Name: online size-exclusion and ion-exchange chromatography on a saxs beamline
Uploaded: 2017-01-05T12:30:00
Duration: 11 min 9 s
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We acknowledge financial support for the project from the French grant REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 and by research grants from the Service de Sant&#233; des Arm&#233;es and the D&#233;l&#233;gation G&#233;n&#233;rale pour l'Armement. We are thankful to the ESRF for the SAXS beam time. We thank Andrew McCarthy, Gordon Leonard, Wim Burmeister, and Guy Schoehn for financial and scientific support.

<ol>
	<li>Graewert, M. A., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+and+progress+in+small+and+wide+angle+X-ray+scattering+(SAXS+and+WAXS).">Impact and progress in small and wide angle X-ray scattering (SAXS and WAXS).</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 23, 748-754 (2013).</li><li>Jacques, D. A., Trewhella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-angle+scattering+for+structural+biology-Expanding+the+frontier+while+avoiding+the+pitfalls.">Small-angle scattering for structural biology-Expanding the frontier while avoiding the pitfalls.</a> Protein Sci. 19, 642-657 (2010).</li><li>Kikhney, A. G., Svergun, D. 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P., Kirby, N., Mudie, S., Lee, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ultracentrifugation+coupled+to+small-angle+X-ray+scattering+on+macromolecular+complexes.">Differential ultracentrifugation coupled to small-angle X-ray scattering on macromolecular complexes.</a> J. Appl. Crystallogr. 48, 769-775 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Para muchas macromoléculas, una etapa de purificación final utilizando cromatografía se requiere antes de la recolección de datos SAXS para obtener un buen conjunto de datos de calidad. Sin embargo, no todas las muestras se mantienen estables; que pueden ser propensos a la agregación o re-equilibración a una mezcla de estados de oligomerización. Por lo tanto, se requiere una etapa de purificación final en línea en la línea de luz para minimizar el tiempo entre la purificación y la recopilación de datos con el fin de obtener los datos SAXS mejor calidad. Dependiendo de las propiedades biofísicas de la proteína de interés, SEC-SAXS o IEC-SAXS pueden ser elegidos para obtener una calidad óptima de la muestra. Aquí, en una construcción de proteína derivada de la helicasa / primasa D5, ambas técnicas se explican y discuten. Adquisición de datos SEC-SAXS se está convirtiendo cada vez más estandarizado y está disponible en muchas líneas de luz BioSAXS. Análisis de los datos, especialmente la sustracción del fondo, es relativamente sencillo y fácil. Sin embargo, una señal de amortiguación establesy la separación suficiente de las especies macromoleculares sigue siendo esencial. Por lo tanto, es crítico para reservar el tiempo suficiente para equilibrar la columna a fondo. El fallo de este método puede ser debido a los contaminantes persistentes de tamaño similar a la proteína de interés, las concentraciones bajas, y tampones sensibles a la radiación. En la práctica, inicialmente, SEC-SAXS es ​​probable que se utilicen como el método de elección para la mayoría de las muestras macromoleculares. Sin embargo, muchos protocolos de purificación requieren una etapa de IEC antes debido a la presencia de contaminantes o agregación. Dado que cada etapa de concentración y la cromatografía se asocia con pérdidas de muestra (estimado en 30 a 50%) y el tiempo, directa IEC-SAXS es ​​ventajoso. Para las muestras que no se pueden purificar por SEC, ya sea debido a la presencia de &quot;contaminantes&quot; de tamaño similar o porque severamente agregado a las concentraciones necesarias, IEC-SAXS siempre sería el mejor enfoque adecuado. Además, los caudales más altos compatiblespor el número de columnas de IEC pueden ayudar a reducir el tiempo de tránsito entre la purificación y la medición. En el ejemplo que aquí se presenta, IEC se utilizó con una etapa de elución, lo que permite la separación de los estrechos picos de D5 323-785 de contaminantes eligiendo cuidadosamente las etapas de concentración de sal. En principio, el número de pasos es ilimitado, pero en la práctica, se requiere al menos 1 paso por el pico, y no demasiados debe ser elegido. Para el método de sustracción de fondo se ha descrito anteriormente, es crucial para medir un número relativamente alto de diferentes composiciones de amortiguamiento con el fin de encontrar el juego. Un inconveniente común de las dos técnicas es la falta de información precisa la concentración de proteína. Debido a esto, la determinación de masas precisa basada en la dispersión hacia delante no es posible. Para las proteínas globulares como D5 323 a 785, el volumen Porod ofrece una alternativa, aunque menos precisa estimación, la masa, pero para las proteínas altamente flexibles o desordenados, Este enfoque no sería válida. Una variación del gradiente por etapas método IEC-SAXS se presenta aquí es el uso de un gradiente lineal en su lugar. Si bien es posible trabajar con tantos pasos como se desee para aislar sub-picos usando una elución por etapas, en el enfoque de gradiente lineal, se requiere para optimizar las condiciones de gradiente cuidadosamente con el fin de separar los picos completamente antes de iniciar el SAXS experimentar. sustracción de fondo en este enfoque podría hacerse frame-sabia y pudo ser verificada mediante la comparación de los cuadros individuales, pero requiere el manejo de datos más avanzada y un software dedicado no existe todavía. La elección de una columna adecuada es crítica para ambas técnicas, ya que determina la separación de las especies macromoleculares. columnas de exclusión por tamaño difieren en la capacidad de carga, el rango de tamaño de macromoléculas separables, y la resolución, mientras que las columnas de intercambio iónico varían en el tipo y la densidadde sus cargos inmovilizados. Mientras que el protocolo presentado aquí es específica de la línea de luz ESRF BM29, la adaptación a cualquier otra línea de luz SAXS es, en principio, sencillo. Los principales requisitos son un suficientemente alto flujo de rayos X y un detector adecuado (idealmente un solo contador de fotones), para adquirir datos razonables de señal a ruido en el intervalo de segundos o menos, y un sistema de cromatografía líquida en línea capaz de crear gradientes. La implementación exacta sería, por supuesto, dependerá del entorno en línea de haz local. Los resultados obtenidos en D5 323-785 utilizando los dos métodos difieren ligeramente. El radio de giro es ligeramente menor para los datos de IEC que para los datos de la SEC, y los mínimos locales de la curva de dispersión se desplaza a vectores de dispersión de un poco más grandes. Esto significa que el D5 323-785 medido con IEC-SAXS es ligeramente más compacto que el D5 323-785 medido con SEC-SAXS. Esto podría be debido a diferencias en la preparación de la muestra, en el tiempo transcurrido entre la purificación y medida (IEC es más rápido), o, menos probable, a un contaminante en la muestra purificada-SEC. Los modelos de talón obtenidos de forma totalmente independiente con ambos métodos son comparables (Figura 1H). D5 323-785 muestra la estructura hueca hexameric espera 18. En conclusión, en línea de intercambio iónico y cromatografía de exclusión por tamaño en línea son importantes métodos de purificación bioquímicas que pueden ser acoplados directamente a SAXS 6,7,9-12,25,26. La sustracción de fondo de los datos IEC-SAXS es ​​un poco más difícil y ambigua que para SEC-SAXS, pero sin embargo es posible. Dependiendo de las propiedades biofísicas de la proteína de interés, tanto SEC y IEC-SAXS permiten la optimización de la separación de las especies con las ventajas inherentes. Proporcionar el ingenio que los pasos de validación (como se describe) se observan correctamente, los datos resultantes pueden ser analizadosla confianza h, y los modelos se pueden determinar usando las herramientas estándar disponibles en la comunidad. Juntos, los dos técnicas permiten la separación en línea para una amplia gama de macromoléculas biológicas, produciendo datos no accesibles a través de mediciones estáticas estándar.

BioSAXS es una poderosa herramienta para determinar la forma de los objetos de tamaño nanométrico 1-4. La dispersión de los rayos X por una solución que contiene macromoléculas, de un tamaño en el rango de nm, se registra en ángulos muy bajos. Este rango angular contiene información acerca de los parámetros globales: el radio de giro; la distancia entre partículas más grande; la forma de las partículas; y el grado de plegamiento, la desnaturalización, o trastorno. La técnica no requiere cristales, y la macromolécula se queda en solución y por lo tanto se puede mantener en condiciones que imitan ciertos parámetros importantes de la célula, tales como fuerza iónica, pH, etc. El conocimiento de estos factores podría ayudar a determinar, por ejemplo, el estado oligomérico fisiológicamente relevante de una proteína de interés o para validar un modelo propuesto de un complejo. La caracterización de las interacciones proteína-proteína en diferentes condiciones de tampón, la creación de modelos de dominios que faltan, el refinamiento de modelos de homología, y el dela terminación de los estados plegado y desplegado discretos se puede realizar rápida y fácilmente 5. Al igual que con cualquier técnica, BioSAXS tiene debilidades intrínsecas: muestras de agregados o desnaturalizados, mezclas de partículas, muestras heterogéneas, daño por radiación, y los desajustes de amortiguamiento pueden resultar en datos de la ONU-interpretables. Para muchos métodos de análisis, se asume implícitamente que la muestra es monodispersa, el requisito de que es a menudo difícil de obtener en la práctica. En muchos casos, la degradación de la muestra es sutil y no se puede detectar en los datos por sí mismo, y cualquier intento de interpretar los datos da resultados inexactos o incluso engañosas. Para superar estos obstáculos, la combinación de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) y SAXS se puso en práctica en muchas líneas de luz para garantizar la calidad de los datos y para hacer que esta técnica sea más accesible para las muestras cada vez más difíciles 6-11. Recientemente, hemos añadido un nuevo método para el repertorio mediante el desarrollo de intercambio iónico en líneacromatografía (IEC) -junto SAXS 12. Ambas técnicas están abriendo SAXS a una amplia gama de partículas biológicas antes imposibles de analizar. La elección del método a utilizar depende de las propiedades biofísicas de las partículas de interés. SEC separa macromoléculas por su tamaño, por lo que se necesita al menos una diferencia del 10% en la masa molecular aparente para la separación. Las limitaciones físicas de la columna y las propiedades fisiológicas de las muestras, como las superficies hidrofóbicas, la flexibilidad y la falta de estabilidad, también complican la recogida de datos, análisis e interpretación. Cromatografía de intercambio iónico, que separa las moléculas en base a su carga y, por lo tanto, su afinidad de unión a la columna de IEC, se puede utilizar en lugar de o además de la SEC. La carga total puede ser manipulado fácilmente cambiando el pH, o la variación de la concentración de sal del tampón, proporcionar un método relativamente simple para el el controladolución de las moléculas de la columna de la IEC. Mediante el uso de la carga, la separación de tipos y tamaños de moléculas similares, que de otro modo serían difíciles de separar, se puede realizar de forma rutinaria con la norma IEC. Además, IEC tiene la ventaja de ser capaz de hacer frente a las muestras diluidas, lo que permite que uno evite las etapas de concentración, que llevan el riesgo potencial de la desnaturalización de la proteína. Desafortunadamente, como la distribución de carga es altamente dependiente de la muestra, IEC requiere la optimización con respecto a el pH y las concentraciones de sal 13,14. Para muchas proteínas que son difíciles de expresar, purificar, o ambos, sólo bajas cantidades de muestra están disponibles para el estudio. Es importante que sea eficiente y para reducir al mínimo el número de etapas de purificación y, por lo tanto, las pérdidas. Por esta razón, la última etapa de purificación es en línea directamente antes de la adquisición de datos SAXS, con el fin de aumentar la probabilidad de la recogida de un buen conjunto de datos. aquí, Se presentan en línea y comparar SEC-SAXS e IEC-SAXS. Ambas técnicas se llevaron a cabo en la línea de luz BioSAXS BM29 en la Instalación Europea de Radiación Sincrotrón (ESRF) en Grenoble, Francia 15. Como caso de prueba, se utilizó el dominio D5N y helicasa de la proteína del virus vaccinia D5, que era bastante difícil de analizar estructuralmente utilizando otros métodos. El virus vaccinia es un miembro de la familia Poxviridae y es 98% idéntica a la virus de la viruela, la causa de la viruela. Utilizando el sistema de vaccinia, estudiamos la maquinaria de replicación, se centra aquí en la D5 esencial helicasa-primasa. D5 es una proteína de 95 kDa con un dominio N-terminal primasa arqueo-eucariota (AEP) 16 seguido de una región de clúster cisteína (res. 240 a 345) 16. Más hacia el C-terminal viene un dominio D5N (res. 340 a 460), que siempre se asocia con helicasas de tipo D5, y, finalmente, una superfamilia 3 (SF3) de dominio helicasa (res. 460 a 785) 17 (Figure 1A). El dominio helicasa de D5 construye una estructura de anillo hexameric que se necesita para la unión apretada al ADN. Gracias a los recientes estudios de SAXS y EM, las estructuras de baja resolución de la primasa y la helicasa dominios son ahora conocidos 18. Aquí, se muestra cómo utilizar las técnicas de cromatografía en línea ejecutados sobre la línea de luz BioSAXS BM29 en el ESRF para hacerse una idea de la estructura del fragmento C-terminal (residuos 323-785) de D5.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4 dithiothreitol [DTT]</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gel</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>4561033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Phusion Flash PCR Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>F 548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetic acid glacial</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>20104.298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose D-5</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>LF45130653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra -15 Centrifugal filters Ultracel -30K</td>
			<td>Millipore Ltd</td>
			<td>UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0400-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Novagene</td>
			<td>70750-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue&#160;</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>8122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete protease inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11231400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Pac 10 DG Desalting column</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>732-2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>24388.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-6405-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HindIII</td>
			<td>Roche</td>
			<td>656313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisSelect HF Nickel Affinity Gel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>20252.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>AppliChem Panreac</td>
			<td>A1073,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth Miller</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>L3152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc.</td>
			<td>191421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>27808.297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>ER0571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>C6010-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pProEx HTb vector&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>10711018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer</td>
			<td>&#160;Eurofins mwg operon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel extraction kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification kid</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>75746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 6 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5172-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA gel stain</td>
			<td>Invitrogen life technology</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 ligase</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>home made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOP 10</td>
			<td>Invitrogen life technology</td>
			<td>C404003&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uno Q 1R column&#160;</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>720 0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>MPBiomedicals, LLC</td>
			<td>194834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beamline control software BsXCuBE</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camserver software</td>
			<td>Dectris</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>detector control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAMAVER</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>program to align ab initio models&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAMMIF</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>ab initio&#160; model reconstruction programm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC program Biologic Duo Flow</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC program LabSolutions</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPyB</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85.</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMUS</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>program, which performs the manipulation with experimental SAXS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyMOL</td>
			<td>DeLano Scientific LLC</td>
			<td>https://www.pymol.org/</td>
			<td>software for visualization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPCOMB</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>program to superimpose 3D structures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLogic Duo Flow</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLogic Biofrac Fraction collector</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC system</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labsonic P</td>
			<td>Sartorius Stedim biotech</td>
			<td>BBI8535108</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

online size-exclusion and ion-exchange chromatography on a saxs beamline

pequeño ángulo Biológica dispersión de rayos X (BioSAXS) es una poderosa técnica de la biología molecular y estructural utilizado para determinar estructura de la solución, el tamaño y forma de las partículas, y la relación de superficie a volumen de macromoléculas. La técnica es aplicable a una variedad muy amplia de condiciones de solución que abarcan una amplia gama de concentraciones, valores de pH, fuerzas iónicas, temperaturas, aditivos, etc., pero se requiere la muestra a ser monodispersa. Esta advertencia llevó a la implementación de sistemas de cromatografía de líquidos en líneas de luz SAXS. A continuación, describimos la integración aguas arriba de exclusión por tamaño (SEC) y la cromatografía de intercambio iónico (IEC) en una línea de luz, diferentes métodos para la óptima sustracción de fondo, y la reducción de datos. Como ejemplo, se describe cómo usamos sec- y IEC-SAXS en un fragmento de la proteína esencial virus vaccinia D5, que consiste en un dominio D5N helicasa. Determinamos su forma general y el peso molecular, que muestra la estructura de hexameric THe proteína.

Los resultados del análisis invariante modelo libre se enumeran en la Tabla 1. El análisis de los datos D5 323-785 SEC-SAXS mostró una estimación masa molecular (a partir de un análisis de Porod) de 345 kDa frente a 338 kDa, observó el uso de la norma IEC-SAXS. Ambos están de acuerdo con la masa esperada de 53,5 kDa 6 veces (321 kDa) para un hexámero. El ab initio de modelado de ambos conjuntos de datos se llevó a cabo sin simetría impuesta (SEC-SAXS: χ 2 = 0,88, IEC-SAXS: χ 2 = 3,1) y el uso de la simetría C6 (SEC-SAXS: χ 2 = 1,0, IEC-SAXS : χ 2 = 4). Como los ajustes globales de los datos de dispersión, tanto para reconstrucciones son comparables en ambos casos (Figura 1D y E), C6 simetría puede ser asumida. Así, el modelo corresponde a una estructura en forma de cono hexagonal con un canal central, que aparece parcialmente obstruida (SEC: Figura 1F; IEC: <strong&gt; Figura 1G, superposición Figura 1H). Un examen de los modelos individuales antes de promediar muestra que esta obstrucción es probable que sea un artefacto del proceso de promediado. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54861/54861fig1x.jpg" /> Figura 1: análisis de los datos SAXS y comparación de D5 323 -785 (figura adaptados de Referencias 12 y 18). A) estructura de dominio esquemática de la proteína D5 y D5 323-785. B) Desconectado cromatograma de intercambio iónico con la indicación de los tres picos. curva de naranja: la absorbancia a 280 nm (au), curva azul: porcentaje de tampón B. Los porcentajes de tampón B en los picos se indican. C) Online cromatograma de intercambio iónico. tecla de color como en B. Además, la intensidad medida se indica en verde. La curva de dispersión experimental unand calculado curva del modelo obtenido por SEC-SAXS D) y IEC E) análisis de los datos de D5 323-785. Modelo F) del grano de 323-785 D5 basado en la SEC información y datos G) IEC. H) superposición de los modelos de la SEC e IEC. Los paneles en F) a H) fueron creados usando un software de visualización molecular 24. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54861/54861fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Parámetros de recopilación de datos </td><td></td></tr><tr><td> Instrumento: </td><td> ESRF BM29 </td></tr><tr><td> Longitud de onda (Å) </td><td> 0.99 </td></tr><tr><td> q-rango (-1) </td><td> 0,0032 - 0,49 </td></tr><tr><td> De muestra a detector de distancia </td><td> 2.864 m </td></tr><tr><td> Tiempo de exposición (s) </td><td> 1 por trama </td></tr><tr><td> intervalo de concentración </td><td> n / A </td></tr><tr><td> Temperatura (K) </td><td> 293 </td></tr><tr><td> Detector </td><td> Pilatus 1M (Dectris) </td></tr><tr><td> Flux (fotones / s) </td><td> 1 × 10 12 </td></tr><tr><td> Tamaño del haz (m 2) </td><td> 700 × 700 </td></tr><tr><td> Parámetros estructurales para D5 323 a 785, SEC </td><td></td></tr><tr><td> I 0 (cm-1) [de la Guinier] </td><td> 0,0237 </td></tr><tr><td> Rg (Å) [de la Guinier] </td><td> 48 </td></tr><tr><td> q min Rg - q max Rg utilizado para Guinier </td><td> 0,77 - 1,24 </td></tr><tr><td> D max (Å) [a partir de p (r)] </td><td> 145 </td></tr><tr><td> q-gama utilizada para p (r) (Å -1)</td><td> 0,02 - 0,17 </td></tr><tr><td> Porod volumen V P (A 3) [de la dispersión] </td><td> (570 ± 5) × 10 3 </td></tr><tr><td> Masa molecular M r (kDa) [de la V p] </td><td> 345 </td></tr><tr><td> Calculado monomérica señor de la secuencia (kDa) </td><td> 321 </td></tr><tr><td> Parámetros estructurales para D5 323 a 785, IEC </td><td></td></tr><tr><td> I 0 (cm-1) [de la Guinier] </td><td> 0,386 </td></tr><tr><td> Rg (Å) [de la Guinier] </td><td> 46,5 ± 0,1 </td></tr><tr><td> q min Rg - q max Rg utilizado para Guinier </td><td> 0,44-1,29 </td></tr><tr><td> D max (Å) [a partir de p (r)] </td><td> 120 </td></tr><tr><td> q-gama utilizada para p (r) (Å -1) </td><td> 0,03 - 0,18 </td></tr><tr><td> Porod volumen V p (&amp; #197; 3) [de la dispersión] </td><td> (577 ± 5) × 10 3 </td></tr><tr><td> Masa molecular M r (kDa) [de la V p] </td><td> 339 </td></tr><tr><td> Calculado hexameric señor de la secuencia (kDa) </td><td> 321 </td></tr></tbody></table> Tabla 1: parámetros de datos de SAXS. La tabla resume los parámetros de SAXS adquisición y análisis de datos.

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Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

La determinación de la estructura de la solución de una proteína por un pequeño ángulo de dispersión de rayos X (SAXS) requiere muestras monodispersas. A continuación, se presentan dos posibilidades para asegurar un retraso mínimo entre la preparación de la muestra y de adquisición de datos: cromatografía de exclusión por tamaño en línea (SEC) y la cromatografía de intercambio iónico en línea (IEC).

Línea de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio iónico en una SAXS Beamline

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Resuelta en el tiempo de ionización por electrospray de hidrógeno-deuterio Espectrometría de Masas de cambio para el estudio de la estructura proteica y Dinámica

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Investigación

Bioquímica

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Un método Simple para la detección química de alto rendimiento en Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Digestión de proteínas, ultrafiltración y cromatografía por exclusión de tamaño para optimizar el aislamiento de exosomas de suero y Plasma de sangre humana

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

Cromatografía de intercambio iónico (IEX) acoplada a la dispersión de la luz de múltiples ángulo (MALS) para caracterización y separación de proteínas

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Caracterización de proteínas por cromatografía de exclusión de tamaño acoplada a dispersión de luz multiángulo (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Cultivo celular en membranas de nitruro de silicio y criopreparación para nanoanálisis de fluorescencia de rayos X de sincrotrón

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Análisis de metabolómica basada en cromatografía líquida no dirigida de grano de trigo

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

Análisis de los datos de la SEC-SAXS a través de la desconvolución y dispersión de EFA

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Análisis semicuantitativo de peptidoglicano por cromatografía líquida, espectrometría de masas y bioinformática

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Una tubería de preparación de muestras para microcristales en vmXm Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...