Name: an optimized protocol for electrophoretic mobility shift assay using infrared fluorescent dye-labeled oligonucleotides
Uploaded: 2016-11-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides at JoVE.com

This work was supported by an Alfred P. Sloan Research Fellowship (to C.-F.C.) and an NIH R01 grant (5R01GM098026-05 to C.-F.C.). We thank David Crowe for access to the advanced infrared imaging system.

OPMERKING: EMSA&#39;s via fluorescent gelabelde DNA probes of andere vormen van gelabelde DNA delen dezelfde protocollen voor eiwit of celextract bereiding, eiwit-DNA bindingsreactie en PAGE gel voorbereiding en actief (Figuur 1A). De belangrijkste verschillen zijn DNA labeling procedures, post-run gel processtappen, en detectiemethoden. 1. Gel Voorbereiding <ol><li> Bereid 5% natieve polyacrylamidegel die 0,5 x TBE (45 mM Tris-boraat, 1 mM EDTA) en 2,5% glycerol, met een mini-eiwit gelsysteem...

<ol>
	<li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assay+(EMSA)+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions.">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).</li><li>Ludwig, L. B., Hughes, B. J., Schwartz, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotinylated+probes+in+the+electrophoretic+mobility+shift+assay+to+examine+specific+dsDNA,+ssDNA+or+RNA-protein+interactions.">Biotinylated probes in the electrophoretic mobility shift assay to examine specific dsDNA, ssDNA or RNA-protein interactions.</a> Nucleic Acids Res. 23, 3792-3793 (1995).</li><li>Engler-Blum, G., Meier, M., Frank, J., Muller, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+background+problems+in+nonradioactive+northern+and+Southern+blot+analyses+enables+higher+sensitivity+than+32P-based+hybridizations.">Reduction of background problems in nonradioactive northern and Southern blot analyses enables higher sensitivity than 32P-based hybridizations.</a> Anal Biochem. 210, 235-244 (1993).</li><li>Jing, D., Agnew, J., Patton, W. F., Hendrickson, J., Beechem, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+two-color+electrophoretic+mobility+shift+assay+for+detecting+both+nucleic+acids+and+protein+in+gels.">A sensitive two-color electrophoretic mobility shift assay for detecting both nucleic acids and protein in gels.</a> Proteomics. 3, 1172-1180 (2003).</li><li>Alqadah, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmitotic+diversification+of+olfactory+neuron+types+is+mediated+by+differential+activities+of+the+HMG-box+transcription+factor+SOX-2.">Postmitotic diversification of olfactory neuron types is mediated by differential activities of the HMG-box transcription factor SOX-2.</a> EMBO J. 34, 2574-2589 (2015).</li><li>Jullien, N., Herman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LUEGO:+a+cost+and+time+saving+gel+shift+procedure.">LUEGO: a cost and time saving gel shift procedure.</a> Biotechniques. 51, 267-269 (2011).</li><li>Poulin-Laprade, D., Burrus, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+Mobility+Shift+Assay+Using+Radiolabeled+DNA+Probes.">Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Radiolabeled DNA Probes.</a> Methods Mol Biol. 1334, 1-15 (2015).</li><li>Ruscher, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence+based+non-radioactive+electrophoretic+mobility+shift+assay.">A fluorescence based non-radioactive electrophoretic mobility shift assay.</a> J Biotechnol. 78, 163-170 (2000).</li><li>Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+approaches+to+monitor+protein-nucleic+acid+interactions+using+fluorescent+probes.">Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes.</a> RNA. 17, 14-20 (2011).</li><li>Alqadah, A., Hsieh, Y. W., Chuang, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2+goes+beyond+stem+cell+biology.">Sox2 goes beyond stem cell biology.</a> Cell cycle. , (2016).</li><li>Larouche, K., Bergeron, M. J., Leclerc, S., Guerin, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+competitor+poly(dI-dC).poly(dI-dC)+levels+is+advised+in+DNA-protein+interaction+studies+involving+enriched+nuclear+proteins.">Optimization of competitor poly(dI-dC).poly(dI-dC) levels is advised in DNA-protein interaction studies involving enriched nuclear proteins.</a> Biotechniques. 20, 439-444 (1996).</li><li>Sorenson, A. E., Schaeffer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+detection+of+biotin-protein+conjugates+with+a+green+fluorescent+streptavidin+probe.">In-gel detection of biotin-protein conjugates with a green fluorescent streptavidin probe.</a> Anal. Methods. 7, 2087-2092 (2015).</li><li>Onizuka, T., Endo, S., Hirano, M., Kanai, S., Akiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+fluorescent+electrophoretic+mobility+shift+assay+improved+for+the+quantitative+and+multiple+analysis+of+protein-DNA+complexes.">Design of a fluorescent electrophoretic mobility shift assay improved for the quantitative and multiple analysis of protein-DNA complexes.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 66, 2732-2734 (2002).</li><li>Steiner, S., Pfannschmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+electrophoretic+mobility+shift+assay+in+the+analysis+of+DNA-binding+proteins.">Fluorescence-based electrophoretic mobility shift assay in the analysis of DNA-binding proteins.</a> Methods Mol Biol. 479, 273-289 (2009).</li></ol>

fEMSAs zijn een efficiënt instrument om eiwit-DNA interacties te onderzoeken, en zijn een alternatief voor radioactieve labeling van DNA. Fluorescerende kleurstoffen zoals infrarood kleurstoffen zijn commercieel verkrijgbaar, en een veiligere en milieuvriendelijkere manier dan radioactieve DNA labeling. EMSA&#39;s met behulp van infrarood fluorescerende kleurstof gemerkte oligonucleotiden vereisen geen postrun gel processtappen, en dus tijd en kosten te besparen in vergelijking met andere DNA-labeltechnieken. De tijd t...

EMSA&#39;s worden gebruikt om de interacties tussen DNA en eiwitten geanalyseerd door natieve polyacrylamidegelelektroforese (PAGE) een mengsel van een eiwit van interesse en een gemerkte DNA-probe die potentiële doelplaatsen van het eiwit 1 te lossen. Een DNA probe gebonden met proteïne migreert langzamer vergeleken met een vrij DNA probe, en derhalve vertraagd in zijn migratie door een polyacrylamide-matrix. Radioactief merken van DNA door 32 P is de belangrijkste methode voor de detectie in EMSA&#39;s geweest. Hoewel de toepassing van radioactief merken in biochemisch onderzoek gunstig is geweest, zijn de methoden van alternatieve DNA labeling met vergelijkbare gevoeligheid wordt ingezet als gevolg van de gezondheids- en veiligheidsrisico&#39;s in verband met de behandeling van radioactiviteit. Deze alternatieve werkwijzen omvatten conjugatie van biotine DNA met 2 of digoxigenine (DIG) 3 (beide worden vervolgens gedetecteerd door chemiluminescentie systemen), SYBR groen kleuring van de gels PAGE 4,of directe detectie van DNA-fluorescente kleurstof conjugaten door het scannen van de gel 5,6. De opgeloste gels EMSA&#39;s gebruikt radioactief gemerkte DNA-probes vereisen postrun verwerking, autoradiografie films of fosforimager systeem radioactieve signalen 1,7 detecteren. Gels EMSA gebruik biotine- 2 of DIG-geconjugeerd 3 DNA probes moeten worden verwerkt en overgebracht op een geschikt membraan en gedetecteerd door chemiluminescentie 6. SYBR groene kleuring van de gel vereist postrun gel kleuring en fluorescentie scanner 4. Aangezien postrun gel bewerkingsstappen zijn vereist voor EMSA&#39;s met behulp van deze DNA-labeling-technieken, kunnen de omgezette gel slechts eenmaal getest. Daarentegen kunnen DNA-probes gelabeld met fluoroforen direct worden gedetecteerd in de gel in de glasplaten met een scanner. Daarom kan de DNA-eiwit interacties worden gevolgd en meerdere malen op verschillende tijdstippen getest tijdens de vlucht, dievermindert de tijd en kosten. De DNA-fluorescerende kleurstof conjugaten die zijn gebruikt voor EMSA&#39;s omvatten Cy3 6,8, 6,8 Cy5, fluoresceïne 9 en infrarood fluorescerende kleurstoffen 4-6. Gentranscriptieregulatie vereist eiwit-DNA interacties van transcriptiefactoren en hun target genen. De coördinatie van deze interacties genereert diverse celtypen vanuit een gemeenschappelijke voorouder tijdens de ontwikkeling van dieren. Een onpartijdige forward genetische screen identificeerde een missense mutatie, G73E, in de sterk geconserveerd HMG DNA-bindende domein van de Caenorhabditis elegans transcriptiefactor SOX-2. De mutatie resulteert in een cel identiteit transformatie van AWB olfactorische neuronen in AWC olfactorische neuronen op moleculair, morfologische en functionele niveaus 5,10. SOX-2 regelt differentieel de terminal differentiatie van AWB en AWC neuronen door interactie met context-afhankelijke partner transcriptiefactoren en de respectieveDNA doelplaatsen 5,10. SOX-2 partners met LIM-4 (LHX) in terminal AWB neuronale differentiatie, terwijl de SOX-2 partners met CEH-36 (OTX / OTD) in terminal AWC neuronale differentiatie. Luciferase reporter assays tonen aan dat SOX-2 en mutant SOX-2 G73E eiwitten coöperatieve interacties met cofactoren transcriptionele LIM-4 en CEH-36 een promoter uitgedrukt in AWB en AWC neuronen activeren. Echter, SOX-2 en mutant SOX-2 G73E weergegeven differentiële activering eigenschappen van de promotor. Om de moleculaire basis van differentiële DNA bindingsactiviteiten van SOX-2 en SOX-2 G73E te onderzoeken werden uitgevoerd fEMSAs met deze eiwitten en de potentiële doelplaatsen. Eerst werd een bioinformatica aanpak om de biologisch relevante DNA bindende sequenties in het promotorgebied 1 kb gebruikt in de luciferase assay identificeren. Sinds meerdere potentiële SOX-2 bindende locaties in de promotor aanwezig waren, hebben we ons gerichton voorspelde SOX-2 bindingsplaatsen naast vermeende CEH-36 of LIM-4-bindende plaatsen en evolutionair geconserveerd tussen verschillende soorten aaltjes. Deze sequenties werden gedeleteerd of gemuteerd, en vervolgens in vivo getest op hun activiteit GFP reporter transgenen in AWB of AWC neuronen tot expressie. Door deze benadering identificeerden we potentiële LIM-4 / SOX-2 en CEH-36 / SOX-2 aangrenzende doelplaatsen die specifiek zijn voor de expressie van GFP in AWB en AWC neuronen respectievelijk 5 vereist. We onderzochten de mogelijke verschillen in de DNA-binding van SOX-2 en SOX-2 G73E behulp van Femsa met de geïdentificeerde LIM-4 / SOX-2 en CEH-36 / SOX-2 aangrenzende doelwit sites. Onze analyse toonde aan dat EMSA SOX-2 G73E de DNA-probe die de LIM-4 / SOX-2 aangrenzende doelplaatsen (vereist voor genexpressie in AWB) niet zo efficiënt WT SOX-2 deed niet binden. Echter, SOX-2 en SOX-2 G73E had geen verschil in het binden van de DNA-probe die het CEH-36 / SOX-2 adjacent target site (die nodig zijn voor genexpressie in AWC) 5,10. Onze analyses geven FEMSA mechanistisch inzicht in de aard van de SOX-2 G73E-mutatie in zowel het gebruik van DNA-bindingsactiviteit van de AWB naar AWC celidentiteit transformatiefenotype. Hier beschrijven we een geoptimaliseerd protocol van FEMSA met gezuiverd 6xHis-SOX-2 of 6xHis-SOX-2 G73E samen met infrarood fluorescerende kleurstof gemerkte DNA-probes met de LIM-4 / SOX-2 aangrenzende doelplaatsen als een case study aan te pakken een belangrijke biologische vraag.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1019">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:207px;">1610158</td>
			<td style="width:281px;">Acrylamide is harmful and toxic.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">6x-His Epitope Tag Antibody (HIS.H8)</td>
			<td style="width:199px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:207px;">MA1-21315</td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Anti Flag M2 antibody&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">F3165-.2MG</td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Bovine Serum Albumin molecular-biology-grade</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:207px;">B9000S</td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:332px;">5&#39;IRDye700-labeled DNA Oligos</td>
			<td style="width:199px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:207px;">Custom DNA oligo</td>
			<td style="width:281px;">These are referred as 5&#39;Dye-labeled or infrared fluorescent dye-labeled DNA oligos in the manuscript. The company will custom synthesize 5&#39; IRDye labeled DNA oligonucleotides.&#160; Requires minimum 100&#956;M scale synthesis and HPLC purification.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Klenow Fragment (3&#39;--&#62;5&#39; exo-)</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:207px;">M0212S</td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">LightShif Poly (dI-dC)</td>
			<td style="width:199px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:207px;">20148E</td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:332px;">Mini-PROTEAN&#160;Vertical Electrophoresis Cell&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:207px;">1658000FC&#160;</td>
			<td style="width:281px;">This is referred as a mini protein gel system in the manuscript. Any electrophoretic system can be used as long as they are clear glass plates of less than 25cm x 25cm in size.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:332px;">Odyssey CLx Infrared Imaging System</td>
			<td style="width:199px;">LI-COR Biotechnology</td>
			<td style="width:207px;">Odyssey CLx Infrared Imagng System</td>
			<td style="width:281px;">This is referred as an advanced infrared imaging system in the mansucript.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Odyssey Fc Imaging System&#160;</td>
			<td style="width:199px;">LI-COR Biotechnology</td>
			<td style="width:207px;">Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System</td>
			<td style="width:281px;">This is referred as a near-infrared fluorescent imaging system primarily for Western blots in the mansucript.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:332px;">Image Studio software (version 4.0)</td>
			<td style="width:199px;">LI-COR Biotechnology</td>
			<td style="width:207px;">Image Studio software&#160;</td>
			<td style="width:281px;">This is referred as a particular imaging software in the mansucript.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Orange G</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">O3756-25G</td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">6x Orange loading dye</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td>0.25% Orange G; 30% Glycerol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5x TBE</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td>45 mM Tris-Borate; 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">1x TE</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td>10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH8.0</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:332px;">1x STE</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:281px;">100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH8.0; 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">5x Binding Buffer</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:281px;">50 mM Tris-HCl, pH7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH8.0; 5 mM DTT; 250 ug/ml BSA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an optimized protocol for electrophoretic mobility shift assay using infrared fluorescent dye-labeled oligonucleotides

Elektroforetische mobiliteit (EMSA) zijn instrumenteel middel om de interacties tussen eiwitten en hun doel DNA-sequenties te karakteriseren. Radioactiviteit de meest gangbare DNA labeling in EMSA&#39;s geweest. Echter, recente vorderingen in fluorescente kleurstoffen en scanmethodes het gebruik van fluorescerende tagging van DNA als alternatief voor radioactiviteit de voordelen van eenvoudige bediening gevraagd, bespaart tijd, lagere kosten en betere veiligheid. We hebben recent gebruikte fluorescerende EMSA (FEMSA) om met succes een belangrijke biologische vraag. Onze FEMSA analyse geeft mechanistisch inzicht in het effect van een missense mutatie, G73E, in de sterk geconserveerd HMG transcriptiefactor SOX-2 op olfactorische soort neuron diversificatie. We vonden dat mutant SOX-2 G73E eiwit verandert specifieke DNA-bindende activiteit, waardoor olfactorische neuron identiteit transformatie veroorzaken. Hier presenteren we een optimale en kosteneffectieve stap-voor-stap protocolvoor FEMSA met behulp van infrarood fluorescerende kleurstof gemerkte oligonucleotiden die de LIM-4 / SOX-2 aangrenzende doelplaatsen en gezuiverd SOX-2 eiwitten (WT en mutant SOX-2 G73E eiwitten) als biologisch voorbeeld.

Oranje G ladingskleurstof (6x: 0,12 g oranje G in 100 ml 30% glycerol) kan de bindingsreactie toegevoegd vóór het laden om de voortgang van de elektroforese zichtbaar. Overige laad- kleurstoffen zoals broomfenolblauw zal worden gedetecteerd tijdens het scannen en dus interfereren met beeldanalyse (Figuur 1B). In sommige gevallen van EMSA&#39;s, vooral als nucleair extract preparaat gebruikt, poly-deoxyinosin...

Watch this Scientific Journal Video about An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides at JoVE.com

An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

We beschrijven hier een geoptimaliseerd protocol van TL-elektroforetische mobiliteit shift assays (Femsa) met behulp van gezuiverd SOX-2 eiwitten in combinatie met infrarood fluorescerende kleurstof gemerkte DNA-probes als een case study van een belangrijke biologische kwestie aan te pakken.

Een geoptimaliseerde protocol voor Electroforetische Mobility Shift Assay Met behulp van infrarood fluorescerende kleurstof-gemerkte oligonucleotiden

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

Geoptimaliseerd Protocol voor de Extractie van Proteïnen uit de Human Mitral Valve

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

DNA-Polymerase activiteit Assay gebruikend nabij-infrarood fluorescerende gelabelde DNA gevisualiseerd door Acrylamide Gel elektroforese

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detectie van Heterodimerization van eiwit Isoforms met behulp van een in Situ nabijheid afbinding Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

Oplossing van de structuur van de Fluorescent Protein Cerulean met behulp van MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Enkele liposoom metingen voor de studie van Proton-pompende membraan enzymen met behulp van de elektrochemie en Fluorescent microscopie

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Lokalisatie van SUMO-gemodificeerde eiwitten met behulp van fluorescerende Sumo-trapping eiwitten

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Karakteriseren van individuele eiwit aggregaten door infrarood nano spectroscopie en Atoom kracht microscopie

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay voor kwantitatieve bepaling van palmitoylation van Brain Membrane Eiwitten

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...

An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants

Een op elektrochemiluminescentie gebaseerde test voor MeCP2-eiwitvarianten

The ECLIA is a versatile method which is able to quantify endogenous and recombinant protein amounts in a 96-well format. To demonstrate ECLIA efficiency, ...

Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein

Beoordeling van cellulaire oxidatie met behulp van een subcellulair compartiment-specifieke Redox-gevoelige groene fluorescerende eiwitten

Measuring the intracellular oxidation/reduction balance provides an overview of the physiological and/or pathophysiological redox status of an organism. ...