado 18. Em conclusão, permuta iónica e cromatografia em linha de exclusão de tamanho em linha são importantes os métodos de purificação bioquímicas que pode ser acoplado directamente ao 6,7,9-12,25,26 SAXS. A subtração de dados IEC-SAXS fundo é um pouco mais difícil e ambíguo do que para SEC-SAXS, mas não deixa de ser possível. Dependendo das propriedades biofísicas da proteína de interesse, tanto SEC e IEC-SAXS permitiria a optimização da separação das espécies com as vantagens inerentes. Fornecendo inteligência que os passos de validação (como descrito) estão correctamente observado, os dados resultantes podem ser analisadosh confiança, e os modelos podem ser determinados utilizando as ferramentas padrão disponíveis na comunidade. Em conjunto, ambas as técnicas de separação em linha para permitir que uma ampla gama de macromoléculas biológicas, obtendo-se os dados não acessíveis através de medições estáticas convencionais.

BioSAXS é uma ferramenta poderosa para determinar a forma de objectos de tamanho nano-1-4. A dispersão de raios-X por uma solução contendo macromoléculas, dimensionadas na gama nm, é gravado em ângulos muito baixos. Esta gama angular contém informações sobre parâmetros globais: o raio de giro; a maior distância intraparticular; A forma da partícula; e o grau de dobragem, a desnaturação, ou distúrbio. A técnica não requer cristais, e a macromolécula estadias em solução e, portanto, pode ser mantido em condições que imitam certos parâmetros importantes de célula, tais como força iónica, pH, etc. O conhecimento destes factores poderia ajudar a determinar, por exemplo, o estado oligomérico fisiologicamente relevante de uma proteína de interesse ou para validar um modelo proposto de um complexo. A caracterização de interacções proteína-proteína em diferentes condições de tampão, a criação de modelos de domínios em falta, o refinamento de modelos de homologia, e o derescisão de estados dobrada e desdobrada discretos podem ser realizadas rapidamente e facilmente 5. Tal como acontece com qualquer técnica, BioSAXS tem debilidades intrínsecas: Amostras de agregados ou desnaturados, misturas de partículas, amostras heterogéneas, os danos da radiação, e os desajustes de buffer pode resultar em dados un-interpretável. Para muitos métodos de análise, assume-se implicitamente que a amostra é monodispersa, um requisito que é muitas vezes difícil de obter na prática. Em muitos casos, a degradação da amostra é subtil e não pode ser detectado nos dados sobre o seu próprio, e qualquer tentativa para interpretar os dados dá resultados imprecisos ou mesmo enganosos. Para superar esses obstáculos, a combinação de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) e SAXS foi implementado em muitas linhas de luz para garantir a qualidade dos dados e tornar esta técnica mais acessível para as amostras de cada vez mais difíceis 6-11. Recentemente, nós adicionamos um novo método para o repertório através do desenvolvimento de íon-troca on-linecromatografia (IEC) -coupled SAXS 12. Ambas as técnicas são SAXS abertura para uma ampla gama de partículas biológicas anteriormente impossível analisar. A escolha de qual método usar depende das propriedades biofísicas das partículas de interesse. SEC separa macromoléculas pelo seu tamanho, em que é necessária pelo menos uma diferença de 10% na massa molecular aparente para a separação. limitações físicas da coluna e as propriedades fisiológicas das amostras, como superfícies hidrofóbicas, flexibilidade e falta de estabilidade, também complicam a coleta de dados, análise e interpretação. Cromatografia de permuta de iões, o que separa as moléculas com base na sua carga e, por conseguinte, a sua afinidade de ligação para a coluna de IEC, podem ser utilizados em vez de ou em adição a SEC. A carga total pode ser facilmente manipulado por alteração do pH, ou variando a concentração de sal do tampão, fornecendo um método relativamente simples para o el controladabuição das moléculas a partir da coluna de IEC. Ao utilizar a carga, a separação de tipos semelhantes e tamanhos de moléculas, que de outra forma seriam difíceis de separar, pode ser realizada rotineiramente com a norma IEC. Além disso, a IEC tem a vantagem de ser capaz de lidar com as amostras diluídas, permitindo que se possa evitar os passos de concentração, que carregam o risco potencial de desnaturação da proteína. Infelizmente, como a distribuição de carga é altamente amostra-dependente, IEC exige otimização quanto ao pH e as concentrações de sal 13,14. Para muitas proteínas que são difíceis de expressar, purificar, ou ambos, apenas pequenas quantidades de amostra estão disponíveis para estudar. É importante para ser eficaz e minimizar o número de passos de purificação e, por conseguinte, as perdas. Por esta razão, o último passo de purificação é directamente em linha antes da aquisição de dados de SAXS, a fim de aumentar a probabilidade de recolha de um bom conjunto de dados. Aqui, Apresentamos e comparar on-line SEC-SAXS e IEC-SAXS. Ambas as técnicas foram implementadas na linha de luz BioSAXS BM29 no European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) em Grenoble, França 15. Tal como um caso de teste, utilizou-se o domínio D5N e helicase da proteína do vírus vaccinia D5, que foi bastante difícil de analisar estruturalmente usando outros métodos. O vírus de vaccinia é um membro da família Poxviridae e é 98% idêntica ao vírus da varíola, a causa da varíola. Usando o sistema de vaccinia, estudamos o mecanismo de replicação, concentrando aqui no D5 essencial helicase-primase. D5 é uma proteína de 95 kDa com uma primase ARCHEO-eucariótica (AEP) do domínio N-terminal 16 seguida por uma região de grupos de cisteína (res. 240-345) 16. Mais na direcção da extremidade C-terminal vem um domínio D5N (res. 340-460), que está sempre associada com helicases do tipo D5, e, finalmente, uma superfamília 3 (PC3) domínio da helicase (res. 460-785) 17 (Figure 1A). O domínio da helicase da D5 constrói uma estrutura hexamérica anel que é necessário para a ligação forte ao ADN. Graças a recentes estudos de SAXS e EM, as estruturas de baixa resolução da primase e helicase os domínios são agora conhecidos 18. Aqui, vamos mostrar como usar as técnicas de cromatografia em linha implementadas na linha de luz BioSAXS BM29 no ESRF para obter insights sobre a estrutura do fragmento C-terminal (resíduos 323-785) de D5.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4 dithiothreitol [DTT]</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gel</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>4561033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Phusion Flash PCR Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>F 548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetic acid glacial</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>20104.298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose D-5</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>LF45130653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra -15 Centrifugal filters Ultracel -30K</td>
			<td>Millipore Ltd</td>
			<td>UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0400-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Novagene</td>
			<td>70750-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue&#160;</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>8122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete protease inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11231400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Pac 10 DG Desalting column</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>732-2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>24388.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-6405-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HindIII</td>
			<td>Roche</td>
			<td>656313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisSelect HF Nickel Affinity Gel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>20252.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>AppliChem Panreac</td>
			<td>A1073,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth Miller</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>L3152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc.</td>
			<td>191421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>27808.297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>ER0571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>C6010-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pProEx HTb vector&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>10711018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer</td>
			<td>&#160;Eurofins mwg operon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel extraction kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification kid</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>75746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 6 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5172-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA gel stain</td>
			<td>Invitrogen life technology</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 ligase</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>home made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOP 10</td>
			<td>Invitrogen life technology</td>
			<td>C404003&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uno Q 1R column&#160;</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>720 0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>MPBiomedicals, LLC</td>
			<td>194834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beamline control software BsXCuBE</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camserver software</td>
			<td>Dectris</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>detector control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAMAVER</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>program to align ab initio models&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAMMIF</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>ab initio&#160; model reconstruction programm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC program Biologic Duo Flow</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC program LabSolutions</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPyB</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85.</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMUS</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>program, which performs the manipulation with experimental SAXS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyMOL</td>
			<td>DeLano Scientific LLC</td>
			<td>https://www.pymol.org/</td>
			<td>software for visualization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPCOMB</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>program to superimpose 3D structures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLogic Duo Flow</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLogic Biofrac Fraction collector</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC system</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labsonic P</td>
			<td>Sartorius Stedim biotech</td>
			<td>BBI8535108</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

online size-exclusion and ion-exchange chromatography on a saxs beamline

pequeno ângulo de dispersão de raios X Biológica (BioSAXS) é uma técnica poderosa em biologia molecular e estrutural usado para determinar a estrutura solução, tamanho e forma das partículas, e a relação de superfície-para-volume de macromoléculas. A técnica é aplicável a uma ampla variedade de condições de solução que abrangem uma ampla gama de concentrações, valores de pH, temperaturas, forças iónicas, aditivos, etc., mas a amostra é necessário para ser monodispersa. Esta ressalva levou à implementação de sistemas de cromatografia líquida de linhas de luz SAXS. Aqui, nós descrevemos a integração a montante do de exclusão de tamanho (SEC) e a cromatografia de permuta iónica (IEC) numa linha de luz, métodos diferentes para a subtracção de fundo óptima, e a redução de dados. Como exemplo, descreve-se como usamos sec- e IEC-SAXS em um fragmento da proteína do vírus vaccinia essencial D5, que consiste de um domínio D5N helicase. Determinamos a sua forma global e o peso molecular, que mostra a estrutura hexamérica de the proteína.

Os resultados da análise invariante livre de modelo estão listadas na Tabela 1. A análise dos dados de SEC-323-785 SAXS D5 mostrou uma estimativa da massa molecular (a partir de uma análise Porod) de 345 kDa contra 338 kDa, observada utilizando IEC-SAXS. Ambos estão de acordo com a massa esperada de 6 vezes de 53,5 kDa (321 kDa) para um hexâmero. A modelagem ab initio de ambos os conjuntos de dados foi realizada sem simetria imposta (SEC-SAXS: χ 2 = 0,88, IEC-SAXS: χ 2 = 3.1) e utilizando simetria C6 (SEC-SAXS: χ 2 = 1,0, IEC-SAXS : χ 2 = 4). Como os ataques gerais para os dados de dispersão para ambas as reconstruções são comparáveis em ambos os casos (Figura 1D e E), C6 simetria pode ser assumida. Assim, o modelo corresponde a uma estrutura semelhante a cone hexagonal com um canal central, que aparece parcialmente obstruída (SEC: Figura 1F; IEC: <strong&gt; Figura 1G, sobreposição Figura 1H). Um exame dos modelos individuais antes de média mostra que esta obstrução é provável que seja um artefacto do processo de cálculo da média. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54861/54861fig1x.jpg" /> Figura 1: análise de dados de SAXS e comparação de D5 323 -785 (Figura adaptada de referências 12 e 18). A) Esquema de estrutura do domínio de proteína D5 e D5 323-785. B) cromatograma off-line de troca iônica com a indicação dos três picos. curva de laranja: Absorvância a 280 nm (UA), a curva azul: percentagem de tampão B. As percentagens de tampão B no lado dos picos são indicadas. C) Online cromatograma de permuta iónica. tecla colorida como em B. Além disso, a intensidade medida é indicado em verde. A dispersão experimental curva de umND calculada curva do modelo obtido por SEC-D SAXS) e IEC e) Análise de dados de D5 323-785. Modelo F) Bead de D5 323-785 com base em dados da SEC e dados G) IEC. H) Sobreposição dos modelos da SEC e da IEC. Os painéis em F) para H) foram criados usando um software de visualização molecular 24. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54861/54861fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Parâmetros de coleta de dados </td><td></td></tr><tr><td> Instrumento: </td><td> ESRF BM29 </td></tr><tr><td> Comprimento de onda (A) </td><td> 0.99 </td></tr><tr><td> q-range (-1) </td><td> ,0032-,49 </td></tr><tr><td> Sample-to-detector distância </td><td> 2.864 m </td></tr><tr><td> Tempo de exposição (seg) </td><td> 1 por quadro </td></tr><tr><td> intervalo de concentração </td><td> n / D </td></tr><tr><td> Temperatura (K) </td><td> 293 </td></tr><tr><td> detetor </td><td> Pilatus 1M (Dectris) </td></tr><tr><td> Flux (fótons / s) </td><td> 1 × 10 12 </td></tr><tr><td> Tamanho do feixe (2 uM) </td><td> 700 × 700 </td></tr><tr><td> Parâmetros estruturais para D5 323-785, SEC </td><td></td></tr><tr><td> I 0 (cm-1) [a partir de Guinier] </td><td> 0,0237 </td></tr><tr><td> Rg (a) [a partir Guinier] </td><td> 48 </td></tr><tr><td> q min R g - q max R g usado para Guinier </td><td> 0,77-1,24 </td></tr><tr><td> D max (a) [a partir de P (R)] </td><td> 145 </td></tr><tr><td> Q-gama utilizada para P (r) (A-1)</td><td> 0,02-0,17 </td></tr><tr><td> Porod volume V P (A 3) [do Scatter] </td><td> (570 ± 5) x 10 3 </td></tr><tr><td> Massa molecular M r (kDa) [a partir de V P] </td><td> 345 </td></tr><tr><td> Calculado monomérica senhor da sequência (kDa) </td><td> 321 </td></tr><tr><td> Parâmetros estruturais para D5 323-785, IEC </td><td></td></tr><tr><td> I 0 (cm-1) [a partir de Guinier] </td><td> 0,386 </td></tr><tr><td> Rg (a) [a partir Guinier] </td><td> 46,5 ± 0,1 </td></tr><tr><td> q min R g - q max R g usado para Guinier </td><td> 0,44-1,29 </td></tr><tr><td> D max (a) [a partir de P (R)] </td><td> 120 </td></tr><tr><td> Q-gama utilizada para P (r) (A-1) </td><td> ,03-0,18 </td></tr><tr><td> Porod volume V P (&amp; #197; 3) [a partir de Dispersão] </td><td> (577 ± 5) × 10 3 </td></tr><tr><td> Massa molecular M r (kDa) [a partir de V P] </td><td> 339 </td></tr><tr><td> Calculado hexamérica senhor da sequência (kDa) </td><td> 321 </td></tr></tbody></table> Tabela 1: parâmetros de dados de SAXS. A tabela resume os parâmetros de aquisição de dados e análise de SAXS.

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Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

A determinação da estrutura da solução de proteína por um pequeno ângulo de dispersão de raios-X (SAXS) requer amostras monodispersas. Aqui, apresentamos duas possibilidades para assegurar atrasos mínimos entre a preparação da amostra e aquisição de dados: cromatografia em linha de exclusão de tamanho (SEC) e cromatografia de troca iônica em linha (IEC).

On-line Tamanho-exclusão e cromatografia de troca iônica em uma SAXS Beamline

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

resolvida no tempo com ionização por electrospray Hidrogénio-deutério troca Espectrometria de Massa para estudar a estrutura e dinâmica das proteínas

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Bioquímica

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Um método simples para High Throughput Screening químico em Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Digestão de proteínas, ultrafiltração e cromatografia de exclusão para otimizar o isolamento do Exosomes do Plasma de sangue humano e soro

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

Cromatografia de troca iónica (IEX) acoplada ao multi-ângulo espalhamento de luz (MALS) para caracterização e separação de proteínas

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Caracterização de proteínas por cromatografia de exclusão de tamanho acoplada ao espalhamento de luz Multiangulares (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Cultura celular em membranas de nitreto de silício e criopreparação para a fluorescência de raios-X synchrotron Nano-análise

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Análise de metabolômica baseada em espectrometria líquida não direcionada

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

Análise dos dados da SEC-SAXS via desconvolução e dispersão da EFA

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Análise semiquantitativa de peptidoglicanos por cromatografia líquida, espectrometria de massas e bioinformática

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Um pipeline de preparação de amostras para microcristais na linha de feixe VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...