Name: online size-exclusion and ion-exchange chromatography on a saxs beamline
Uploaded: 2017-01-05T12:30:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline at JoVE.com

We acknowledge financial support for the project from the French grant REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 and by research grants from the Service de Sant&#233; des Arm&#233;es and the D&#233;l&#233;gation G&#233;n&#233;rale pour l'Armement. We are thankful to the ESRF for the SAXS beam time. We thank Andrew McCarthy, Gordon Leonard, Wim Burmeister, and Guy Schoehn for financial and scientific support.

<ol>
	<li>Graewert, M. A., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+and+progress+in+small+and+wide+angle+X-ray+scattering+(SAXS+and+WAXS).">Impact and progress in small and wide angle X-ray scattering (SAXS and WAXS).</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 23, 748-754 (2013).</li><li>Jacques, D. A., Trewhella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-angle+scattering+for+structural+biology-Expanding+the+frontier+while+avoiding+the+pitfalls.">Small-angle scattering for structural biology-Expanding the frontier while avoiding the pitfalls.</a> Protein Sci. 19, 642-657 (2010).</li><li>Kikhney, A. G., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+small+angle+X-ray+scattering+(SAXS)+of+flexible+and+intrinsically+disordered+proteins.">A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins.</a> FEBS Lett. 589, 2570-2577 (2015).</li><li>Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+solution+scattering+(SAXS)+combined+with+crystallography+and+computation:+defining+accurate+macromolecular+structures,+conformations+and+assemblies+in+solution.">X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution.</a> Q. Rev. Biophys. 40, 191-285 (2007).</li><li>Vestergaard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+biostructural+changes,+dynamics,+and+interactions+-+Small-angle+X-ray+scattering+to+the+rescue.">Analysis of biostructural changes, dynamics, and interactions - Small-angle X-ray scattering to the rescue.</a> Arch. Biochem. Biophys. , (2016).</li><li>David, G., P&#233;rez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+sampler+robot+and+high-performance+liquid+chromatography:+a+fully+automated+system+for+biological+small-angle+X-ray+scattering+experiments+at+the+Synchrotron+SOLEIL+SWING+beamline.">Combined sampler robot and high-performance liquid chromatography: a fully automated system for biological small-angle X-ray scattering experiments at the Synchrotron SOLEIL SWING beamline.</a> J. Appl. Crystallogr. 42, 892-900 (2009).</li><li>Graewert, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Pipeline+for+Purification,+Biophysical+and+X-Ray+Analysis+of+Biomacromolecular+Solutions.">Automated Pipeline for Purification, Biophysical and X-Ray Analysis of Biomacromolecular Solutions.</a> Sci. Rep. 5, (2015).</li><li>Lambright, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+techniques+enhance+the+quality+and+scope+of+information+obtained+from+SAXS.">Complementary techniques enhance the quality and scope of information obtained from SAXS.</a> ACA Trans. , 1-12 (2013).</li><li>Mathew, E., Mirza, A., Menhart, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-chromatography-coupled+SAXS+for+accurate+sizing+of+aggregating+proteins.">Liquid-chromatography-coupled SAXS for accurate sizing of aggregating proteins.</a> J. Synchrotron Radiat. 11, 314-318 (2004).</li><li>Round, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+GH3.+12+protein+conformation+through+HPLC-integrated+SAXS+measurements+combined+with+X-ray+crystallography.">Determination of the GH3. 12 protein conformation through HPLC-integrated SAXS measurements combined with X-ray crystallography.</a> Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 69, 2072-2080 (2013).</li><li>Watanabe, Y., Inoko, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-exclusion+chromatography+combined+with+small-angle+X-ray+scattering+optics.">Size-exclusion chromatography combined with small-angle X-ray scattering optics.</a> J. Chromatogr. 1216, 7461-7465 (2009).</li><li>Hutin, S., Brennich, M. E., Maillot, B., Round, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+ion-exchange+chromatography+for+small+angle+X-ray+scattering.">Online ion-exchange chromatography for small angle X-ray scattering.</a> Acta Cryst. , (2016).</li><li>Selkirk, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion-exchange+chromatography.">Ion-exchange chromatography.</a> Protein Purification Protocols. , 125-131 (2004).</li><li>Yigzaw, Y., Hinckley, P., Hewig, A., Vedantham, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+exchange+chromatography+of+proteins+and+clearance+of+aggregates.">Ion exchange chromatography of proteins and clearance of aggregates.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 10, 421-426 (2009).</li><li>Pernot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upgraded+ESRF+BM29+beamline+for+SAXS+on+macromolecules+in+solution.">Upgraded ESRF BM29 beamline for SAXS on macromolecules in solution.</a> J. Synchrotron Radiat. 20, 660-664 (2013).</li><li>Iyer, L. M., Koonin, E. V., Leipe, D. D., Aravind, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+evolution+of+the+archaeo-eukaryotic+primase+superfamily+and+related+palm-domain+proteins:+structural+insights+and+new+members.">Origin and evolution of the archaeo-eukaryotic primase superfamily and related palm-domain proteins: structural insights and new members.</a> Nucleic Acids Res. 33, 3875-3896 (2005).</li><li>Singleton, M. R., Dillingham, M. S., Wigley, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+helicases+and+nucleic+acid+translocases.">Structure and mechanism of helicases and nucleic acid translocases.</a> Annu. Rev. Biochem. 76, 23-50 (2007).</li><li>Hutin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+organization+of+vaccinia+virus+helicase-primase+D5.">Domain organization of vaccinia virus helicase-primase D5.</a> J. Virol. , 4604-4613 (2016).</li><li>Round, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioSAXS+Sample+Changer:+a+robotic+sample+changer+for+rapid+and+reliable+high-throughput+X-ray+solution+scattering+experiments.">BioSAXS Sample Changer: a robotic sample changer for rapid and reliable high-throughput X-ray solution scattering experiments.</a> Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 71, 67-75 (2015).</li><li>De Maria Antolinos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISPyB+for+BioSAXS,+the+gateway+to+user+autonomy+in+solution+scattering+experiments.">ISPyB for BioSAXS, the gateway to user autonomy in solution scattering experiments.</a> Acta Crystallographica Section D. 71, 76-85 (2015).</li><li>Brennich, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+data+analysis+at+the+ESRF+bioSAXS+beamline,+BM29.">Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29.</a> J. Appl. Crystallogr. 49, (2016).</li><li>Petoukhov, M. V., Konarev, P. V., Kikhney, A. G., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATSAS+2.1-towards+automated+and+web-supported+small-angle+scattering+data+analysis.">ATSAS 2.1-towards automated and web-supported small-angle scattering data analysis.</a> J. Appl. Crystallogr. 40, 223-228 (2007).</li><li>Franke, D., Jeffries, C. M., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+Map,+a+goodness-of-fit+test+for+one-dimensional+X-ray+scattering+spectra.">Correlation Map, a goodness-of-fit test for one-dimensional X-ray scattering spectra.</a> Nat. Methods. 12, 419-422 (2015).</li><li>Schrodinger, LLC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8. , (2015).</li><li>Jensen, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+SAXS+measurements+facilitated+by+online+HPLC+buffer+exchange.">Time-resolved SAXS measurements facilitated by online HPLC buffer exchange.</a> J. Synchrotron Radiat. 17, 769-773 (2010).</li><li>Hynson, R. M., Duff, A. P., Kirby, N., Mudie, S., Lee, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ultracentrifugation+coupled+to+small-angle+X-ray+scattering+on+macromolecular+complexes.">Differential ultracentrifugation coupled to small-angle X-ray scattering on macromolecular complexes.</a> J. Appl. Crystallogr. 48, 769-775 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Birçok makromoleküller için kromatografi kullanılarak, son bir arıtma adımı kaliteli bir veri seti elde etmek için SAXS veri toplama öncesinde gereklidir. Ancak, tüm numuneler sabit kalır; onlar oligomerizasyon devletler karışımına toplama veya yeniden dengeleme eğilimli olabilir. Bu nedenle, ışın-hattı ile ilgili son bir çevrimiçi saflaştırma adımı en kaliteli SAXS verilerini elde etmek üzere saflaştırma ve veri toplama arasındaki süreyi en aza indirmek için kullanılır. ilgili proteinin biyofiziksel özelliklerine bağlı olarak, sek-SAXS veya IEC-SAXS uygun örnek kalitesini elde etmek için seçilebilir. Burada, helikaz / primaz D5 türetilmiş bir protein yapı üzerinde, hem teknik açıklanmış ve tartışılmıştır. SEC-SAXS veri toplama daha standardize hale geliyor ve birçok BioSAXS ışın demetleri üzerinde temin edilebilir. Veri analizi, özellikle arka plan çıkarma, nispeten basit ve kolaydır. Bununla birlikte, sabit bir tampon sinyalininve makromoleküler türlerin yeterli ayrılması esastır kalır. Nedenle, iyice sütun dengelenmesi için yeterli zaman ayırmak önemlidir. Bu yöntemin arıza çıkar, düşük konsantrasyonlarda, ve radyasyon duyarlı tamponların proteine ​​benzer büyüklükte kalıcı kirletici bağlı olabilir. Uygulamada, ilk, sek-SAXS en makromoleküler örnekler için tercih edilen yöntem olarak kullanılması olasıdır. Yine de, birçok saflaştırma protokolleri kirletici ya toplanmasının varlığı nedeniyle, önceki IEC adım gerektirir. Her bir konsantrasyon ve kromatografi aşaması (% 30-50 olduğu tahmin) örnek ve zaman kayıpları ile bağlantılı olduğu göz önüne alındığında, doğrudan IEC SAXS avantajlıdır. SEC tarafından arıtılmış edilemez numuneler için, nedeniyle benzer büyüklükteki &quot;kirletici&quot; varlığı ya da gerekli konsantrasyonlarda ciddi agrega, IEC-SAXS her zaman daha iyi uygundur yaklaşım olurdu çünkü olsun. Ayrıca, daha yüksek akış hızları desteklenenbirçok kişi tarafından IEC sütun saflaştırma ve ölçüm arasındaki geçiş süresini azaltmak için yardımcı olabilir. Burada verilen örnekte, IEC dikkatle tuz konsantrasyonu adımları seçerek kirletici maddelerden D5 323-785 yakın tepe ayrılması için sağlayan bir adım elüsyon ile kullanılmıştır. Prensip olarak, adım sayısı sınırsızdır ama pratikte, tepe başına en az 1 adım gereklidir ve çok az seçilmelidir. Yukarıda tarif edilen arka plan çıkarma yöntemi için, uygun bir bulmak için farklı tampon terkipleri arasında, nispeten yüksek bir sayısını ölçmek için çok önemlidir. Her iki teknik bir ortak dezavantajı kesin protein konsantrasyonu bilgi eksikliğidir. Buna bağlı olarak, ileri saçılma göre hassas kütlesinin belirlenmesi mümkün değildir. Böyle D5 323-785 olarak küresel proteinler için, poród hacmi son derece esnek ve düzensiz proteinlerin ancak, daha az hassas, kitle tahmin olsa bir alternatif sağlarBu yaklaşım geçerli olmaz. Burada sunulan basamaklı gradyan IEC SAXS yöntemin bir varyasyonu yerine bir doğrusal gradyan kullanılmasıdır. Bu adım adım elüsyon kullanılarak alt tepe izole etmek için arzu edildiği gibi doğrusal gradyan yaklaşımda, birçok adımda çalışmak mümkün olsa da, bunun tamamıyla SAXS başlamadan önce tepe ayırmak üzere dikkatlice gradyan koşulları optimize etmek için gerekli olan deney. Bu yaklaşımda arka plan çıkarma çerçeve bilge yapılabilir ve tek tek kare karşılaştırılması tarafından doğrulandı olabilir, ama daha gelişmiş veri işleme gerektirir ve özel bir yazılım henüz mevcut değil. Bu makromoleküler türlerin ayrılmasına belirler gibi uygun bir sütunu, her iki usul için çok önemlidir. iyon-değişim kolonları tür ve yoğunluk değişiklik gösterir boyut dışlama kolonlar, yükleme kapasitesi, ayrılabilir makromoleküllerin boyut aralığı ve çözünürlükte farklılıkonların hareketsiz ücretleri. Burada sunulan protokol basit prensip olarak herhangi bir diğer SAXS beamline da SDBY beamline BM29, adaptasyon, özel olsa. Ana şartlar oluşturma yeteneğine sahip yeterli derecede yüksek olan X-ışını akışı saniye ya da daha az aralığında uygun bir sinyal-ses verileri elde etmek için, uygun bir detektör (ideal olarak tek foton sayımı), ve bir online sıvı kromatografi sistemi vardır geçişlerini. Tam uygulama, tabii ki, yerel beamline çevre bağlı olacaktır. Iki yöntemi kullanarak D5 323-785 üzerinde elde edilen sonuçlar biraz farklıdır. dönme yarıçapı SEC verileri için olana göre IEC verileri için biraz daha küçük olan, ve dağılma eğrisinin lokal minimum biraz daha büyük yayılma vektörleri kaydırılır. Bu IEC SAXS ölçülen D5 323-785 biraz daha kompakt SEC-SAXS ölçülen D5 323-785 fazla olduğu anlamına gelir. Bu b olabilirSEC-saflaştınldı numunede bir kirletici daha az saflaştırma ve ölçüm tarihleri ​​arasında örnek hazırlama farklılıklar, (IEC hızlı) ya da, bağlı ör. Her iki yöntemde tamamen bağımsız olarak elde boncuk modelleri (Şekil 1H) karşılaştırılabilir. D5 323-785 beklenen içi boş, heksamerik yapıyı 18 göstermektedir. Sonuç olarak, çevrimiçi iyon değiştirme ve çevrimiçi boyut dışlama kromatografisi SAXS 6,7,9-12,25,26 doğrudan akuple edilebilir önemli biyokimyasal saflaştırma yöntemleri bulunmaktadır. IEC-SAXS verilerinin arka plan çıkarma biraz SEC-SAXS için daha zor ve belirsiz, ama yine de mümkündür. ilgili proteinin biyofiziksel özelliklerine bağlı olarak, SEC ve IEC SAXS hem doğal avantajlarına sahip türlerin ayrılması optimizasyonu için izin verir. doğrulama adımları (açıklandığı gibi) doğru gözlenir olduğunu, elde edilen verilerin analiz edilebilir zekâ sağlanmasıh güven ve modeller toplum içinde mevcut standart aletler kullanılarak tespit edilebilir. Birlikte, her iki tekniğin standart statik ölçümler üzerinden erişilebilir değil veri verimli, biyolojik makromoleküllerin geniş bir aralığı için çevrimiçi ayrılmasına izin verildi.

BioSAXS nano-boyutlu nesnelerin 1-4 şeklini belirlemek için güçlü bir araçtır. mil aralığı içinde boyut makromoleküller ihtiva eden bir çözelti ile X-ışını saçılması, çok düşük açılarda kaydedilir. Bu açısal aralık küresel parametreler hakkında bilgi içerir: dönme yarıçapı; en büyük intraparticle mesafe; parçacık şekli; ve katlanır, denatürasyon, ya da bozukluğun derecesi. Belirlenmesinde yararlı olabilir tekniği kristaller gerektirmez, ve makromolekül gibi iyonik vb kuvvet, pH, bu faktörlerin bilgisi olarak hücrenin belirli parametrelerin, taklit koşullarda muhafaza edilebilir ve böylece solüsyon içinde kalır ve, örneğin, veya ilgi bir proteinin fizyolojik ilgili oligomerik devlet bir kompleksin bir teklif modeli doğrulamak için. farklı tampon koşullarında protein-protein etkileşimlerinin karakterizasyonu, eksik etki modellerinin oluşturulması, homoloji model arıtma ve deayrık katlanmış ve katlanmamış devletlerin sona ermesi hızlı ve kolay 5 yapılabilir. un-yorumlanabilir verilere yol açabilir toplanan veya denatüre örnekleri, parçacıkların karışımları, heterojen örnekleri, radyasyon hasarı ve tampon uyumsuzlukları: herhangi bir teknik olduğu gibi, BioSAXS içsel zayıflıkları vardır. Birçok analiz yöntemleri için, dolaylı örnek uygulamada elde etmek oldukça zordur bir gereklilik, tek dağılımlı olduğu kabul edilir. Birçok durumda, numunenin bozulması ince olduğunu ve kendi veri tespit edilemez ve verileri yorumlamak için herhangi bir girişimi yanlış, hatta yanıltıcı sonuçlar verir. Bu engelleri aşmak için, boyut dışlama kromatografisi (SEC) ve SAXS kombinasyonu veri kalitesini sağlamak ve giderek daha zor numuneler 6-11 için bu tekniğin daha erişilebilir hale getirmek için birçok ışın demetleri üzerinde uygulanmıştır. Son zamanlarda, online iyon değişimini geliştirerek repertuarına yeni bir yöntem ekledikromatografi (IEC) SAXS 12 -coupled. Her iki teknik analiz eskiden imkansız biyolojik parçacıkların geniş bir SAXS açıyoruz. kullanılacak yöntem seçimi ilgi partikülerinin biofiziksel özelliklerine bağlıdır. SEC görünür moleküler kütlede en az% 10&#39;luk bir fark ayrılması için gerekli olan, bunun sonucu olarak boyutuna göre makromolekülleri ayırır. kolon ve örneklerin fizyolojik özelliklerinin fiziksel sınırlamalar, hidrofobik yüzeylerin, esneklik ve istikrar eksikliği gibi, aynı zamanda veri toplama, analiz ve yorumlama zorlaştırıyor. IEC kolonuna dolayısıyla bağlanma afinitesine yüklerine göre molekülleri ayıran ve iyon değiştirme kromatografisi, yerine veya SEC ilave olarak kullanılabilir. toplam yük kolayca kontrol el için nispeten basit bir pH değiştirme ya da tampon tuzu konsantrasyonunu değişen sağlayarak manipüle edilebilirIEC sütundan moleküllerin Katkı. yükü kullanarak, aksi takdirde ayrı zor olan benzer türde ve moleküllerin boyutları ayrılması, IEC rutin gerçekleştirilebilir. Buna ek olarak, IEC bir protein denatüre potansiyel riski taşıyan konsantrasyon adımları önlemek için izin seyreltilmiş örnekleri ile başa çıkmak mümkün olma avantajına sahiptir. Yük dağılımı yüksek Örnek bağımlı olduğundan, bu, IEC pH ve tuz konsantrasyonlarında 13,14 ilgili optimizasyon gerektirir. Ifade saflaştırılması, veya her ikisi de zor olan birçok protein için, numunenin sadece düşük miktarlarda çalışma mevcuttur. Etkili olduğu ve bu nedenle, kayıp saflaştırma adımlarının sayısını en aza indirmek ve önemlidir. Bu nedenle, son saflaştırma adımı iyi bir veri seti toplama olasılığını artırmak amacıyla, çevrimiçi SAXS veri toplama doğrudan öncesidir. İşteBiz mevcut ve çevrimiçi SEC-SAXS ve IEC-SAXS karşılaştırın. Her iki teknik Grenoble, Fransa 15 Avrupa Sinkrotron Radyasyon Tesisi&#39;nde (SDBY) en BioSAXS beamline BM29 üzerinde uygulanmıştır. Bir test case olarak, diğer yöntemleri kullanarak yapısal analiz etmek oldukça zor oldu aşı virüsü proteininin D5, bir D5N ve helikaz domain kullanılır. aşı virüsü Poxviridae ailesinin bir üyesidir ve variola virüsü, küçük çiçeği nedeni% 98 aynıdır. aşı sistemini kullanarak, temel sarmal primaz D5 burada odaklanarak, çoğaltma makineleri çalışma. D5 sistein kümesi bir bölge (Res. 240-345) 16, ardından bir N-terminal Archeo-ökaryotik primaz (AEP) alan 16 ile 95 kDa proteinidir. Bundan başka Cı-terminalinde doğru D5N alanı (Res. 340-460) gelir, her D5 tipi helikazlar ile bağlantılı, ve son olarak bir süper 3 (SF3) helikas tanım olan (S. 460-785) 17 (Figüre 1 A). D5 helikas tanım dar DNA bağlanma için gerekli olan bir heksamerik halka yapısını oluşturur. Teşekkürler son SAXS ve EM çalışmalarına, primazm düşük çözünürlüklü yapıları ve sarmal alanları şimdi 18 bilinmektedir. Burada, D5 (323-785 kalıntısı) C-terminal parçası yapısı içgörü kazanmak için SDBY de BioSAXS beamline BM29 uygulanan çevrimiçi kromatografi teknikleri nasıl kullanacağınızı gösterir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4 dithiothreitol [DTT]</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gel</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>4561033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Phusion Flash PCR Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>F 548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetic acid glacial</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>20104.298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose D-5</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>LF45130653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra -15 Centrifugal filters Ultracel -30K</td>
			<td>Millipore Ltd</td>
			<td>UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0400-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Novagene</td>
			<td>70750-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue&#160;</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>8122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete protease inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11231400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Pac 10 DG Desalting column</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>732-2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>24388.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-6405-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HindIII</td>
			<td>Roche</td>
			<td>656313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisSelect HF Nickel Affinity Gel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>20252.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>AppliChem Panreac</td>
			<td>A1073,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstantBlue</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth Miller</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>L3152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc.</td>
			<td>191421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>27808.297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>ER0571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>C6010-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pProEx HTb vector&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>10711018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer</td>
			<td>&#160;Eurofins mwg operon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel extraction kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification kid</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>75746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 6 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5172-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA gel stain</td>
			<td>Invitrogen life technology</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 ligase</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>EL0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>home made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOP 10</td>
			<td>Invitrogen life technology</td>
			<td>C404003&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uno Q 1R column&#160;</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>720 0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>MPBiomedicals, LLC</td>
			<td>194834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beamline control software BsXCuBE</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camserver software</td>
			<td>Dectris</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>detector control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAMAVER</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>program to align ab initio models&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAMMIF</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>ab initio&#160; model reconstruction programm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC program Biologic Duo Flow</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC program LabSolutions</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPyB</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85.</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMUS</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>program, which performs the manipulation with experimental SAXS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyMOL</td>
			<td>DeLano Scientific LLC</td>
			<td>https://www.pymol.org/</td>
			<td>software for visualization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPCOMB</td>
			<td>ATSAS 2.6.0</td>
			<td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td>
			<td>program to superimpose 3D structures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLogic Duo Flow</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLogic Biofrac Fraction collector</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC system</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labsonic P</td>
			<td>Sartorius Stedim biotech</td>
			<td>BBI8535108</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

online size-exclusion and ion-exchange chromatography on a saxs beamline

Biyolojik küçük açı X-ışını saçılması (BioSAXS) çözeltisi yapısı, parçacık boyutu ve şekli, ve makromoleküller yüzey-hacim oranı belirlemek üzere kullanılan moleküler ve yapısal biyoloji güçlü bir tekniktir. Tekniği vb konsantrasyonları, pH değerleri, iyonik güçlü, sıcaklıklar, katkı maddeleri, geniş bir yelpazede uzanan çözelti koşulları çok çeşitli uygulanabilir, ancak örneği, tek dağılımlı olması gerekmektedir. Bu ihtar SAXS ışın demetleri üzerinde sıvı kromatografisi sistemlerinin uygulanmasına yol açtı. Burada, bir ışın-hattı üzerinde boyut dışlama (SEC) ve iyon değişim kromatografisi (IEC) yukarı entegrasyonu tarif uygun geri çıkarma ve veri azaltılması için farklı yöntemler. Bir örnek olarak, bir D5N helikas tanım aşağıdakilerden oluşan, esas aşı virüsü proteini D5 parça üzerindeki sek- ve IEC SAXS kullanımı açıklanmıştır. Biz th heksamerik yapısını gösteren, genel şeklini ve moleküler ağırlığı belirlemekE proteini.

Modelsiz değişmeyen analizinin sonuçları Tablo 1 &#39;de listelenmiştir. D5 323-785 SEC-SAXS verilerin analizi 338 kDa karşı 345 kDa (a poród analizinden) bir moleküler kütle tahmin gösterdi IEC SAXS kullanılarak gözlemlendi. Her ikisi de bir heksamer için 6 kez 53.5 kDa (321 kDa) beklenen kütle ile uyum içindedir. Her iki veri setinin ab initio modelleme hiçbir empoze simetri ile yapılmıştır (SEC-SAXS: χ 2 = 0.88, IEC-SAXS: χ 2 = 3.1) ve C6 simetrisi kullanarak (SEC-SAXS: χ 2 = 1.0, IEC-SAXS : χ 2 = 4). Her iki rekonstrüksiyon için yayılma verilerine genel uyan iki durumda (Şekil 1D ve E) karşılaştırılabilir olduğu için, C6 simetri varsayılabilir. Bu nedenle, bir model (SEC kısmen engellenmiş görünen bir merkezi kanal, bir altıgen koni benzeri bir yapı ile ilgilidir: Şekil 1F; IEC: <strong&gt; Şekil 1G, bindirme Şekil 1H). Ortalamanın önce bireysel modellerin incelenmesi bu tıkanıklık ortalama sürecinin bir dışlayıcı olması muhtemel olduğunu göstermektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54861/54861fig1x.jpg" /> Şekil 1: SAXS veri analizi ve karşılaştırma D5 323 -785 (şekil Kaynaklar 12 ve 18 uyarlanmıştır). D5 protein ve D5 323-785 A) şematik alan yapısı. B) Üç zirveleri göstergesi ile Çevrimdışı iyon değişim kromatogram. Turuncu eğrisi: 280 nm (au), mavi eğri de Absorbans: zirveleri tampon B tampon B. Yüzde yüzdesi belirtilir. C) Online iyon değişim kromatogram. B. olarak renk anahtarı Ayrıca, ölçülen yoğunluk, yeşil olarak gösterilir. Deneysel saçılma eğrisind SEC-SAXS D) ve IEC E) D5 323-785 veri analizi ile elde edilen modelin eğrisi hesaplanır. SEC veri ve G) IEC verilerine dayanarak D5 323-785 F) Boncuk modeli. SEC ve IEC modelleri H) Yerleşimi. F paneller) H) bir moleküler görüntüleme yazılımı 24 kullanılarak oluşturulmuştur. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54861/54861fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Veri toplama parametreleri </td><td></td></tr><tr><td> Enstrüman: </td><td> SDBY BM29 </td></tr><tr><td> Dalga boyu (A) </td><td> 0.99 </td></tr><tr><td> q-aralık (Å -1) </td><td> ,0032-,49 </td></tr><tr><td> Örnek-dedektör mesafesi </td><td> 2,864 m </td></tr><tr><td> Pozlama süresi (sn) </td><td> kare başına 1 </td></tr><tr><td> konsantrasyon aralığı </td><td> na </td></tr><tr><td> Sıcaklık (K) </td><td> 293 </td></tr><tr><td> detektör </td><td> Pilatus 1M (Dectris) </td></tr><tr><td> Akı (fotonlar / s) </td><td> 1 x 10 ila 12 </td></tr><tr><td> Işın boyutu (mikron 2) </td><td> 700 x 700 </td></tr><tr><td> D5 323-785, SEC için yapısal parametreleri </td><td></td></tr><tr><td> Ben 0 (cm-1) [guinier dan] </td><td> 0,0237 </td></tr><tr><td> Rg (A) [guinier dan] </td><td> 48 </td></tr><tr><td> R g dk q - Guinier için kullanılan Qmax Rg </td><td> 0,77-1,24 </td></tr><tr><td> Dmax (a) [p (r)] </td><td> 145 </td></tr><tr><td> p için kullanılan q-aralık (r) (Å -1)</td><td> 0,02-0,17 </td></tr><tr><td> Poród hacmi V (p Å 3) [Scatter dan] </td><td> (570 ± 5) 10 3 × </td></tr><tr><td> Moleküler kütle M r (kDa) [V p itibaren] </td><td> 345 </td></tr><tr><td> dizisinden monomerik Sn Hesaplanan (kDa) </td><td> 321 </td></tr><tr><td> D5 323-785, IEC için yapısal parametreleri </td><td></td></tr><tr><td> Ben 0 (cm-1) [guinier dan] </td><td> 0.386 </td></tr><tr><td> Rg (A) [guinier dan] </td><td> 46.5 ± 0.1 </td></tr><tr><td> R g dk q - Guinier için kullanılan Qmax Rg </td><td> 0,44-1,29 </td></tr><tr><td> Dmax (a) [p (r)] </td><td> 120 </td></tr><tr><td> p için kullanılan q-aralık (r) (Å -1) </td><td> 0,03-0,18 </td></tr><tr><td> Poród hacmi V (p &amp; #197; 3) [Scatter dan] </td><td> (577 ± 5) 10 3 × </td></tr><tr><td> Moleküler kütle M r (kDa) [V p itibaren] </td><td> 339 </td></tr><tr><td> dizisinden heksamerik Sn Hesaplanan (kDa) </td><td> 321 </td></tr></tbody></table> Tablo 1: SAXS veri parametreleri. tablo SAXS veri toplama ve analiz parametrelerini özetlemektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline at JoVE.com

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

Küçük açılı X-ışını yayma (SAXS) bir protein çözeltisi yapısının belirlenmesi tek dağılımlı örnekleri gerektirir. Burada, örnek hazırlama ile veri kazanımı arasında en az gecikme sağlamak için iki seçenek sunmak: Online boyut dışlama kromatografisi (SEC), çevrimiçi iyon değiştirme kromatografisi (IEC).

Bir SAXS beamline Online Boyut dışlama ve İyon değişim Kromatografi

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Yüksek işlem hacmi Caenorhabditis Elegans kimyasal tarama için basit bir yöntem

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Protein sindirimi, Ultrafiltrasyon ve boyutu dışlama Kromatografi insan kan plazması ve Serum Exosomes yalıtım en iyi duruma getirmek için

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

Protein ayrımı ve karakterizasyonu için birden fazla açıyla ışık saçılma (MALS) birleştiğinde iyon Kromatografi (IEX)

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Boyutlar-dışlama kromatografi ile çok açılı ışık saçılmasına bağlı proteinlerin karakterizasyonu (SEC-,)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Silikon Nitrür Membranları ve Synchrotron X-ışını Floresan Nano-Analizi için Kriyopreyeüzerine Hücre Kültürü

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Hedefsiz Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometresi Tabanlı Metabolomik Buğday Tanesi Analizi

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

EFA deconvolution ve Scatter ile SEC-SAXS verilerinin analizi

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Peptidoglikanın Sıvı Kromatografisi, Kütle Spektrometrisi ve Biyoinformatik ile Yarı Kantitatif Analizi

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

VMXm Beamline'da Mikrokristaller için Örnek Hazırlama Boru Hattı

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...