Name: online size-exclusion and ion-exchange chromatography on a saxs beamline
Uploaded: 2017-01-05T12:30:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline at JoVE.com

We acknowledge financial support for the project from the French grant REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 and by research grants from the Service de Sant&#233; des Arm&#233;es and the D&#233;l&#233;gation G&#233;n&#233;rale pour l'Armement. We are thankful to the ESRF for the SAXS beam time. We thank Andrew McCarthy, Gordon Leonard, Wim Burmeister, and Guy Schoehn for financial and scientific support.

<ol>
	<li>Graewert, M. A., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+and+progress+in+small+and+wide+angle+X-ray+scattering+(SAXS+and+WAXS).">Impact and progress in small and wide angle X-ray scattering (SAXS and WAXS).</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 23, 748-754 (2013).</li><li>Jacques, D. A., Trewhella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-angle+scattering+for+structural+biology-Expanding+the+frontier+while+avoiding+the+pitfalls.">Small-angle scattering for structural biology-Expanding the frontier while avoiding the pitfalls.</a> Protein Sci. 19, 642-657 (2010).</li><li>Kikhney, A. G., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+small+angle+X-ray+scattering+(SAXS)+of+flexible+and+intrinsically+disordered+proteins.">A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins.</a> FEBS Lett. 589, 2570-2577 (2015).</li><li>Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+solution+scattering+(SAXS)+combined+with+crystallography+and+computation:+defining+accurate+macromolecular+structures,+conformations+and+assemblies+in+solution.">X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution.</a> Q. Rev. Biophys. 40, 191-285 (2007).</li><li>Vestergaard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+biostructural+changes,+dynamics,+and+interactions+-+Small-angle+X-ray+scattering+to+the+rescue.">Analysis of biostructural changes, dynamics, and interactions - Small-angle X-ray scattering to the rescue.</a> Arch. Biochem. Biophys. , (2016).</li><li>David, G., P&#233;rez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+sampler+robot+and+high-performance+liquid+chromatography:+a+fully+automated+system+for+biological+small-angle+X-ray+scattering+experiments+at+the+Synchrotron+SOLEIL+SWING+beamline.">Combined sampler robot and high-performance liquid chromatography: a fully automated system for biological small-angle X-ray scattering experiments at the Synchrotron SOLEIL SWING beamline.</a> J. Appl. Crystallogr. 42, 892-900 (2009).</li><li>Graewert, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Pipeline+for+Purification,+Biophysical+and+X-Ray+Analysis+of+Biomacromolecular+Solutions.">Automated Pipeline for Purification, Biophysical and X-Ray Analysis of Biomacromolecular Solutions.</a> Sci. Rep. 5, (2015).</li><li>Lambright, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+techniques+enhance+the+quality+and+scope+of+information+obtained+from+SAXS.">Complementary techniques enhance the quality and scope of information obtained from SAXS.</a> ACA Trans. , 1-12 (2013).</li><li>Mathew, E., Mirza, A., Menhart, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-chromatography-coupled+SAXS+for+accurate+sizing+of+aggregating+proteins.">Liquid-chromatography-coupled SAXS for accurate sizing of aggregating proteins.</a> J. Synchrotron Radiat. 11, 314-318 (2004).</li><li>Round, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+GH3.+12+protein+conformation+through+HPLC-integrated+SAXS+measurements+combined+with+X-ray+crystallography.">Determination of the GH3. 12 protein conformation through HPLC-integrated SAXS measurements combined with X-ray crystallography.</a> Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 69, 2072-2080 (2013).</li><li>Watanabe, Y., Inoko, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-exclusion+chromatography+combined+with+small-angle+X-ray+scattering+optics.">Size-exclusion chromatography combined with small-angle X-ray scattering optics.</a> J. Chromatogr. 1216, 7461-7465 (2009).</li><li>Hutin, S., Brennich, M. E., Maillot, B., Round, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+ion-exchange+chromatography+for+small+angle+X-ray+scattering.">Online ion-exchange chromatography for small angle X-ray scattering.</a> Acta Cryst. , (2016).</li><li>Selkirk, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion-exchange+chromatography.">Ion-exchange chromatography.</a> Protein Purification Protocols. , 125-131 (2004).</li><li>Yigzaw, Y., Hinckley, P., Hewig, A., Vedantham, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+exchange+chromatography+of+proteins+and+clearance+of+aggregates.">Ion exchange chromatography of proteins and clearance of aggregates.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 10, 421-426 (2009).</li><li>Pernot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upgraded+ESRF+BM29+beamline+for+SAXS+on+macromolecules+in+solution.">Upgraded ESRF BM29 beamline for SAXS on macromolecules in solution.</a> J. Synchrotron Radiat. 20, 660-664 (2013).</li><li>Iyer, L. M., Koonin, E. V., Leipe, D. D., Aravind, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+evolution+of+the+archaeo-eukaryotic+primase+superfamily+and+related+palm-domain+proteins:+structural+insights+and+new+members.">Origin and evolution of the archaeo-eukaryotic primase superfamily and related palm-domain proteins: structural insights and new members.</a> Nucleic Acids Res. 33, 3875-3896 (2005).</li><li>Singleton, M. R., Dillingham, M. S., Wigley, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+helicases+and+nucleic+acid+translocases.">Structure and mechanism of helicases and nucleic acid translocases.</a> Annu. Rev. Biochem. 76, 23-50 (2007).</li><li>Hutin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+organization+of+vaccinia+virus+helicase-primase+D5.">Domain organization of vaccinia virus helicase-primase D5.</a> J. Virol. , 4604-4613 (2016).</li><li>Round, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioSAXS+Sample+Changer:+a+robotic+sample+changer+for+rapid+and+reliable+high-throughput+X-ray+solution+scattering+experiments.">BioSAXS Sample Changer: a robotic sample changer for rapid and reliable high-throughput X-ray solution scattering experiments.</a> Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 71, 67-75 (2015).</li><li>De Maria Antolinos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISPyB+for+BioSAXS,+the+gateway+to+user+autonomy+in+solution+scattering+experiments.">ISPyB for BioSAXS, the gateway to user autonomy in solution scattering experiments.</a> Acta Crystallographica Section D. 71, 76-85 (2015).</li><li>Brennich, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+data+analysis+at+the+ESRF+bioSAXS+beamline,+BM29.">Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29.</a> J. Appl. Crystallogr. 49, (2016).</li><li>Petoukhov, M. V., Konarev, P. V., Kikhney, A. G., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATSAS+2.1-towards+automated+and+web-supported+small-angle+scattering+data+analysis.">ATSAS 2.1-towards automated and web-supported small-angle scattering data analysis.</a> J. Appl. Crystallogr. 40, 223-228 (2007).</li><li>Franke, D., Jeffries, C. M., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+Map,+a+goodness-of-fit+test+for+one-dimensional+X-ray+scattering+spectra.">Correlation Map, a goodness-of-fit test for one-dimensional X-ray scattering spectra.</a> Nat. Methods. 12, 419-422 (2015).</li><li>Schrodinger, LLC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8. , (2015).</li><li>Jensen, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+SAXS+measurements+facilitated+by+online+HPLC+buffer+exchange.">Time-resolved SAXS measurements facilitated by online HPLC buffer exchange.</a> J. Synchrotron Radiat. 17, 769-773 (2010).</li><li>Hynson, R. M., Duff, A. P., Kirby, N., Mudie, S., Lee, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ultracentrifugation+coupled+to+small-angle+X-ray+scattering+on+macromolecular+complexes.">Differential ultracentrifugation coupled to small-angle X-ray scattering on macromolecular complexes.</a> J. Appl. Crystallogr. 48, 769-775 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

För många makromolekyler, är ett slutligt reningssteg med hjälp av kromatografi krävs före SAXS datainsamling för att erhålla en god kvalitet datamängd. Men inte alla prover förblir stabilt; de kan vara benägna att aggregering eller återjämvikt till en blandning av oligomerisering tillstånd. Därför är ett slutligt nätet reningssteget på strålröret som krävs för att minimera tiden mellan rening och datainsamling för att erhålla SAXS uppgifter bäst kvalitet. Beroende på de biofysikaliska egenskaperna hos proteinet av intresse, kan SEC-SAXS eller IEC-SAXS väljas för att uppnå optimal provkvalitet. Här, på en proteinkonstruktion som härrör från helikas / primas D5 är båda teknikerna förklaras och diskuteras. Förvärv av SEC-SAXS data blir mer och mer standardiserade och finns på många BioSAXS strålrör. Dataanalys, särskilt bakgrund subtraktion, är relativt enkelt och lätt. Men en stabil buffert signaloch tillräcklig separation av makromolekylära arter förblir avgörande. Därför är det viktigt att reservera tillräckligt med tid att jämvikta kolonnen noggrant. Misslyckande av denna metod kan vara på grund av ihållande föroreningar av liknande storlek till proteinet av intresse, låga koncentrationer, och strålningskänsliga buffertar. I praktiken, initialt, är SEC-SAXS kan komma att användas som metod för valet för de flesta makromolekylära prover. Ändå många reningsprotokoll kräver en tidigare IEC steg på grund av förekomsten av föroreningar eller aggregering. Med tanke på att varje koncentration och kromatografi steg är förknippad med förluster av prov (uppskattningsvis 30-50%) och tid, är direkt IEC-SAXS fördelaktig. För prover som inte kan renas genom SEC, vare sig det beror på närvaron av liknande storlek &quot;föroreningar&quot; eller för att de allvarligt aggregat vid koncentrationer som krävs skulle IEC-SAXS alltid vara bättre lämpade strategi. Också, de högre flödeshastigheter som stödsav många IEC kolonner kan bidra till att minska överföringstiden mellan rening och mätning. I exemplet som presenteras här, var IEC används med en stegeluering, vilket möjliggör separation av de nära toppar av D5 323-785 från föroreningar genom att noggrant välja steg saltkoncentrationen. I princip är antalet steg obegränsad, men i praktiken är åtminstone ett steg per topp krävs, och inte alltför många bör väljas. För bakgrunden subtraktion metod som beskrivits ovan, är det mycket viktigt att mäta ett relativt högt antal olika buffertkompositioner i syfte att finna den matchande en. En gemensam nackdel med båda teknikerna är bristen på exakt information proteinkoncentration. På grund av detta, är det inte möjligt exakt massbestämning baserad på framåtspridning. För globulära proteiner såsom D5 323-785 ger Porod volym ett alternativ, om än mindre exakt, massa uppskattning, men för mycket flexibla eller oordnade proteinerSkulle detta tillvägagångssätt inte vara giltig. En variant av stegvis gradient IEC-SAXS metod som presenteras här är användningen av en linjär gradient i stället. Även om det är möjligt att arbeta med så många steg som önskas för att isolera under toppar med användning av en stegvis eluering, i linjär gradient tillvägagångssätt, krävs det för att optimera gradientförhållandena noggrant för att separera toppar helt före start av SAXS experimentera. Bakgrund subtraktion i denna strategi kan göras ram-wise och kunde kontrolleras genom att jämföra de enskilda bildrutor, men det kräver mer avancerad datahantering, och en särskild programvara inte finns ännu. Valet av en lämplig kolonn är kritisk för båda teknikerna, eftersom den avgör separationen av de makromolekylära arter. Storlek-uteslutningskolonner skiljer sig i lastkapacitet, storleksordningen av avskiljbara makromolekyler, och upplösning, medan jonbytarkolonnerna varierar i slag och densitetenderas immobiliserade avgifter. Medan det protokoll som presenteras här är specifika för ESRF beamline BM29, anpassning till någon annan SAXS beamline är i princip enkel. De viktigaste kraven är en tillräckligt hög röntgenflöde och en lämplig detektor (helst enkelfotonräknande), att förvärva rimliga signal-brusdata i området av sekunder eller mindre, och en online-kromatografisystem vätska med förmåga att skapa gradienter. Av det exakta genomförandet skulle, naturligtvis, att bero på den lokala beamline miljön. De erhållna resultaten på D5 323-785 genom att använda de två metoderna skiljer sig något. Tröghetsradie är något mindre för IEC data än för SEC data och den lokala minima av spridningskurvan flyttas till något större spridnings vektorer. Detta innebär att D5 323-785 mätt med IEC-SAXS är något mer kompakt än D5 323-785 mätt med SEC-SAXS. Detta kan be på grund av skillnader i provberedning, i tiden mellan rening och mätning (IEC är snabbare), eller, mindre troligt, att en förorening i SEC-renade provet. Pärlan modeller erhållits helt oberoende med båda metoderna är jämförbara (figur 1H). D5 323-785 visar den förväntade ihåliga, hexamera strukturen 18. Sammanfattningsvis nätet jonbyte och nätet storlek kromatografi är viktiga biokemiska reningsmetoder som kan kopplas direkt till SAXS 6,7,9-12,25,26. Bakgrunden subtraktion av IEC-SAXS data något svårare och tvetydig än för SEC-SAXS, men det är ändå möjligt. Beroende på de biofysikaliska egenskaperna hos proteinet av intresse, både SEC och IEC-SAXS möjliggöra optimering av arter separation med inneboende fördelar. Förutsatt att valideringssteg (såsom beskrivits) är korrekt observeras, kan resulterande data analyseras with förtroende och modeller kan bestämmas med hjälp av standardverktyg som finns i samhället. Tillsammans båda teknikerna tillåter nätet separation för ett brett spektrum av biologiska makromolekyler, vilket ger uppgifter inte är tillgängliga via standard statiska mätningar.

BioSAXS är ett kraftfullt verktyg för att bestämma formen av nanostora objekt 1-4. Spridningen av röntgenstrålar med en lösning innehållande makromolekyler, dimensioneras på nm, registreras vid mycket små vinklar. Detta vinkelområde innehåller information om globala parametrar: tröghetsradie; den största intraparticle avstånd; partikelformen; och graden av vikning, denaturering, eller störning. Tekniken kräver inte kristaller, och makromolekylen stannar i lösning och sålunda kan hållas under förhållanden som efterliknar vissa viktiga parametrar i cellen, såsom jonstyrka, pH, etc. Kunskapen om dessa faktorer kan bidra till att bestämma, till exempel, det fysiologiskt relevanta oligomera tillstånd av ett protein av intresse eller för att validera en föreslagen modell av ett komplex. Karakterisering av protein-proteininteraktioner i olika buffertbetingelser, skapande av modeller för saknade domäner, förfining av homologimodeller, och determinering av diskreta vikta och ovikta tillstånd kan utföras snabbt och enkelt 5. Som med alla teknik, har BioSAXS inneboende svagheter: aggregerade eller denaturerade prover, blandningar av partiklar, heterogena prover, strålningsskada, och buffert obalanser kan resultera i un-tolkningsbara data. För många analysmetoder, är det underförstått antas att provet är monodispers, ett krav som ofta är svårt att få i praktiken. I många fall är nedbrytningen av provet subtila och kan inte upptäckas i data på egen hand, och alla försök att tolka data ger felaktiga eller missvisande resultat. För att övervinna dessa hinder, var kombinationen av storleks (SEC) och SAXS implementeras på många strålrör att säkerställa uppgifternas kvalitet och för att göra denna teknik mer tillgänglig för allt svårare prov 6-11. Nyligen har vi lagt en ny metod för att repertoaren genom att utveckla nätet jonbytekromatografi (IEC) -kopplade SAXS 12. Båda teknikerna öppnar SAXS till ett brett spektrum av biologiska partiklar som tidigare omöjliga att analysera. Valet av vilken metod som ska användas beror på de biofysikaliska egenskaperna hos partiklarna av intresse. SEC separerar makromolekyler genom sin storlek, varigenom det krävs åtminstone en skillnad i skenbar molekylmassa 10% för separationen. Fysiska begränsningar i kolumnen och fysiologiska egenskaper av proverna, som hydrofoba ytor, flexibilitet och bristande stabilitet, även komplicera datainsamling, analys och tolkning. Jonbyteskromatografi, som separerar molekyler baserat på deras laddning och därmed deras bindningsaffinitet till IEC-kolonn, kan användas i stället för eller som tillägg till SEC. Den totala laddningen kan lätt manipuleras genom att förändra pH, eller variera saltkoncentrationen i buffert, vilket ger en relativt enkel metod för kontrollerad elution av molekylerna från IEC-kolonnen. Genom att använda avgiften, separation av liknande typer och storlekar av molekyler, som annars skulle vara svåra att separera, kan utföras rutinmässigt med IEC. Dessutom har IEC fördelen av att kunna ta itu med utspädda prover så att en för att undvika koncentrationssteg, som bär den potentiella risken för denaturering av proteinet. Tyvärr, som laddningsöverföringen är mycket prov beroende, kräver IEC optimering beträffande pH och saltkoncentrationerna 13,14. För många proteiner som är svåra att uttrycka, rena, eller båda, endast låga mängder av provet är tillgängliga för att studera. Det är viktigt att vara effektiv och för att minimera antalet reningssteg och därmed förlusterna. Av denna anledning är det sista reningssteget på nätet direkt före SAXS datainsamling, för att öka sannolikheten för att samla in en bra datamängd. HärPresenterar vi och jämföra på nätet SEC-SAXS och IEC-SAXS. Båda teknikerna genomfördes på BioSAXS beamline BM29 vid anläggningen European Synchrotron Radiation (ESRF) i Grenoble, Frankrike 15. Som ett testfall, använde vi D5N och helikas domän vacciniavirus protein D5, som var ganska svårt att strukturellt analysera med hjälp av andra metoder. Vaccinia virus är en medlem av Poxviridae familjen och är 98% identisk med den variolavirus, orsaken till smittkoppor. Med hjälp av vaccinia systemet, studerar vi replikering maskiner, fokuserar här på det väsentliga helikas-primas D5. D5 är ett protein med en N-terminal Archeo-eukaryot primas (AEP) domän 16 följt av ett cystein klusterområdes (res. 240 till 345) 16 95-kDa. Ytterligare mot C-terminalen kommer en D5N domän (res. 340 till 460), som alltid är förknippad med D5-typ helikaser, och slutligen en superfamilj 3 (SF3) helikas domän (res. 460 till 785) 17 (Figure 1A). Den helikas domänen av D5 bygger en hexamerisk ringstruktur som behövs för tät bindning till DNA. Tack vare de senaste SAXS och EM studier är lågupplösta strukturerna i primas och Helicase domäner nu kända 18. Här visar vi hur man använder genomförda nätet kromatografitekniker på BioSAXS beamline BM29 vid ESRF att få insikt i strukturen av C-terminalt fragment (rest 323-785) av D5.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4 dithiothreitol [DTT]</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gel</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>4561033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Phusion Flash PCR Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>F 548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetic acid glacial</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>20104.298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose D-5</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>LF45130653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra -15 Centrifugal filters Ultracel -30K</td>
			<td>Millipore Ltd</td>
			<td>UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0400-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Novagene</td>
			<td>70750-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue&#160;</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>8122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete protease inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11231400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Pac 10 DG Desalting column</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>732-2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>24388.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-6405-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HindIII</td>
			<td>Roche</td>
			<td>656313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisSelect HF Nickel Affinity Gel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>20252.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>AppliChem Panreac</td>
			<td>A1073,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth Miller</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>L3152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc.</td>
			<td>191421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>27808.297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>ER0571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>C6010-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pProEx HTb vector&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>10711018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer</td>
			<td>&#160;Eurofins mwg operon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel extraction kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification kid</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>75746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 6 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5172-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA gel stain</td>
			<td>Invitrogen life technology</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 ligase</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>home made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOP 10</td>
			<td>Invitrogen life technology</td>
			<td>C404003&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uno Q 1R column&#160;</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>720 0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>MPBiomedicals, LLC</td>
			<td>194834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beamline control software BsXCuBE</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camserver software</td>
			<td>Dectris</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>detector control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAMAVER</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>program to align ab initio models&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAMMIF</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>ab initio&#160; model reconstruction programm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC program Biologic Duo Flow</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC program LabSolutions</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPyB</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85.</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMUS</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>program, which performs the manipulation with experimental SAXS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyMOL</td>
			<td>DeLano Scientific LLC</td>
			<td>https://www.pymol.org/</td>
			<td>software for visualization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPCOMB</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>program to superimpose 3D structures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLogic Duo Flow</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLogic Biofrac Fraction collector</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC system</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labsonic P</td>
			<td>Sartorius Stedim biotech</td>
			<td>BBI8535108</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

online size-exclusion and ion-exchange chromatography on a saxs beamline

Biologisk liten vinkel röntgenspridning (BioSAXS) är en kraftfull teknik i molekyl- och strukturbiologi används för att bestämma lösningen struktur, partikelstorlek och form, och surface-to-volymförhållande av makromolekyler. Tekniken är applicerbar på ett mycket stort antal olika lösningsbetingelser som spänner över ett brett intervall av koncentrationer, pH-värden, jonstyrkor, temperaturer, tillsatser, etc., men provet måste vara monodispersa. Denna varning ledde till genomförandet av vätskekromatografi system på SAXS strålrör. Här beskriver vi den uppströms belägna integrering av storleksuteslutningskromatografi (SEC) och jonbyteskromatografi (IEC) på en beamline, olika metoder för optimal bakgrundssubtraktion, och datareduktion. Som ett exempel, beskriver vi hur vi använder sek- och IEC-SAXS på ett fragment av den essentiella vaccinia-virusprotein D5, som består av en D5N helikas domän. Vi bestämmer dess övergripande form och molekylvikt, visar hexamera strukturen av the protein.

Resultaten av modellfria invariant analys listas i tabell 1. Analysen av D5 323-785 SEC-SAXS data visade en molekylvikt uppskattning (från en Porod analys) av 345 kDa jämfört med 338 kDa, observeras med hjälp IEC-SAXS. Båda är i överensstämmelse med den förväntade massan av 6 gånger 53,5 kDa (321 kDa) för en hexamer. Ab initio modellering av både dataset genomfördes utan införde symmetri (SEC-SAXS: χ 2 = 0,88, IEC-SAXS: χ 2 = 3,1) och med hjälp av C6 symmetri (SEC-SAXS: χ 2 = 1,0, IEC-SAXS : χ 2 = 4). Som de övergripande passar till uppgifter spridnings för både rekonstruktioner är jämförbara i båda fallen (figur 1D och E), kan antas C6 symmetri. Sålunda motsvarar modellen till en hexagonal konliknande struktur med en central kanal, som visas partiellt blockerade (SEC: Figur 1F; IEC: <strong&gt; Figur 1G, overlay Figur 1H). En undersökning av enskilda modeller före medelvärdes visar att detta hinder är sannolikt en artefakt av medelvärdesprocessen. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/54861/54861fig1x.jpg" /> Figur 1: SAXS dataanalys och jämförelse av D5 323 -785 (figur anpassad från Referenser 12 och 18). A) Schematisk domänstrukturen hos D5 protein och D5 323-785. B) Offline jonbyte kromatogram med angivande av de tre topparna. Orange kurva: Absorbans vid 280 nm (au), blå kurva: procentsats av buffert B. Procent av buffert B vid topparna anges. C) Online jonbyte kromatogram. Färgknapp som i B. Dessutom är den uppmätta intensiteten anges i grönt. Den experimentella spridnings kurva and beräknad kurva av modellen erhålls genom SEC-SAXS D) och IEC E) analys av data från D5 323-785. F) Bead modell D5 323-785 baserat på SEC data och G) IEC-data. H) överlagring av SEC och IEC-modeller. Panelerna i F) till H) skapades med en molekylär visualiseringsprogram 24. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54861/54861fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Datainsamlings parametrar </td><td></td></tr><tr><td> Instrument: </td><td> ESRF BM29 </td></tr><tr><td> Våglängd (Å) </td><td> 0,99 </td></tr><tr><td> q-typ (a -1) </td><td> 0,0032-0,49 </td></tr><tr><td> Prov till detektor avstånd </td><td> 2,864 m </td></tr><tr><td> Exponeringstid (sek) </td><td> En per ram </td></tr><tr><td> koncentrationsområde </td><td> na </td></tr><tr><td> Temperatur (K) </td><td> 293 </td></tr><tr><td> Detektor </td><td> Pilatus 1M (Dectris) </td></tr><tr><td> Flux (fotoner / s) </td><td> 1 × 10 12 </td></tr><tr><td> Strålstorlek (^ m 2) </td><td> 700 × 700 </td></tr><tr><td> Strukturella parametrar för D5 323-785, SEC </td><td></td></tr><tr><td> I 0 (cm -1) [från Guinier] </td><td> 0,0237 </td></tr><tr><td> Rg (a) [från Guinier] </td><td> 48 </td></tr><tr><td> q min R g - q max R g används för Guinier </td><td> 0,77-1,24 </td></tr><tr><td> Dmax (Å) [från p (r)] </td><td> 145 </td></tr><tr><td> q-range som används för p (r) (Å -1)</td><td> 0,02-0,17 </td></tr><tr><td> Porod volym Vp (A 3) [från Scatter] </td><td> (570 ± 5) × 10 3 </td></tr><tr><td> Molekylmassa M r (kDa) [från Vp] </td><td> 345 </td></tr><tr><td> Beräknat mono Mr från sekvens (kd) </td><td> 321 </td></tr><tr><td> Strukturella parametrar för D5 323-785, IEC </td><td></td></tr><tr><td> I 0 (cm -1) [från Guinier] </td><td> 0,386 </td></tr><tr><td> Rg (a) [från Guinier] </td><td> 46,5 ± 0,1 </td></tr><tr><td> q min R g - q max R g används för Guinier </td><td> 0,44-1,29 </td></tr><tr><td> Dmax (Å) [från p (r)] </td><td> 120 </td></tr><tr><td> q-range som används för p (r) (Å -1) </td><td> 0,03-0,18 </td></tr><tr><td> Porod volym Vp (&amp; #197; 3) [från Scatter] </td><td> (577 ± 5) × 10 3 </td></tr><tr><td> Molekylmassa M r (kDa) [från Vp] </td><td> 339 </td></tr><tr><td> Beräknat hexamer Mr från sekvens (kd) </td><td> 321 </td></tr></tbody></table> Tabell 1: SAXS dataparametrar. Tabellen sammanfattar parametrar SAXS datainsamling och analys.

Watch this Scientific Journal Video about Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline at JoVE.com

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

Bestämningen av den lösning strukturen av ett protein genom liten vinkel röntgenspridning (SAXS) kräver monodispersa prover. Här presenterar vi två möjligheter att säkerställa minimala fördröjningar mellan provberedning och datainsamling: nätet storleks (SEC) och online-jonbyteskromatografi (IEC).

Online Storlek-utanförskap och Jonbyteskromatografi på en SAXS beamline

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tidsupplöst elektrosprayjonisering Väte-deuterium Exchange-masspektrometri för att studera Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En enkel metod för hög genomströmning kemisk Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Protein matsmältningen, ultrafiltrering och storlek utslagning kromatografi att optimera isolering av Exosomes från mänsklig blodplasma och Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

Jonbyteskromatografi (IEX) kopplat till multi-Angle ljusspridning (MALS) för Protein Separation och karakterisering

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Karakterisering av proteiner av storlek-uteslutning kromatografi kopplad till multi-Angle ljus spridning (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Cell odling på Kiselnitridmembran och Kryopreparation för Synchrotron röntgenfluorescens Nanoanalys

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Oriktad flytande kromatografi-Mass Pektrometri-Baserade metabolomika analys av vetekorn

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

Analys av SEC-SAXS-data via EFA-deconvolution och Scatter

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Semikvantitativ analys av peptidoglykan genom vätskekromatografi, masspektrometri och bioinformatik

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

En provförberedande pipeline för mikrokritaler vid VMXm Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...