Name: increased recovery time and decreased lps administration to study the vagus nerve stimulation mechanisms in limited inflammatory responses
Uploaded: 2017-03-29T14:00:00
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The study was supported by the Swedish Research Council, the Swedish Rheumatism Asociation, Karolinska Institute Foundations, Stockholm County Council, The Wallenberg Foundation, and the GV 80 Years' Foundation for research. The authors would also like to thank Hannah Aucott for proofreading the manuscript.

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices para el cuidado y uso de animales aprobados por el Comité de Ética local en el Instituto Karolinska, Estocolmo. El Comité de Ética local sigue las directrices de la Unión Europea sobre el cuidado de los animales. NOTA: Los principales cambios desde el protocolo original son el tiempo de recuperación después de la cirugía (6 hr frente a 1 hr) y el nivel de LPS inyectados (2 mg / kg frente a</...

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	<li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Points+of+control+in+inflammation.">Points of control in inflammation.</a> Nature. 420 (6917), 846-852 (2002).</li><li>Rosas Ballina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylcholine-synthesizing+T+cells+relay+neural+signals+in+a+vagus+nerve+circuit.">Acetylcholine-synthesizing T cells relay neural signals in a vagus nerve circuit.</a> Science. 334 (6052), 98-101 (2011).</li><li>Le Ma&#238;tre, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+vagus-mediated+immunosuppression+in+microsomal+prostaglandin+E+synthase-1+deficient+mice.">Impaired vagus-mediated immunosuppression in microsomal prostaglandin E synthase-1 deficient mice.</a> Prostaglandins Other Lipid Mediat. 121 (Part B), 155-162 (2015).</li><li>Borovikova, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vagus+nerve+stimulation+attenuates+the+systemic+inflammatory+response+to+endotoxin.">Vagus nerve stimulation attenuates the systemic inflammatory response to endotoxin.</a> Nature. 405 (6785), 458-462 (2000).</li><li>Olofsson, P. S., Rosas-Ballina, M., Levine, Y. A., Tracey, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rethinking+inflammation:+neural+circuits+in+the+regulation+of+immunity.">Rethinking inflammation: neural circuits in the regulation of immunity.</a> Immunol. Rev. 248 (1), 188-204 (2012).</li><li>Pavlov, V. A., Tracey, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+circuitry+and+immunity.">Neural circuitry and immunity.</a> Immunol Res. 63 (1-3), 38-57 (2015).</li><li>Huston, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splenectomy+inactivates+the+cholinergic+antiinflammatory+pathway+during+lethal+endotoxemia+and+polymicrobial+sepsis.">Splenectomy inactivates the cholinergic antiinflammatory pathway during lethal endotoxemia and polymicrobial sepsis.</a> J. Exp. Med. 203 (7), 1623-1628 (2006).</li><li>Rosas-Ballina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splenic+nerve+is+required+for+cholinergic+anti-inflammatory+pathway+control+of+TNF+in+endotoxemia.">Splenic nerve is required for cholinergic anti-inflammatory pathway control of TNF in endotoxemia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (31), 11008-11013 (2008).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+acetylcholine+receptor+alpha7+subunit+is+an+essential+regulator+of+inflammation.">Nicotinic acetylcholine receptor alpha7 subunit is an essential regulator of inflammation.</a> Nature. 421 (6921), 384-388 (2003).</li><li>Pavlov, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+muscarinic+cholinergic+regulation+of+the+systemic+inflammatory+response+during+endotoxemia.">Central muscarinic cholinergic regulation of the systemic inflammatory response during endotoxemia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (13), 5219-5223 (2006).</li><li>Pavlov, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+acetylcholinesterase+activity+controls+systemic+cytokine+levels+through+the+cholinergic+anti-inflammatory+pathway.">Brain acetylcholinesterase activity controls systemic cytokine levels through the cholinergic anti-inflammatory pathway.</a> Brain Behav. Immun. 23 (1), 41-45 (2009).</li><li>Rosas-Ballina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xanomeline+suppresses+excessive+pro-inflammatory+cytokine+responses+through+neural+signal-mediated+pathways+and+improves+survival+in+lethal+inflammation.">Xanomeline suppresses excessive pro-inflammatory cytokine responses through neural signal-mediated pathways and improves survival in lethal inflammation.</a> Brain Behav. Immun. 44, 19-27 (2014).</li><li>Bellinger, D. L., Lorton, D., Lubahn, D., Felten, D. L., Ader, R., Felten, D. L., Cohen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Psychoneuroimmunology. 55, 55-112 (2001).</li><li>Andersson, U., Tracey, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+rheumatoid+arthritis:+treating+inflammation+with+computerized+nerve+stimulation.">A new approach to rheumatoid arthritis: treating inflammation with computerized nerve stimulation.</a> Cerebrum. 2012, 3 (2012).</li><li>Ono, S. J., Nakamura, T., Miyazaki, D., Ohbayashi, M., Dawson, M., Toda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines:+Roles+in+leucocyte+development,+trafficking,+and+effector+function.">Chemokines: Roles in leucocyte development, trafficking, and effector function.</a> J. Allergy Clin. Immunol. 111 (6), 1185-1199 (2003).</li><li>Silvestre-Roig, C., Hidalgo, A., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+heterogeneity:+implications+for+homeostasis+and+pathogenesis.">Neutrophil heterogeneity: implications for homeostasis and pathogenesis.</a> Blood. , (2016).</li><li>Matteoli, G., Boeckxstaens, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vagal+innervation+of+the+gut+and+immune+homeostasis.">The vagal innervation of the gut and immune homeostasis.</a> Gut. 62, 1214-1222 (2013).</li><li>Pereira, M. R., Leite, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+involvement+of+parasympathetic+and+sympathetic+nerve+in+the+inflammatory+reflex.">The involvement of parasympathetic and sympathetic nerve in the inflammatory reflex.</a> J. Cell. Physiol. 231, 1862-1869 (2016).</li><li>Levine, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurostimulation+of+the+cholinergic+anti-inflammatory+pathway+ameliorates+disease+in+rat+collagen-induced+arthritis.">Neurostimulation of the cholinergic anti-inflammatory pathway ameliorates disease in rat collagen-induced arthritis.</a> PLoS One. 9 (8), e104530 (2014).</li><li>Huston, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+vagus+nerve+stimulation+reduces+serum+high+mobility+group+box+1+levels+and+improves+survival+in+murine+sepsis.">Transcutaneous vagus nerve stimulation reduces serum high mobility group box 1 levels and improves survival in murine sepsis.</a> Crit. Care Med. 35 (12), 2762-2768 (2007).</li><li>Yuan, H., Silberstein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vagus+nerve+and+vagus+nerve+stimulation,+a+comprehensive+review:+Part+II.">Vagus nerve and vagus nerve stimulation, a comprehensive review: Part II.</a> Headache. 56 (2), 259-266 (2016).</li></ol>

Desde su descubrimiento en la década de 2000, los mecanismos de la PAC han sido estudiados a fondo. Ahora tenemos una buena imagen de la vía y, en particular, el órgano diana, el bazo, donde NE, las células T de memoria, Ach, y macrófagos trabajo como un equipo muy eficiente para regular a la baja mediadores inflamatorios 2. También hemos publicado recientemente datos sobre la importancia de un sistema de prostaglandina funcional en ratones, en particular, PGE 2, que es obviament...

La inmunidad innata proporciona una primera línea inmediata de defensa contra las infecciones y enfermedades en una amplia gama de organismos. No sólo se inicia la respuesta inmune primaria para eliminar la amenaza, sino que también desempeña un papel fundamental en la activación y educar a la inmunidad adaptativa que lleva a cabo respuestas inmunes secundarias de una manera específica del patógeno. La inflamación está orquestada por una gran cantidad de citocinas y quimiocinas, que a su vez tienen la capacidad de atraer otras células inmunitarias al sitio de la infección y para inducir los signos cardinales de la inflamación, tales como enrojecimiento, hinchazón, dolor, pérdida de función, y la fiebre . La duración y la intensidad de la inflamación dependen de varios factores, pero la resolución de la inflamación y la restauración de la homeostasis es un paso crítico para evitar la aparición de enfermedades inflamatorias crónicas. Los recientes avances en el campo de la neurología y la inmunología han desentrañado los mecanismos neuronales específicos con un inmenso potencial terapéutico para controlar la inflinflamación tanto en el sistema nervioso central y en la periferia. Uno de estos mecanismos es la vía anti-inflamatorio colinérgico (CAP), también conocido como el reflejo inflamatorio, que es accionado por el sistema nervioso autónomo 4, 5. Actualmente se cree que los mediadores inflamatorios activan los nervios sensoriales y envían señales sobre el estado de la inflamación en el sistema nervioso central. Una respuesta refleja se activa a continuación, a través del nervio vago eferente. Un extenso estudio sobre los detalles anatómicos de la PAC ha revelado un modelo parasimpático-simpático compuesto de dos nervios, el nervio vago y el nervio esplénico, respectivamente 6. En el PAC, el colinérgico nervio vago eferente activado termina en el ganglio celíaco-mesentérica, lo que resulta en la activación del nervio esplénico adrenérgico por un mecanismo aún no se ha explorado. El nervio esplénico, activado de este modo, se sabe que internaVate en estrecha proximidad a las células inmunes en la pulpa blanca, de la zona marginal, y la pulpa roja del bazo, el órgano principal y obligatoria de la PAC 7, 8. La norepinefrina (NE) a partir de las terminaciones nerviosas esplénicas se une a los correspondientes receptores adrenérgicos β 2 expresados en los linfocitos T esplénicas. Esto induce la liberación de colina acetil transferasa (ChAT) acetilcolina mediada (ACh), que a su vez activa los receptores nicotínicos de acetilcolina a7 (α7nACh) sobre los macrófagos, lo que limita la producción de citoquinas y la inflamación 2. En consecuencia, ahora está claro que el sistema nervioso es capaz de regular la inflamación en los tejidos periféricos y restaurar la homeostasis inmune local. Como el nombre de la vía sugiere, el sistema de ACh es de importancia fundamental para el funcionamiento de esta vía de regulación neuro-inmune. Curiosamente, los mecanismos implicados en la activación dela PAC parece ser diferente en la periferia y en el sistema nervioso central. Si bien la importancia de los receptores nicotínicos (α7nAChR) en el bazo se ha demostrado anteriormente 9, los receptores muscarínicos (mAChR) son obligatorios para la activación central de la vía 10, 11. Más recientemente, la administración periférica de un agonista muscarínico M1 de acción central suprimió significativamente suero y tumorales bazo factor de necrosis α (TNF) durante la endotoxemia letal murino, una acción que requiere nervio vago intacto y el nervio esplénico de señalización 12. También hemos demostrado recientemente que los ratones que carecen de la prostaglandina E 2 (PGE 2) no fueron capaces de responder a la estimulación del nervio vago y no disminuye la liberación inducida por LPS de citoquinas en el suero y el bazo 3. Por lo tanto, la PAC también puede ser regulada por sistemas distintos de la principal pathw AChsí. El nervio vago ha sido nombrado como tales debido a su curso errante en el cuerpo, que inervan los órganos principales incluyendo el hígado, pulmón, bazo, riñones, y el intestino 13. Teniendo en cuenta este gran inervación y el efecto inmunosupresor muy potente del nervio vago, el potencial terapéutico de la PAC podría cubrir un amplio rango de condiciones inflamatorias. El nervio vago puede ser eléctricamente (o mecánicamente) activado, con el control de la tensión y la frecuencia, y contrariamente al tratamiento convencional, sin fármacos añadidos al cuerpo. Actualmente se están realizando ensayos en pacientes reumáticos, por ejemplo, para probar la significación clínica de la estimulación del nervio vago en el tratamiento de la inflamación crónica 14. En total, la comunicación y la regulación de la inflamación neuro-inmune están actualmente bajo investigación, que proporcionará un tratamiento posible alternativa a la terapia convencional. Por lo tanto, el análisis de la estimulación del nervio vagon efecto en los diferentes órganos inervados, sino también la caracterización del potencial de acción terapéutica en modelos animales de inflamación crónica, sin duda dar ideas y la esperanza de nuevas dianas terapéuticas potenciales. La metodología original desarrollado por Tracey y sus colegas 4 no podía aplicarse a nuestro campo de la investigación debido a la sobre-estimulación de la respuesta inflamatoria (por una dosis letal de LPS) y un intervalo de tiempo demasiado corto entre la activación de la PAC y de la lectura de salida. En el presente trabajo, presentaremos los cambios realizados en el protocolo original, comparar las dos metodologías diferentes en los niveles de citoquinas, y poner de relieve una nueva y opuesta de observación en el órgano diana (bazo).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="665">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Computer</td>
			<td style="width:91px;">Toshiba</td>
			<td style="width:136px;">-</td>
			<td style="width:191px;">Any computer is actually compatible</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">MP-150 data acquisition system</td>
			<td style="width:91px;">Biopac Systems</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;">MP150WSW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Acknowledge software</td>
			<td style="width:91px;">Biopac Systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Mice C57Bl/6</td>
			<td style="width:91px;">Charles River</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Anesthetic machine</td>
			<td style="width:91px;">Simtec Engineering</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Medical oxygen bottle</td>
			<td style="width:91px;">AGA</td>
			<td style="width:136px;">107563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Medical air bottle&#160;</td>
			<td style="width:91px;">AGA</td>
			<td style="width:136px;">108639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Vetflurane (1000mg/g)</td>
			<td style="width:91px;">Virbac</td>
			<td style="width:136px;">137317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">LPS</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">L2630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Saline</td>
			<td style="width:91px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:136px;">1024060080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">PBS 10X</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">P5493</td>
			<td>Diluted 10 times for used concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Syringe (1 ml)</td>
			<td style="width:91px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:136px;">303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Needles 23G</td>
			<td style="width:91px;">KD-FINE</td>
			<td style="width:136px;">900284</td>
			<td>0.6 x 30 mm (blue)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Microdissecting forceps (curved)</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">F4142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Dissecting scissors</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">Z265969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Surgical suture 4-0</td>
			<td style="width:91px;">Ethicon</td>
			<td style="width:136px;">G667G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Euthanasia unit</td>
			<td style="width:91px;">Euthanex Smartbox</td>
			<td style="width:136px;">EA-32000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Cavilon No Sting Barrier Film</td>
			<td style="width:91px;">3M Health Care</td>
			<td style="width:136px;">3346N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">TH1/TH2 9-Plex assay, ultrasensitive kit</td>
			<td style="width:91px;">MesoScale Discovery</td>
			<td style="width:136px;">K15013C-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

increased recovery time and decreased lps administration to study the vagus nerve stimulation mechanisms in limited inflammatory responses

Inflammation is a local response to infection and tissue damage mediated by activated macrophages, monocytes, and other immune cells that release cytokines and other mediators of inflammation. For a long time, humoral and cellular mechanisms have been studied for their role in regulating the immune response, but recent advances in the field of immunology and neuroscience have also unraveled specific neural mechanisms with interesting therapeutic potential. The so-called cholinergic anti-inflammatory pathway (CAP) has been described to control innate immune responses and inflammation in a very potent manner. In the early 2000s, Tracey and collaborators developed a technique that stimulates the vagus nerve and mimics the effect of the pathway. The methodology is based on the electrical stimulation of the vagus nerve at low voltage and frequency, in order to avoid any side effects of overstimulation, such as deregulation of heart rate variability. Electrical devices for stimulation are now available, making it easy to set up the methodology in the laboratory. The goal of this research was to investigate the potential involvement of prostaglandins in the CAP. Unfortunately, based on earlier attempts, we failed to use the original protocol, as the induced inflammatory response either was too high or was not suitable for enzymatic metabolism properties. The different settings of the original surgery protocol remained mostly unchanged, but the conditions regarding inflammatory induction and the time point before sacrifice were improved to fit our purposes (i.e., to investigate the involvement of the CAP in more limited inflammatory responses). 
The modified version of the original protocol, presented here, includes a longer time range between vagus nerve stimulation and analysis, which is associated with a lower induction of inflammatory responses. Additionally, while decreasing the level of lipopolysaccharides (LPS) to inject, we also came across new observations regarding mechanistic properties in the spleen.

Nivel de TNF y la interleucina-1β (IL-1β) después de aumentar la Lapso de tiempo después de la cirugía y la disminución de la dosis de LPS Como se indica anteriormente, utilizando el protocolo original, VNS disminuyó los niveles de TNFa (169,3 ± 24,9 pg / mg en SHAM frente a 39,7 ± 10,8 pg / mg en VNS, p &lt;0,001) y la IL-1β (360,0 ± 40,21 pg / mg en SHAM frente a 191,7 ± 27,2 pg / mg en VNS, p &lt;0,01) en el bazo d...

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Increased Recovery Time and Decreased LPS Administration to Study the Vagus Nerve Stimulation Mechanisms in Limited Inflammatory Responses

Vagus nerve stimulation has proven to have a strong efficacy for decreasing peripheral inflammation. Here, we present a modified vagus nerve stimulation protocol that allows for further examinations of the cholinergic anti-inflammatory mechanisms in limited inflammatory responses.

El aumento del tiempo de recuperación y la disminución de la administración de LPS para estudiar la estimulación del nervio vago mecanismos en las respuestas inflamatorias Limited

Inflammation is a local response to infection and tissue damage mediated by activated macrophages, monocytes, and other immune cells that release ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

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Investigación

Inmunología e Infección

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The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

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Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

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