Name: online size-exclusion and ion-exchange chromatography on a saxs beamline
Uploaded: 2017-01-05T12:30:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline at JoVE.com

We acknowledge financial support for the project from the French grant REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 and by research grants from the Service de Sant&#233; des Arm&#233;es and the D&#233;l&#233;gation G&#233;n&#233;rale pour l'Armement. We are thankful to the ESRF for the SAXS beam time. We thank Andrew McCarthy, Gordon Leonard, Wim Burmeister, and Guy Schoehn for financial and scientific support.

<ol>
	<li>Graewert, M. A., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+and+progress+in+small+and+wide+angle+X-ray+scattering+(SAXS+and+WAXS).">Impact and progress in small and wide angle X-ray scattering (SAXS and WAXS).</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 23, 748-754 (2013).</li><li>Jacques, D. A., Trewhella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-angle+scattering+for+structural+biology-Expanding+the+frontier+while+avoiding+the+pitfalls.">Small-angle scattering for structural biology-Expanding the frontier while avoiding the pitfalls.</a> Protein Sci. 19, 642-657 (2010).</li><li>Kikhney, A. G., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+small+angle+X-ray+scattering+(SAXS)+of+flexible+and+intrinsically+disordered+proteins.">A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins.</a> FEBS Lett. 589, 2570-2577 (2015).</li><li>Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+solution+scattering+(SAXS)+combined+with+crystallography+and+computation:+defining+accurate+macromolecular+structures,+conformations+and+assemblies+in+solution.">X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution.</a> Q. Rev. Biophys. 40, 191-285 (2007).</li><li>Vestergaard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+biostructural+changes,+dynamics,+and+interactions+-+Small-angle+X-ray+scattering+to+the+rescue.">Analysis of biostructural changes, dynamics, and interactions - Small-angle X-ray scattering to the rescue.</a> Arch. Biochem. Biophys. , (2016).</li><li>David, G., P&#233;rez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+sampler+robot+and+high-performance+liquid+chromatography:+a+fully+automated+system+for+biological+small-angle+X-ray+scattering+experiments+at+the+Synchrotron+SOLEIL+SWING+beamline.">Combined sampler robot and high-performance liquid chromatography: a fully automated system for biological small-angle X-ray scattering experiments at the Synchrotron SOLEIL SWING beamline.</a> J. Appl. Crystallogr. 42, 892-900 (2009).</li><li>Graewert, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Pipeline+for+Purification,+Biophysical+and+X-Ray+Analysis+of+Biomacromolecular+Solutions.">Automated Pipeline for Purification, Biophysical and X-Ray Analysis of Biomacromolecular Solutions.</a> Sci. Rep. 5, (2015).</li><li>Lambright, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+techniques+enhance+the+quality+and+scope+of+information+obtained+from+SAXS.">Complementary techniques enhance the quality and scope of information obtained from SAXS.</a> ACA Trans. , 1-12 (2013).</li><li>Mathew, E., Mirza, A., Menhart, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-chromatography-coupled+SAXS+for+accurate+sizing+of+aggregating+proteins.">Liquid-chromatography-coupled SAXS for accurate sizing of aggregating proteins.</a> J. Synchrotron Radiat. 11, 314-318 (2004).</li><li>Round, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+GH3.+12+protein+conformation+through+HPLC-integrated+SAXS+measurements+combined+with+X-ray+crystallography.">Determination of the GH3. 12 protein conformation through HPLC-integrated SAXS measurements combined with X-ray crystallography.</a> Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 69, 2072-2080 (2013).</li><li>Watanabe, Y., Inoko, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-exclusion+chromatography+combined+with+small-angle+X-ray+scattering+optics.">Size-exclusion chromatography combined with small-angle X-ray scattering optics.</a> J. Chromatogr. 1216, 7461-7465 (2009).</li><li>Hutin, S., Brennich, M. E., Maillot, B., Round, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+ion-exchange+chromatography+for+small+angle+X-ray+scattering.">Online ion-exchange chromatography for small angle X-ray scattering.</a> Acta Cryst. , (2016).</li><li>Selkirk, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion-exchange+chromatography.">Ion-exchange chromatography.</a> Protein Purification Protocols. , 125-131 (2004).</li><li>Yigzaw, Y., Hinckley, P., Hewig, A., Vedantham, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+exchange+chromatography+of+proteins+and+clearance+of+aggregates.">Ion exchange chromatography of proteins and clearance of aggregates.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 10, 421-426 (2009).</li><li>Pernot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upgraded+ESRF+BM29+beamline+for+SAXS+on+macromolecules+in+solution.">Upgraded ESRF BM29 beamline for SAXS on macromolecules in solution.</a> J. Synchrotron Radiat. 20, 660-664 (2013).</li><li>Iyer, L. M., Koonin, E. V., Leipe, D. D., Aravind, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+evolution+of+the+archaeo-eukaryotic+primase+superfamily+and+related+palm-domain+proteins:+structural+insights+and+new+members.">Origin and evolution of the archaeo-eukaryotic primase superfamily and related palm-domain proteins: structural insights and new members.</a> Nucleic Acids Res. 33, 3875-3896 (2005).</li><li>Singleton, M. R., Dillingham, M. S., Wigley, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+helicases+and+nucleic+acid+translocases.">Structure and mechanism of helicases and nucleic acid translocases.</a> Annu. Rev. Biochem. 76, 23-50 (2007).</li><li>Hutin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+organization+of+vaccinia+virus+helicase-primase+D5.">Domain organization of vaccinia virus helicase-primase D5.</a> J. Virol. , 4604-4613 (2016).</li><li>Round, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioSAXS+Sample+Changer:+a+robotic+sample+changer+for+rapid+and+reliable+high-throughput+X-ray+solution+scattering+experiments.">BioSAXS Sample Changer: a robotic sample changer for rapid and reliable high-throughput X-ray solution scattering experiments.</a> Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 71, 67-75 (2015).</li><li>De Maria Antolinos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISPyB+for+BioSAXS,+the+gateway+to+user+autonomy+in+solution+scattering+experiments.">ISPyB for BioSAXS, the gateway to user autonomy in solution scattering experiments.</a> Acta Crystallographica Section D. 71, 76-85 (2015).</li><li>Brennich, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+data+analysis+at+the+ESRF+bioSAXS+beamline,+BM29.">Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29.</a> J. Appl. Crystallogr. 49, (2016).</li><li>Petoukhov, M. V., Konarev, P. V., Kikhney, A. G., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATSAS+2.1-towards+automated+and+web-supported+small-angle+scattering+data+analysis.">ATSAS 2.1-towards automated and web-supported small-angle scattering data analysis.</a> J. Appl. Crystallogr. 40, 223-228 (2007).</li><li>Franke, D., Jeffries, C. M., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+Map,+a+goodness-of-fit+test+for+one-dimensional+X-ray+scattering+spectra.">Correlation Map, a goodness-of-fit test for one-dimensional X-ray scattering spectra.</a> Nat. Methods. 12, 419-422 (2015).</li><li>Schrodinger, LLC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8. , (2015).</li><li>Jensen, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+SAXS+measurements+facilitated+by+online+HPLC+buffer+exchange.">Time-resolved SAXS measurements facilitated by online HPLC buffer exchange.</a> J. Synchrotron Radiat. 17, 769-773 (2010).</li><li>Hynson, R. M., Duff, A. P., Kirby, N., Mudie, S., Lee, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ultracentrifugation+coupled+to+small-angle+X-ray+scattering+on+macromolecular+complexes.">Differential ultracentrifugation coupled to small-angle X-ray scattering on macromolecular complexes.</a> J. Appl. Crystallogr. 48, 769-775 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Для многих макромолекул, конечная стадия очистки с использованием хроматографии требуется до сбора данных МУРР для получения хорошего качества набора данных. Однако, не все образцы остаются стабильными; они могут быть склонны к агрегации или переуравновешивания к смеси олигомеризации состояниях. Таким образом, окончательный онлайн стадию очистки на пучкового требуется, чтобы свести к минимуму время между очисткой и сбора данных для того, чтобы получить данные МУРР качества лучше всего. В зависимости от биофизических свойств белка, представляющего интерес, втор-МУРР или МЭК-МУРР могут быть выбраны для получения оптимального качества образцов. Здесь, на белковой конструкции, полученной из хеликаза / праймаза D5, оба метода объяснены и обсуждены. Получение данных SEC-МУРР становится все более и более стандартизированной и доступен на многих BioSAXS beamlines. Анализ данных, особенно вычитание фона, является относительно простым и легким. Тем не менее, устойчивый сигнал буфераи достаточное разделение макромолекулярных видов остается существенным. Поэтому очень важно выделить достаточно времени, чтобы тщательно уравновешиванию колонку. Несоблюдение этого метода может быть из-за стойких загрязнителей аналогичного размера до интересующего белка, низких концентрациях, а также радиационно-чувствительных буферов. На практике, первоначально, втор-МУРР, скорее всего, будет использоваться в качестве метода выбора для большинства макромолекулярных образцов. Тем не менее, многие протоколы очистки требуют предварительного IEC шаг в связи с наличием загрязняющих веществ или агрегации. Учитывая, что каждая концентрация и хроматография шаг связан с потерями образца (по оценкам, на 30-50%), а также время, прямое МЭК-МУРР является выгодным. Для образцов, которые не могут быть очищены с помощью SEC, будь то из-за наличия аналогичного размера «загрязняющие вещества», или потому, что они сильно агрегатный в необходимых концентрациях, МЭК-МУРР всегда был бы лучше подходит подход. Кроме того, поддерживаются более высокие скорости потокамногие IEC колонки может помочь сократить время перехода между очистки и измерения. В примере , представленном здесь, IEC был использован с шагом элюирования, что позволяет для разделения близких пиков Д5 323-785 от загрязнений, тщательно выбирая шаги концентрации соли. В принципе, число шагов не ограничено, но практически, по крайней мере, 1 шаг за пика требуется, и не слишком многие из них должны быть выбраны. Для метода вычитания фона, описанного выше, важно, чтобы измерить относительно большое количество различных буферных композиций для того, чтобы найти соответствующий один. Общий недостаток обоих методов является отсутствие точной информации концентрации белка. В связи с этим, точное определение массы основано на рассеянии вперед не представляется возможным. Для глобулярных белков , таких как D5 323-785, объем Порода представляет собой альтернативу, хотя и менее точной, массовой оценки, но для очень гибких или неупорядоченных белков, Этот подход не будет действительным. Разновидностью пошаговый градиентного метода IEC-МУРР представленной здесь является использование линейного градиента вместо. В то время как можно работать с таким количеством шагов, как желательно выделить суб-пиков, используя ступенчатое элюирование в линейном градиенте подходе, необходимо тщательно оптимизировать условия градиента для того, чтобы разделить пики полностью перед запуском SAXS эксперимент. Вычитание фона при таком подходе можно было бы сделать покадровой и может быть проверена путем сравнения отдельных кадров, но это требует более продвинутой обработки данных, а также специализированное программное обеспечение еще не существует. Выбор подходящего столбца имеет решающее значение для обоих методов, поскольку он определяет разделение макромолекул рных видов. Вытеснительной колонки различаются по грузоподъемности, в диапазоне размеров отделяемых макромолекул и разрешением, в то время как ионообменные колонки различаются от вида и плотностиих иммобилизованных зарядов. Хотя протокол, представленные здесь, специфичные для ESRF пучкового BM29, адаптация к любым другим МУРР пучкового, в принципе, простой. Основными требованиями являются достаточно высокий поток рентгеновского излучения и подходящий детектор (в идеале однофотонный подсчета), чтобы получить приемлемые данные сигнал-шум в диапазоне секунд или меньше, и система онлайн-хроматографии жидкости, способной создавать градиенты. Конкретная реализация будет, конечно, зависеть от локальной среды пучкового. Результаты , полученные на d5 323-785 с использованием двух методов незначительно отличаются. Радиус инерции немного меньше для данных IEC, чем для данных SEC, а локальные минимумы кривой рассеяния смещаются немного больше векторов рассеяния. Это означает , что Д5 323-785 измеренная с IEC-МУР немного более компактным , чем Д5 323-785 , измеренной с помощью втор-МУР. Это может бе из-за различий в процессе подготовки образца, в то время между очисткой и измерения (МЭК быстрее), или, что менее вероятно, к загрязнителя в SEC-очищенного образца. Модели из бисера , полученные полностью независимо друг от друга с обоими методами сопоставимы (рис 1H). D5 323-785 показывает ожидаемую полую структуру гексамерных 18. В заключение, онлайн ионообменная и онлайн исключением по размеру хроматографии , являются важными биохимические методы очистки , которые могут быть соединены непосредственно с МУР 6,7,9-12,25,26. Фоновый Вычитание данных МЭК-МУРР является немного более сложным и неоднозначным, чем для SEC-МУР, но тем не менее это возможно. В зависимости от биофизических свойств белка, представляющего интерес, как SEC и МЭК-МУРР позволит оптимизировать видового разделения с присущими им преимуществами. При условии, что правильно соблюдены этапы проверки (как описано), полученные данные можно анализировать остроумиеч уверенность и модели могут быть определены с помощью стандартных инструментов, доступных в рамках сообщества. Вместе обе методики позволяют онлайн разделения для широкого спектра биологических макромолекул, получая данные не были доступны через стандартные статические измерения.

BioSAXS является мощным инструментом для определения формы наноразмерных объектов 1-4. Рассеяние рентгеновских лучей раствором, содержащим макромолекулы, размера в диапазоне нм, регистрируется при очень малых углах. Этот угловой диапазон содержит информацию о глобальных параметров: радиуса инерции; наибольшее расстояние внутричастичного; форма частиц; и степень складывания, денатурации или расстройства. Методика не требует кристаллов, а макромолекула остается в растворе и , таким образом , могут быть сохранены в условиях , имитирующих некоторые важные параметры клетки, такие как ионная сила, рН и т.д. Знание этих факторов может помочь определить, например, физиологически соответствующие олигомерные состояние интересующего белка или для проверки предложенной модели комплекса. Характеристика белок-белковых взаимодействий в различных буферных условиях, создание моделей недостающих доменов, уточнение моделей гомологии и депрекращение дискретных свернутых и развернутых состояний может быть выполнена быстро и легко 5. Как и с любой техникой, BioSAXS имеет внутренние слабости: агрегированные или денатурированные образцы, смеси частиц, гетерогенные образцы, радиационных повреждений и буфер рассогласования может привести к не-интерпретируемых данных. Для многих методов анализа, неявно предполагается, что образец монодисперсных, причем это требование зачастую трудно получить на практике. Во многих случаях деградация образца является тонким и не может быть обнаружен в данных по своей собственной, и любая попытка интерпретировать данные дает неточные или даже ошибочные результаты. Для преодоления этих препятствий, сочетание размера вытеснительной хроматографии (SEC) и МУР была реализована на многих beamlines для обеспечения качества данных и сделать эту технику более доступной для более сложных образцов 6-11. Недавно мы добавили новый метод в репертуар путем разработки онлайн-ионного обменахроматографии (IEC) -coupled МУРР 12. Обе технологии открывают SAXS для широкого спектра биологических частиц, ранее невозможно анализировать. Выбор используемого способа зависит от биофизических свойств частиц, представляющих интерес. SEC разделяет макромолекулы по их размеру, причем, по меньшей мере, 10% разницы в кажущейся молекулярной массы, необходимой для разделения. Физические ограничения столбца и физиологических свойств образцов, как гидрофобных поверхностей, гибкость и отсутствие стабильности, а также осложнить сбор данных, анализ и интерпретацию. Ионообменная хроматография, которая отделяет молекулы на основе их заряда и, следовательно, их аффинность связывания с колонкой IEC, могут быть использованы вместо или в дополнение к SEC. Полный заряд может быть легко манипулировать путем изменения рН или изменения концентрации соли в буфере,, обеспечивая относительно простой метод контролируемой эльсоциологическое загрязнение молекул из колонки IEC. Используя заряд, разделение подобных типов и размеров молекул, которые иначе были бы трудно отделить, могут быть выполнены обычно с МЭК. Кроме того, МЭК имеет то преимущество, что в состоянии справиться с разбавленных образцов, позволяя избежать стадии концентрирования, которые несут потенциальный риск денатурации белка. К сожалению, поскольку распределение заряда сильно выборки зависит, МЭК требует оптимизации в отношении рН и концентрации соли 13,14. Для многих белков, которые трудно выразить, очистить, или оба, только низкие количества образца доступны для изучения. Важно, чтобы быть эффективными и свести к минимуму количество стадий очистки, и, следовательно, потери. По этой причине последний этап очистки в Интернете непосредственно до сбора данных МУРР, с тем чтобы повысить вероятность сбора хорошего набора данных. ВотМы представляем и сравнить онлайн SEC-SAXS и IEC-SAXS. Оба метода были реализованы на BioSAXS пучкового BM29 на европейском синхротронного излучения (ESRF) в Гренобле, Франция 15. В качестве тестового примера, мы использовали D5N и хеликазную домен белка вируса коровьей D5, который был довольно трудно анализировать конструктивно с использованием других методов. Вирус коровьей оспы является членом семьи Poxviridae и 98% идентична вируса натуральной оспы, причиной оспа. Используя систему коровьей, мы изучаем механизм репликации, сосредоточив здесь на существенной хеликаза-праймаза D5. Д5 представляет собой белок 95-кДа с N-концевым Archeo-эукариотической праймаза (AEP) доменов 16 , за которым следует область цистеин кластера (Рез. 240-345) 16. Далее по направлению к С-концу приходит домена D5N (Рез. 340-460), который всегда связан с геликаз Д5 типа, и , наконец , суперсемейством 3 (SF3) хеликаза домена (Рез. 460-785) 17 (Figurе 1А). Домен хеликаза из D5 строит гексамерных кольцевую структуру, которая необходима для плотного связывания с ДНК. Благодаря последним исследованиям МУРР и ЭМ, структуры с низким разрешением о праймаза и геликазы домены В настоящее время известны 18. Здесь мы покажем, как использовать реализованные онлайновые методы хроматографии на BioSAXS пучкового BM29 в ESRF, чтобы получить представление о структуре С-концевого фрагмента (остаток 323-785) из D5.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4 dithiothreitol [DTT]</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gel</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>4561033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Phusion Flash PCR Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>F 548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetic acid glacial</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>20104.298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose D-5</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>LF45130653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra -15 Centrifugal filters Ultracel -30K</td>
			<td>Millipore Ltd</td>
			<td>UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0400-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Novagene</td>
			<td>70750-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue&#160;</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>8122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete protease inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11231400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Pac 10 DG Desalting column</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>732-2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>24388.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-6405-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HindIII</td>
			<td>Roche</td>
			<td>656313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisSelect HF Nickel Affinity Gel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>20252.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>AppliChem Panreac</td>
			<td>A1073,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth Miller</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>L3152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc.</td>
			<td>191421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>27808.297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>ER0571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>C6010-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pProEx HTb vector&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>10711018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer</td>
			<td>&#160;Eurofins mwg operon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel extraction kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification kid</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>75746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 6 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5172-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA gel stain</td>
			<td>Invitrogen life technology</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 ligase</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>home made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOP 10</td>
			<td>Invitrogen life technology</td>
			<td>C404003&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uno Q 1R column&#160;</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>720 0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>MPBiomedicals, LLC</td>
			<td>194834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beamline control software BsXCuBE</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camserver software</td>
			<td>Dectris</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>detector control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAMAVER</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>program to align ab initio models&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAMMIF</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>ab initio&#160; model reconstruction programm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC program Biologic Duo Flow</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC program LabSolutions</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPyB</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85.</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMUS</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>program, which performs the manipulation with experimental SAXS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyMOL</td>
			<td>DeLano Scientific LLC</td>
			<td>https://www.pymol.org/</td>
			<td>software for visualization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPCOMB</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>program to superimpose 3D structures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLogic Duo Flow</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLogic Biofrac Fraction collector</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC system</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labsonic P</td>
			<td>Sartorius Stedim biotech</td>
			<td>BBI8535108</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

online size-exclusion and ion-exchange chromatography on a saxs beamline

Биологический малый угол рассеяния рентгеновских лучей (BioSAXS) является мощным средством в области молекулярной и структурной биологии используется для определения структуры раствора, размера и формы частиц, а также отношение поверхности к объему макромолекул. Методика применима к очень широким разнообразием условий решений , охватывающих широкий диапазон концентраций, значений рН, ионной силы, температуры, добавки и т.д., но образец должен быть монодисперсных. Это предостережение привело к реализации жидких систем-хроматографии на МУРР beamlines. Здесь мы описываем вверх по течению интеграции исключением по размеру (SEC) и ионообменной хроматографии (IEC) на пучкового, различные методы для оптимального вычитание фона и сокращение данных. В качестве примера, мы опишем, как мы используем втор- и IEC-SAXS на фрагменте основной вирус коровьей белка D5, состоящий из домена D5N геликазной. Мы определяем его общую форму и молекулярную массу, показывая гексамерных структуру йе белка.

Результаты безмодельного инвариантного анализа приведены в таблице 1. Анализ 323-785 данных Д5 SEC-МУРР показал молекулярную массу оценку (от анализа) Порода 345 кДа по сравнению с 338 кДа, наблюдаемые с помощью IEC-SAXS. Оба находятся в согласии с ожидаемой массой 6 раз 53,5 кДа (321 кДа) для гексамере. Из первых принципов моделирования аб обоих наборов данных была проведена без каких - либо наложены симметрии (SEC-МУР: χ 2 = 0,88, IEC-МУРР: х 2 = 3,1) и с использованием C6 симметрии (SEC-SAXS: χ 2 = 1,0, IEC-МУРР : χ 2 = 4). По мере того как общие подходит к данным рассеяния для обеих реконструкций сопоставимы в обоих случаях (рис 1D и Е), C6 симметрии можно предположить. Таким образом, модель соответствует гексагональной конусообразной структуры с центральным каналом, который появляется частично закупорен (SEC: Рисунок 1F; IEC: <strОнг&gt; Рисунок 1G, наложение Рисунок 1H). Изучение отдельных моделей до усреднения показывает, что это препятствие может быть артефактом процесса усреднения. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/54861/54861fig1x.jpg" /> Рисунок 1: анализ данных МУРР и сравнение D5 323 -785 (рисунок адаптирован из Список литературы 12 и 18). А) Схематическое доменная структура белка D5 и D5 323-785. B) Офлайн ионообменной хроматограммы с указанием трех пиков. Оранжевый кривая: поглощение при длине волны 280 нм (Au), синяя кривая: процент буфера B. Процентами буфера В на вершинах указаны. C) Интернет ионообменной хроматограммы. Цвет ключа, как в В. Кроме того, измеренная интенсивность обозначается зеленым цветом. Экспериментальное рассеяние кривая ай расчетной кривой модели , полученной с помощью SEC-МУР D) и IEC E) анализа данных D5 323-785. F) Бусина модель D5 323-785 на основе данных SEC и данных G) МЭК. H) Накладка моделей SEC и МЭК. Панели в F) в H) были созданы с использованием программного обеспечения молекулярной визуализации 24. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54861/54861fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54861/54861fig1large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54861/54861fig1large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Параметры по сбору данных </td><td></td></tr><tr><td> Прибор: </td><td> ESRF BM29 </td></tr><tr><td> Длина волны (Å) </td><td> 0,99 </td></tr><tr><td> Q-диапазон (Å -1) </td><td> 0,0032 - 0,49 </td></tr><tr><td> Образец к детектору расстояния </td><td> 2,864 м </td></tr><tr><td> Время экспозиции (сек) </td><td> 1 за один кадр </td></tr><tr><td> интервал концентрации </td><td> не доступно </td></tr><tr><td> Температура (K) </td><td> 293 </td></tr><tr><td> детектор </td><td> Pilatus 1M (Dectris) </td></tr><tr><td> Поток (фотонов / с) </td><td> 1 × 10 12 </td></tr><tr><td> Размер луча (мкм 2) </td><td> 700 × 700 </td></tr><tr><td> Структурные параметры для D5 323-785, SEC </td><td></td></tr><tr><td> I 0 (см -1) [от Гинье] </td><td> 0,0237 </td></tr><tr><td> Rg (Å) [от Гинье] </td><td> 48 </td></tr><tr><td> д мин R г - д макс R г используется для Гинье </td><td> 0,77 - 1,24 </td></tr><tr><td> D макс (Å) [от р (г)] </td><td> 145 </td></tr><tr><td> Q-диапазон , используемый для р (г) (Å -1)</td><td> 0,02 - 0,17 </td></tr><tr><td> Объем V Порода р (А 3) [от рассыпного] </td><td> (570 ± 5) × 10 3 </td></tr><tr><td> Молекулярная масса М г (кДа) [от V р] </td><td> 345 </td></tr><tr><td> Рассчитано мономерный Mr из последовательности (кД) </td><td> 321 </td></tr><tr><td> Структурные параметры для D5 323-785, IEC </td><td></td></tr><tr><td> I 0 (см -1) [от Гинье] </td><td> 0,386 </td></tr><tr><td> Rg (Å) [от Гинье] </td><td> 46,5 ± 0,1 </td></tr><tr><td> д мин R г - д макс R г используется для Гинье </td><td> 0,44 - 1,29 </td></tr><tr><td> D макс (Å) [от р (г)] </td><td> 120 </td></tr><tr><td> Q-диапазон , используемый для р (г) (Å -1) </td><td> 0,03 - 0,18 </td></tr><tr><td> Объем V Порода р (&amp; #197; 3) [от рассыпного] </td><td> (577 ± 5) × 10 3 </td></tr><tr><td> Молекулярная масса М г (кДа) [от V р] </td><td> 339 </td></tr><tr><td> Рассчитано гексамерный Mr из последовательности (кД) </td><td> 321 </td></tr></tbody></table> Таблица 1: Параметры данных МУРР. В следующей таблице приведены параметры сбора МУРР и анализа данных.

Watch this Scientific Journal Video about Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline at JoVE.com

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

Определение структуры раствора белка с помощью малоуглового рассеяния рентгеновских лучей (МУРР) требует монодисперсных образцов. Здесь мы представляем две возможности, чтобы обеспечить минимальные задержки между подготовки проб и сбора данных: онлайн с исключением по размеру хроматографии (SEC) и онлайн ионообменной хроматографии (IEC).

Интернет эксклюзионной и ионообменной хроматографии на МУРР пучкового

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Времяразрешенная ионизацией электрораспылением водорода дейтерий Обмен масс-спектрометрии для изучения белка структуры и динамики

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Простой метод для высокой пропускной способности химического скрининга в Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Переваривание белков, ультрафильтрации и гель-проникающей хроматографии размер для оптимизации изоляции Exosomes из человеческой плазмы крови и сыворотки

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

Ионообменной хроматографии (IEX) в сочетании с мульти-угол рассеяния света (MALS) для разделения белков и характеристика

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Характеристика белков по размеру-исключение хроматографии в сочетании с многоугловой рассеяния света (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Клеточная культура на силиконовых нитридных мембранах и криопрепарат для синхротронного рентгеновского флуоресценции Нано-анализа

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Нецелевая жидкая хроматография-масс-спектрометрия на основе метаболомики Анализ зерна пшеницы

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

Анализ данных SEC-SAXS с помощью деконволюции и рассеяния EFA

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Полуколичественный анализ пептидогликана методами жидкостной хроматографии, масс-спектрометрии и биоинформатики

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Конвейер пробоподготовки микрокристаллов на лучевой линии VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...