Name: an optimized protocol for electrophoretic mobility shift assay using infrared fluorescent dye-labeled oligonucleotides
Uploaded: 2016-11-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides at JoVE.com

This work was supported by an Alfred P. Sloan Research Fellowship (to C.-F.C.) and an NIH R01 grant (5R01GM098026-05 to C.-F.C.). We thank David Crowe for access to the advanced infrared imaging system.

NOTA: EMSAs usando sondas de DNA marcadas com fluorescência ou outras formas de ADN marcado partilham os mesmos protocolos para a preparação de proteína ou extracto celular, reacção de ligação proteína-ADN, e a preparação de gel de PAGE e execução (Figura 1A). As principais diferenças são procedimentos de ADN de rotulagem, etapas de processamento gel pós-run, e métodos de detecção. 1. Preparação do gel <ol><li> Prepare 5% de gel de poliacrilamida nativa contendo TBE 0,5x (...

<ol>
	<li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assay+(EMSA)+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions.">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).</li><li>Ludwig, L. B., Hughes, B. J., Schwartz, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotinylated+probes+in+the+electrophoretic+mobility+shift+assay+to+examine+specific+dsDNA,+ssDNA+or+RNA-protein+interactions.">Biotinylated probes in the electrophoretic mobility shift assay to examine specific dsDNA, ssDNA or RNA-protein interactions.</a> Nucleic Acids Res. 23, 3792-3793 (1995).</li><li>Engler-Blum, G., Meier, M., Frank, J., Muller, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+background+problems+in+nonradioactive+northern+and+Southern+blot+analyses+enables+higher+sensitivity+than+32P-based+hybridizations.">Reduction of background problems in nonradioactive northern and Southern blot analyses enables higher sensitivity than 32P-based hybridizations.</a> Anal Biochem. 210, 235-244 (1993).</li><li>Jing, D., Agnew, J., Patton, W. F., Hendrickson, J., Beechem, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+two-color+electrophoretic+mobility+shift+assay+for+detecting+both+nucleic+acids+and+protein+in+gels.">A sensitive two-color electrophoretic mobility shift assay for detecting both nucleic acids and protein in gels.</a> Proteomics. 3, 1172-1180 (2003).</li><li>Alqadah, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmitotic+diversification+of+olfactory+neuron+types+is+mediated+by+differential+activities+of+the+HMG-box+transcription+factor+SOX-2.">Postmitotic diversification of olfactory neuron types is mediated by differential activities of the HMG-box transcription factor SOX-2.</a> EMBO J. 34, 2574-2589 (2015).</li><li>Jullien, N., Herman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LUEGO:+a+cost+and+time+saving+gel+shift+procedure.">LUEGO: a cost and time saving gel shift procedure.</a> Biotechniques. 51, 267-269 (2011).</li><li>Poulin-Laprade, D., Burrus, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+Mobility+Shift+Assay+Using+Radiolabeled+DNA+Probes.">Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Radiolabeled DNA Probes.</a> Methods Mol Biol. 1334, 1-15 (2015).</li><li>Ruscher, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence+based+non-radioactive+electrophoretic+mobility+shift+assay.">A fluorescence based non-radioactive electrophoretic mobility shift assay.</a> J Biotechnol. 78, 163-170 (2000).</li><li>Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+approaches+to+monitor+protein-nucleic+acid+interactions+using+fluorescent+probes.">Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes.</a> RNA. 17, 14-20 (2011).</li><li>Alqadah, A., Hsieh, Y. W., Chuang, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2+goes+beyond+stem+cell+biology.">Sox2 goes beyond stem cell biology.</a> Cell cycle. , (2016).</li><li>Larouche, K., Bergeron, M. J., Leclerc, S., Guerin, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+competitor+poly(dI-dC).poly(dI-dC)+levels+is+advised+in+DNA-protein+interaction+studies+involving+enriched+nuclear+proteins.">Optimization of competitor poly(dI-dC).poly(dI-dC) levels is advised in DNA-protein interaction studies involving enriched nuclear proteins.</a> Biotechniques. 20, 439-444 (1996).</li><li>Sorenson, A. E., Schaeffer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+detection+of+biotin-protein+conjugates+with+a+green+fluorescent+streptavidin+probe.">In-gel detection of biotin-protein conjugates with a green fluorescent streptavidin probe.</a> Anal. Methods. 7, 2087-2092 (2015).</li><li>Onizuka, T., Endo, S., Hirano, M., Kanai, S., Akiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+fluorescent+electrophoretic+mobility+shift+assay+improved+for+the+quantitative+and+multiple+analysis+of+protein-DNA+complexes.">Design of a fluorescent electrophoretic mobility shift assay improved for the quantitative and multiple analysis of protein-DNA complexes.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 66, 2732-2734 (2002).</li><li>Steiner, S., Pfannschmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+electrophoretic+mobility+shift+assay+in+the+analysis+of+DNA-binding+proteins.">Fluorescence-based electrophoretic mobility shift assay in the analysis of DNA-binding proteins.</a> Methods Mol Biol. 479, 273-289 (2009).</li></ol>

fEMSAs são um instrumento eficaz para investigar interacções DNA-proteínas, e são uma alternativa à marcação radioactiva de ADN. corantes fluorescentes, tais como corantes de infravermelho estão comercialmente disponíveis, e proporcionar um método mais seguro e respeitador do ambiente em relação a marcação de ADN radioactivo. EMSAs usando fluorescentes infravermelho oligonucleotídeos marcados com corante não requerem etapas de processamento gel postrun, e, portanto, economizar tempo e custo em comparaç...

EMSAs são utilizados para a análise da interacção entre o ADN e as proteínas nativas usando electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) para resolver uma mistura de uma proteína de interesse e uma sonda de ADN marcado contendo potenciais locais alvo da proteína 1. Uma sonda de ADN ligado com proteína migrarão mais lenta em comparação com uma sonda de ADN livre, e é, por conseguinte, retardado na sua migração através de uma matriz de poliacrilamida. A radiomarcação de ADN por 32 P tem sido o método predominante para a detecção em EMSAs. Embora a aplicação de marcação radioactiva na pesquisa bioquímica tem sido benéfica, os métodos de rotulagem DNA alternativa com sensibilidade comparável estão sendo empregados devido aos riscos de saúde e segurança associados com a manipulação de radioatividade. Estes métodos alternativos incluem a conjugação de ADN com biotina ou digoxigenina 2 (DIG) 3 (ambos os quais são então detectados por sistemas quimioluminescentes), SYBR verde de coloração dos géis página 4,ou detecção direta de conjugados de corante de ADN fluorescente por digitalizar a 5,6 gel. Os géis resolvidos de EMSAs usando sondas de DNA marcadas radioactivamente requerem processamento postrun através de filmes auto-radiografia ou um sistema de phosphorimager para detectar sinais radioativos 1,7. Géis de EMSAs utilizando biotina ou 2-DIG conjugados com as sondas de ADN 3 também devem ser processados e transferidos para uma membrana adequada e, em seguida, detectados por quimioluminescência 6. SYBR coloração verde do gel requer coloração de gel postrun e um scanner fluorescente 4. Uma vez que as etapas de processamento de gel postrun são necessários para EMSAs utilizando estas técnicas de marcação de ADN, o gel pode ser resolvido ensaiados apenas uma vez. Em contraste, as sondas de ADN marcadas com fluoróforos pode ser detectada directamente no gel no interior das placas de vidro por um scanner. Portanto, as interacções ADN-proteína podem ser monitorizadas e ensaiado várias vezes a diferentes pontos de tempo durante a execução, quereduz significativamente o tempo e custo. Os conjugados de corante de ADN fluorescente que têm sido utilizados para EMSAs incluem 6,8 Cy3, Cy5 6,8, 9 fluoresceína, e corantes fluorescentes infravermelhos 4-6. A regulação transcricional requer interacções proteína-ADN de factores de transcrição e os seus genes-alvo. A coordenação dessas interações gera diversos tipos de células a partir de um antepassado comum durante o desenvolvimento animal. Uma frente tela genética não distorcida identificada uma mutação sem sentido, G73E, no domínio de ligação ao ADN de HMG altamente conservada do factor de transcrição de Caenorhabditis elegans SOX-2. Os resultados de mutação em uma transformação identidade da célula de AWB neurônios olfativos em AWC neurônios olfativos em níveis moleculares, morfológicos e funcionais 5,10. SOX-2 diferencialmente regula a diferenciação terminal dos neurônios AWB e AWC, interagindo com fatores sócio de transcrição dependentes do contexto e respectivaLocais-alvo DNA 5,10. SOX-2 parceiros com LIM-4 (LHX) no terminal de AWB diferenciação neuronal, enquanto SOX-2 parceiros com CEH-36 (OTX / DTA) na diferenciação neuronal AWC terminal. Ensaios de repórter de luciferase mostram que SOX-2 e da SOX-2 mutantes proteínas G73E ter interações de cooperação com co-factores de transcrição LIM-4 e CEH-36 para ativar um promotor expresso em neurônios AWB e AWC. No entanto, SOX-2 e mutante SOX-2 G73E exibido propriedades de activação diferencial do promotor. Para investigar a base molecular da actividade de ligação ao ADN diferenciais de SOX-2 e SOX-2 G73E, fEMSAs foram realizados com estas proteínas e os seus locais alvo potenciais. Em primeiro lugar, uma abordagem foi feita bioinformática para identificar as sequências de ligação no interior da região promotora do 1 kb usado no ensaio de luciferase de ADN biologicamente relevante. Desde várias-2 SOX locais de ligação potenciais estavam presentes ao longo do promotor, nós nos concentramosem sítios de ligação de SOX-2 preditos adjacentes ao putativo CEH-36 ou LIM-4 locais de ligação e evolutivamente conservados entre várias espécies de nemátodos. Estas sequências foram excluídos ou mutado, e posteriormente testado in vivo para a sua actividade para expressar transgenes repórter GFP em neurónios AWB ou AWC. Através desta abordagem, identificou potenciais LIM-4 / SOX-2 e CEH-36-2 SOX locais alvo adjacentes / que são especificamente necessárias para a expressão de GFP em neurónios AWB AWC e 5, respectivamente. Nós investigamos as diferenças potenciais no DNA ligação de SOX-2 e da SOX-2 G73E usando FEMSA com as CEH-36 / SOX-2 locais alvo adjacentes identificadas LIM-4 / SOX-2 e. Nossa análise EMSA mostraram que SOX-2 G73E não se ligou a sonda de DNA contendo os LIM-4 / SOX-2 locais alvo adjacentes (necessários para a expressão do gene em AWB) tão eficientemente quanto WT SOX-2 fez. No entanto, SOX-2 e da SOX-2 G73E não tinha diferença na ligação da sonda de DNA contendo o CEH-36 / SOX-2 umsite de destino djacent (necessária para a expressão de genes em AWC) 5,10. O nosso femsa análises fornecem uma visão mecanicista para a natureza da mutação G73E SOX-2 em afectar a actividade de ligação do ADN específico para a transformação de células fenótipo identidade AWB-a-AWC. Aqui, descrevemos um protocolo otimizado da Femsa usando 6xHis-SOX-2 purificadas ou 6xHis-SOX-2 G73E em conjunto com sondas de DNA marcadas com corante fluorescente no infravermelho contendo os LIM-4 / SOX-2 locais alvo adjacentes como estudo de caso para enfrentar uma importante questão biológica.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1019">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:207px;">1610158</td>
			<td style="width:281px;">Acrylamide is harmful and toxic.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">6x-His Epitope Tag Antibody (HIS.H8)</td>
			<td style="width:199px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:207px;">MA1-21315</td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Anti Flag M2 antibody&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">F3165-.2MG</td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Bovine Serum Albumin molecular-biology-grade</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:207px;">B9000S</td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:332px;">5&#39;IRDye700-labeled DNA Oligos</td>
			<td style="width:199px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:207px;">Custom DNA oligo</td>
			<td style="width:281px;">These are referred as 5&#39;Dye-labeled or infrared fluorescent dye-labeled DNA oligos in the manuscript. The company will custom synthesize 5&#39; IRDye labeled DNA oligonucleotides.&#160; Requires minimum 100&#956;M scale synthesis and HPLC purification.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Klenow Fragment (3&#39;--&#62;5&#39; exo-)</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:207px;">M0212S</td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">LightShif Poly (dI-dC)</td>
			<td style="width:199px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:207px;">20148E</td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:332px;">Mini-PROTEAN&#160;Vertical Electrophoresis Cell&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:207px;">1658000FC&#160;</td>
			<td style="width:281px;">This is referred as a mini protein gel system in the manuscript. Any electrophoretic system can be used as long as they are clear glass plates of less than 25cm x 25cm in size.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:332px;">Odyssey CLx Infrared Imaging System</td>
			<td style="width:199px;">LI-COR Biotechnology</td>
			<td style="width:207px;">Odyssey CLx Infrared Imagng System</td>
			<td style="width:281px;">This is referred as an advanced infrared imaging system in the mansucript.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Odyssey Fc Imaging System&#160;</td>
			<td style="width:199px;">LI-COR Biotechnology</td>
			<td style="width:207px;">Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System</td>
			<td style="width:281px;">This is referred as a near-infrared fluorescent imaging system primarily for Western blots in the mansucript.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:332px;">Image Studio software (version 4.0)</td>
			<td style="width:199px;">LI-COR Biotechnology</td>
			<td style="width:207px;">Image Studio software&#160;</td>
			<td style="width:281px;">This is referred as a particular imaging software in the mansucript.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Orange G</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">O3756-25G</td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">6x Orange loading dye</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td>0.25% Orange G; 30% Glycerol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5x TBE</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td>45 mM Tris-Borate; 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">1x TE</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td>10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH8.0</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:332px;">1x STE</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:281px;">100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH8.0; 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">5x Binding Buffer</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:281px;">50 mM Tris-HCl, pH7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH8.0; 5 mM DTT; 250 ug/ml BSA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an optimized protocol for electrophoretic mobility shift assay using infrared fluorescent dye-labeled oligonucleotides

Ensaios de deslocamento da mobilidade electrof orética (EMSA) são uma ferramenta fundamental para caracterizar as interacções entre proteínas e suas sequências de ADN alvo. A radioactividade tem sido o método predominante de marcação de ADN em EMSAs. No entanto, avanços recentes em corantes fluorescentes e métodos de verificação ter solicitado o uso de marcação fluorescente de ADN como uma alternativa para radioactividade para as vantagens de fácil manuseamento, economia de tempo, reduzindo o custo, e melhorando a segurança. Nós temos usado recentemente EMSA fluorescente (Femsa) para tratar com sucesso uma questão biológica importante. Nossa análise FEMSA oferece uma visão mecanicista sobre o efeito de uma mutação missense, G73E, no altamente conservada fator de transcrição HMG SOX-2 no tipo de neurônio diversificação olfativo. Descobrimos que mutantes SOX-2 proteína G73E altera a atividade de ligação específica de DNA, causando transformação neurônio identidade olfativa. Aqui, apresentamos um otimizado e rentável passo-a-passo protocolopara FEMSA usando fluorescentes infravermelho oligonucleotídeos marcados com corante contendo os LIM-4 / SOX-2 locais alvo adjacentes e proteínas purificadas SOX-2 (WT e as proteínas mutantes G73E SOX-2) como um exemplo biológico.

Orange G corante de carga (6x: 0,12 g Laranja G em 100 ml de glicerol a 30%) pode ser adicionada à reacção de ligação antes do carregamento para visualizar o progresso da electroforese. Outros corantes de carga, incluindo azul de bromofenol vai ser detectadas durante a análise e, portanto, interferir com a análise de imagem (Figura 1B). Em alguns casos de EMSAs, especialmente se a preparação de extrac...

Watch this Scientific Journal Video about An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides at JoVE.com

An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

Descrevemos aqui um protocolo otimizado de ensaios fluorescentes eletroforética de desvio de mobilidade (Femsa) usando SOX-2 proteínas purificadas em conjunto com sondas de DNA infravermelhos fluorescentes marcadas com corante como um estudo de caso para resolver uma questão biológica importante.

Um protocolo otimizado para a mobilidade eletroforética ensaio de desvio usando oligonucleotídeos Infrared corante fluorescente-etiquetados

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

Protocolo otimizado para a extração de proteínas da válvula mitral humana

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

Bioquímica

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

Ensaio da atividade de DNA polimerase usando infravermelho fluorescente etiquetado DNA visualizado pela electroforese do Gel do acrilamido

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Deteção de Heterodimerization de isoformas de proteínas usando um ensaio de ligadura de proximidade em Situ

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

Solução de estrutura da proteína fluorescente Cerulean usando MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Medições de lipossoma único para o estudo das enzimas de membrana de bombeamento de prótons usando microscopia fluorescente e eletroquímica

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Localização de proteínas SUMO-modificadas usando proteínas de captura de sumo fluorescentes

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Caracterização de agregados proteicos individuais por Nanoespectroscopia infravermelha e microscopia de força atômica

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

Ensaio de mudança de gel de troca acila-PEGyl para determinação quantitativa de palmitoilação de proteínas de membrana cerebral

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...

An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants

Um ensaio baseado em eletroquimiluminescência para variantes de proteína MeCP2

The ECLIA is a versatile method which is able to quantify endogenous and recombinant protein amounts in a 96-well format. To demonstrate ECLIA efficiency, ...

Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein

Avaliação da oxidação celular usando uma proteína fluorescente verde específica do compartimento subcelular

Measuring the intracellular oxidation/reduction balance provides an overview of the physiological and/or pathophysiological redox status of an organism. ...