Name: analysis of simian immunodeficiency virus-specific cd8+ t-cells in rhesus macaques by peptide-mhc-i tetramer staining
Uploaded: 2016-12-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining at JoVE.com

Nós gostaríamos de agradecer a David Watkins para apoiar os experimentos que permitiram a otimização da presente metodologia. Pesquisa relatada nesta publicação foi apoiado em parte por uma concessão piloto fornecido pelo Centro de Miami para Pesquisa da AIDS dos Institutos Nacionais de Saúde com o número prêmio P30AI073961. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

As amostras de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) utilizados neste manuscrito foram obtidos a partir de macacos rhesus Indiana alojados no Wisconsin National Primate Research Center. Estes animais foram tratados de acordo com o Relatório de Weatherall sob um protocolo aprovado pela Universidade de Wisconsin Animal Care Graduate School e Use Committee 33. Todos os procedimentos com animais foram realizados sob anestesia e todos os esforços foram feitos para minimizar o potencial sofrimento. <p class="jove_ti...

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A poucos passos nesta discussão mérito procedimento como eles são cruciais para produzir resultados ideais. Em primeiro lugar, uma vez que a qualidade das amostras biológicas é um forte indicador de sucesso de qualquer ensaio de citometria de fluxo 38, devem ser tomados todos os cuidados para garantir que as células são viáveis e em suspensão durante o processo de coloração. Isto é particularmente relevante quando se trabalha com amostras criopreservadas, uma vez que são mais propensas a aglomera...

As células T CD8 + compreendem um componente crucial do sistema imune adaptativo que eles participam no tumor vigilância imune e contribuir para a erradicação dos agentes patogénicos intracelulares 1. Em termos simples, as células T CD8 + expressam receptores de células T (TCRs) que reconhecem especificamente o péptido-classe principal de histocompatibilidade complexo I (pMHC-I) moléculas presentes na membrana plasmática das células hospedeiras. Uma vez que estes péptidos são derivados a partir da proteólise de proteínas sintetizadas endogenamente, pMHC-I da superfície da célula complexos de fornecer uma janela para o meio intracelular. Após a infecção de vírus, por exemplo, as células infectadas irão exibir moléculas de CPH-I que contêm péptidos derivados de vírus que podem servir como ligandos para TCR expressas pelo que patrulha células T CD8 +. No caso de uma célula T CD8 + específicos do vírus encontra uma célula infectada que apresenta o seu ligando pMHC-I, o envolvimento do TCR irá resultar na activação de células T CD8 + e ultimadamente levar a célula alvo de lise. Dada a natureza crítica dessas interações TCR / pMHC-I, a determinação da magnitude, especificidade e fenótipo de responder as células T CD8 + podem muitas vezes revelar pistas importantes sobre doenças humanas. Até o início de 1990, a quantificação de células T Ag específicos de CD8 + invocado o ensaio tecnicamente exigente diluição limitante (LDA) 2,3. Não só a LDA requerem vários dias para ser concluído, ele também não conseguiu detectar células que não tinham potencial proliferativo. Como resultado, o LDA vastamente subestimado a frequência real do antigénio (Ag) + células-T CD8 especï¿½icos participantes em uma resposta imune. Embora o desenvolvimento de ELISPOT e ensaios de coloração de citocinas intracelulares melhorou grandemente a capacidade de medir a imunidade celular, estes métodos ainda necessário na estimulação in vitro para quantificar as células T específicas de Ag-4. Não foi até 1996 que Altman, Davis, e colleagues publicaram seu marco artigo relatando o desenvolvimento da tecnologia de tetrâmero pMHC-I 5. Crítica para o sucesso desta técnica foi a multimerização de moléculas pMHC-I, que se estendia a meia-vida de interacções TCR / pMHC-I, reduzindo deste modo a probabilidade de tetrâmeros pMHC-I que caem fora durante os passos de lavagem de ensaios de citometria de fluxo. A principal vantagem de tetrâmeros pMHC-I durante os ensaios acima mencionados é a capacidade de detectar com precisão as células T Ag-CD8 + específica directamente ex vivo, sem a necessidade de in vitro re-estimulação. Além disso, a combinação de pMHC-I tetrâmero coloração com multi-cor citometria de fluxo permitiu uma análise detalhada do andar de diferenciação, fenótipo de memória, e o estado de activação das células T CD8 + específicas de células Ag-2-4. À luz dos recentes avanços técnicos para a caracterização de repertórios de células T CD8 + por pMHC-I multimero coloração 6, a amplitude de aplicações for esta metodologia é provável que continue em expansão. Poucas áreas da pesquisa biomédica beneficiaram mais do pMHC-I tetrâmero coloração do que o campo da imunologia HIV 7. Embora as células T CD8 + foi temporariamente associado com o controle inicial de viremia HIV no momento da publicação por Altman, Davis, e seus colegas 8,9, o uso de tetrâmeros pMHC-I nos anos seguintes expandiu significativamente a nossa compreensão da o HIV-resposta específica das células T CD8 +. Por exemplo, pMHC-I tetrâmero coloração ajudou a confirmar o tamanho robusta de respostas de células T CD8 + específicas do vírus, na maioria dos indivíduos infectados com HIV 10-12. Esta metodologia também facilitou a caracterização de HIV e respostas de células T específicas de SIV CD8 + restringidos por moléculas de MHC-I associados com um controle espontâneo de replicação virai na ausência de terapia anti-retroviral, um fenómeno conhecido como &quot;controlo de elite&quot; <sup&gt; 13-15. Além disso, pMHC-I tetrâmeros foram instrumental no estabelecimento do eixo morte programada 1 (PD-1) / PD ligando 1 (PD-L1) como uma via reversível para o fenótipo disfuncional de HIV-específicas CD8 + células-T na infecção crônica não controlada 16,17. Coletivamente, esses estudos ressaltam a utilidade de tetrâmeros pMHC-I para monitorar as respostas de células T CD8 + contra o vírus da AIDS. Infecção experimental SIV de macacos rhesus (Macaca mulatta) continua a ser o melhor modelo animal para avaliação das intervenções imunes contra o HIV / AIDS 18,19. Nos últimos 25 anos, um progresso substancial tem sido feito na identificação e caracterização de células T CD8 específicas SIV-+ nesta espécies de macacos, incluindo a descoberta de alelos de MHC-I e a definição de ligação ao péptido motivos 13,20-27 . Como resultado, I-pMHC tetrâmeros ter sido desenvolvido para a análise de SIV-específica de células T CD8 +respostas neste modelo animal 28. A maioria destes reagentes são feitas dos produtos de gene de quatro macaco rhesus alelos do MHC-I: Mamu-A1 * 001, Mamu-A1 * 002: 01, Mamu-B * 008: 01, e Mamu-B * 017: 01. De nota, macacos rhesus não expressam um locus MHC-C 29. A grande maioria dos tetrâmeros pMHC-I utilizados nas presentes experiências foram produzidas no Centro de NIH tetrâmero Núcleo da Universidade de Emory. No entanto, alguns destes reagentes, incluindo Mamu-A1 * 001 tetrâmeros ligados ao imunodominante epitopo Gag CM9, só pode ser obtido a partir de fontes comerciais devido a acordos de licenciamento. Usando tetrâmeros pMHC-I dos quatro alelos rhesus listados acima, temos enumerado com êxito as células T CD8 + contra um total de 21 epitopos SIV (Tabela 1), que foram induzidos por vacinação ou infecção pelo SIV primário 30,31 (Martins et al., observações não publicadas). O presente manuscrito fornece umaoptimizado pMHC-I protocolo de coloração do tetrero para a determinação do fenótipo de células T específicas SIV-CD8 + frequência e memória em macacos rhesus. O ensaio começa com um electiva 30 min de incubação com um inibidor de proteína cinase (PKI; aqui, dasatinib é utilizado), a fim de diminuir a internalização de TCR e, assim, melhorar a pMHC-I tetrâmero coloração 32. Como descrito abaixo, o tratamento é especialmente útil quando se utiliza Mamu-B * 017: 01 tetrâmeros. Instruções sobre como rotular as células com tetrâmeros pMHC-I fluorocromo conjugado e anticorpos monoclonais (mAbs) também são fornecidos. Este protocolo inclui também um passo para a permeabilização celular para a detecção intracelular da molécula associada à citólise granzima B (GZM B). O anticorpo monoclonal contra CD3 é adicionado neste passo, assim como para melhorar a detecção desta molécula de sinalização de TCR. Como uma referência, todos os fluorocromos utilizados no presente painel de coloração são listados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1449">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Dasatinib</td>
			<td style="width:236px;">Axon medchem</td>
			<td style="width:127px;">Axon&#160;1392</td>
			<td style="width:757px;">Must be resuspended in DMSO and immediately stored at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI w/ Glutamax</td>
			<td>gibco/ Life Technologies</td>
			<td>61870-036</td>
			<td>Must be stored at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heat Inactivated FBS</td>
			<td>gibco/ Life Technologies</td>
			<td>10082-147</td>
			<td>Must be stored at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycinp-Amphotericin B</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-745E</td>
			<td>Must be stored at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO, Anhydrous</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D12345</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-mL Round-Bottom Polypropylene Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60819-728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorochrome-conjugated pMHC-I tetramers</td>
			<td>NIH Tetramer Core or MBL, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Must be stored and maintained at&#160; 4 &#176;C. Centrifuge at 20,000 x g for 15 min before use. Do not freeze.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorochrome-conjugated mAbs</td>
			<td>Various companies</td>
			<td></td>
			<td>Must be stored and maintained at&#160; 4 &#176;C. Do not freeze.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIVE/DEAD&#160;Fixable Aqua&#160;Dead&#160;Cell Stain Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>l34957</td>
			<td>Must be stored at -20 &#176;C. Resuspend each aliquot in 50 &#956;L of DMSO prior to use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Brilliant Stain Buffer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563794</td>
			<td>Must be stored at&#160; 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-158</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Albumine Bovine</td>
			<td>VWR</td>
			<td>700011-230</td>
			<td>Must be stored at&#160; 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Azide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-646</td>
			<td>Store at room temperature. Toxic substance. Do not mix with bleach.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bleach</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89501-620</td>
			<td>Corrosive chemical, cannot be mixed with sodium azide. Handle with care</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714-S</td>
			<td>Flammable, corrosive, and toxic reagent. Handle with care</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polysorbate 20 (Tween-20)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L15029</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Permeabilization Solution 2&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340973</td>
			<td>Toxic and corrosive reagent. Handle with care</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sarsdet Tubes 1.5mL screw top</td>
			<td>VWR</td>
			<td>72.692.005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2.0ml DNA/RNA Low bind Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431048</td>
			<td>The use of Sterile microtubes is preffered&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vortex mixer</td>
			<td>To discretion of scientist</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biosafety Cabinet&#160;</td>
			<td>To discretion of scientist</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Milli Q Intergral Water Purification system</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ZRXQ010WW</td>
			<td>Molecular Biology grade water from any provider may be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge</td>
			<td>To discretion of scientist</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>To discretion of scientist</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4 &#176;C&#160; refrigerator</td>
			<td>To discretion of scientist</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD LSR II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deionized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluminum Foil</td>
			<td>VWR SCIENTIFIC INC.</td>
			<td>89068-738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Must be able to maintain 37 &#176;C&#160; internal temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS Diva software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flowjo software version 9.6</td>
			<td>Flowjo</td>
			<td></td>
			<td>Used to analyze FCS files generated by FACS Diva software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropippette tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of simian immunodeficiency virus-specific cd8+ t-cells in rhesus macaques by peptide-mhc-i tetramer staining

Péptido-histocompatibilidade principal de classe complexo I (pMHC-I) tetrâmeros têm sido uma ferramenta de valor inestimável para estudar as respostas de células T CD8 +. Porque estes reagentes se ligam directamente aos receptores de células T na superfície das células CD8 + T-linfócitos, tetrâmeros marcado com fluorocromo pMHC-I permitir a detecção exacta do antigénio (Ag) especï¿½ico CD8 + células-T, sem a necessidade de re in vitro -estimulação. Além disso, quando combinado com multi-color citometria de fluxo, pMHC-I tetrâmero coloração pode revelar aspectos-chave de células T CD8 + Ag específicas, incluindo-estágio de diferenciação, fenótipo de memória e estado de activação. Estes tipos de análises têm sido especialmente úteis no campo da imunologia do HIV, onde células T CD8 + podem afectar a progressão para SIDA. infecção experimental de macacos rhesus com vírus da imunodeficiência símia (SIV) fornece uma ferramenta valiosa para estudar a imunidade celular contra o vírus da AIDS. Como resultado, progre considerávelSS foi feita para definir e caracterizar as respostas de células T neste modelo animal. Aqui apresentamos um protocolo otimizado para enumerar as células T SIV específicas de CD8 + em macacos rhesus por pMHC-I tetrâmero coloração. Nosso ensaio permite a quantificação e memória fenotipagem simultânea de duas populações de células T pMHC-I tetrâmero + CD8 + por teste, que pode ser útil para rastrear respostas específicas-SIV de células T CD8 + geradas pela vacinação ou infecção pelo SIV. Considerando a relevância dos primatas não humanos na investigação biomédica, esta metodologia é aplicável para estudar as respostas das células T CD8 + em múltiplas configurações de doença.

O protocolo aqui descrito foi usado para determinar a magnitude e a memória de fenótipo, as respostas de células T induzidas por vacina Gag CM9-específicas de CD8 + em uma Mamu-A1 * 001 + macaco rhesus. Para esta análise, um tetrâmero Mamu-A1 * 001 / Gag CM9 APC-conjugado foi usado em um painel de coloração de citometria de fluxo de 8 cores. Figura 1A - F mostra a estratégia gating usado para analisar os dados, que devem ser ...

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Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para enumerar e caracterizar macaco rhesus células T CD8 + contra o vírus da AIDS. Este artigo é útil não só para o campo da imunologia do HIV, mas também a outras áreas de investigação biomédica, onde são conhecidas respostas de células T CD8 + de afectar a evolução da doença.

Análise de células T CD8 específicas do vírus da imunodeficiência símia<sup&gt; +</sup&gt; Células-T em Rhesus Macaques por Peptide-MHC-I tetrâmero coloração

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

Fluxo multicolor de Citometria de Análises de resposta imune celular em macacos rhesus

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Imunologia e Infecção

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Transdução retroviral de receptor de células T no rato células T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

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Indução de Murino inflamação intestinal por transferência adotiva de Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alta</sup&gt; Células T em imunodeficientes Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

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Preparação de CD4<sup&gt; +</sup&gt; As células T para Análise de GD3 e GD2 gangliï¿½idos Membrane Expressão por microscopia

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

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In Situ MHC-tetrâmero manchando e análise quantitativa para determinar a localização, abundância e fenótipo de células T de CD8 antígeno-específicas em tecidos

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Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Célula única quantificação de mRNA e expressão de proteínas de superfície em CD4 infectados por vírus de imunodeficiência simiana+ T células isoladas de macacos Rhesus

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be ...