Name: using linear agarose channels to study drosophila larval crawling behavior
Uploaded: 2016-11-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior at JoVE.com

We would like to thank Chris Wreden and Michelle Bland for comments on the manuscript and for technical help.

1. Fremstilling af larver <ol><li> En uge før optagelse adfærd, nedsat en cross (minimum 25 jomfruer og 5 hanner). Bevar alle kors og afkom ved 25 ° C. BEMÆRK: Temperaturen af ​​dyrkningsbetingelser kan ændres, men den nedenfor beskrevne tid linje ville skulle justeres for at tage højde for ændringer i udviklingsmæssig hastighed. </li><li> 5 dage før optagelse, første ting om morgenen, skal du placere indlæg ind en samling bur med en agar / saft hætte og en DAB (0,5-1 ml) af gær pasta i midten ...

<ol>
	<li>Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Drosophila+larval+crawling+at+the+level+of+organism,+segment,+and+somatic+body+wall+musculature.">Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature.</a> J Neurosci. 32 (36), 12460-12471 (2012).</li><li>Marder, E., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+rhythmic+motor+pattern+generation.">Principles of rhythmic motor pattern generation.</a> Physiol rev. 76 (3), 687 (1996).</li><li>Mullins, O. J., Hackett, J. T., Buchanan, J. T., Friesen, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+control+of+swimming+behavior:+Comparison+of+vertebrate+and+invertebrate+model+systems.">Neuronal control of swimming behavior: Comparison of vertebrate and invertebrate model systems.</a> Prog Neurobiol. 93 (2), 244-269 (2011).</li><li>Ohyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multilevel+multimodal+circuit+enhances+action+selection+in+Drosophila.">A multilevel multimodal circuit enhances action selection in Drosophila.</a> Nature. 520 (7549), 633-639 (2015).</li><li>Landgraf, M., Thor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Drosophila+motoneurons:+specification+and+morphology.">Development of Drosophila motoneurons: specification and morphology.</a> Semin cell devl bio. 17 (1), 3-11 (2006).</li><li>Heckscher, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even-Skipped(+)+Interneurons+Are+Core+Components+of+a+Sensorimotor+Circuit+that+Maintains+Left-Right+Symmetric+Muscle+Contraction+Amplitude.">Even-Skipped(+) Interneurons Are Core Components of a Sensorimotor Circuit that Maintains Left-Right Symmetric Muscle Contraction Amplitude.</a> Neuron. 88 (2), 1-16 (2015).</li><li>Green, C. H., Burnet, B., Connolly, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+patterns+of+inter-and+intraspecific+variation+in+the+behaviour+of+Drosophila+larvae.">Organization and patterns of inter-and intraspecific variation in the behaviour of Drosophila larvae.</a> Anim Behav. 31 (1), 282-291 (1983).</li><li>Graf, S. A., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rover/Sitter+Drosophila+melanogaster+Larval+Foraging+Polymorphism+as+a+Function+of+Larval+Development,+Food-Patch+Quality,+and+Starvation.">Rover/Sitter Drosophila melanogaster Larval Foraging Polymorphism as a Function of Larval Development, Food-Patch Quality, and Starvation.</a> J Insect Behav. 2 (3), 301-313 (1989).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li><li>Rebay, I., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yan+Functions+as+a+General+Inhibitor+of+Differentiation+and+Is+Negatively+Regulated+by+Activation+of+the+Rasl+/+MAPK+Pathway.">Yan Functions as a General Inhibitor of Differentiation and Is Negatively Regulated by Activation of the Rasl / MAPK Pathway.</a> Cell. 81 (6), 857-866 (1995).</li><li>Chen, T. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Tufte, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The visual display of quantitative information. , (2004).</li></ol>

En mikrofluidapparat blev bygget til at gøre lineære agarose kanaler, der kan rumme Drosophila larver (figur 1). Når Drosophila larver er placeret i disse lineære agarose kanaler deres adfærdsmæssige repertoire er begrænset til at kravle, som giver mulighed for detaljeret observation af dynamikken i larver strukturer over kravle cyklus. En vellykket optagelse forekommer, når en larve udføre en række rytmiske skridt (figur 3). Hvis...

Det overordnede mål med denne metode er at studere Drosophila larvestadiet gennemgang i detaljer. Forsøg med bevægelse har spillet en vigtig rolle i at udvikle og afprøve teorier om motorisk kontrol 2. Traditionelt bevægelse er blevet undersøgt i vanddyr (f.eks igle, lampret, Tadpole) 3. Den repetitive karakter af bevægelse i disse dyr har tilladt for studiet af rhythmogenesis, til analyse af de biofysiske begivenheder drivende bevægelse, og til at overvåge de neurale fyring mønstre, der ledsager bevægelse. Anvendelsen af Drosophila larver til studier af bevægelse er en enestående kombination af fordele i forhold til andre modelsystemer: overfladiske genetik, velkarakteriseret udvikling, et organ, der er optisk klar ved første og anden instars, og en igangværende transmission elektronmikroskopisk rekonstruktion af hele nervesystem 4-6. Imidlertid Drosophila larvestadiet locobevægelse på flade åbne flader er noget kompleks, herunder pauser, vender, og bugtende kravler 7. I denne publikation præsenteres en metode til at bruge lineære agarose-kanaler til at guide Drosophila larve bevægeapparatet adfærd således at larver udføre vedvarende, lige, rytmisk gennemgang adfærd. Studere Drosophila larvestadiet adfærd i agarose-kanaler, i stedet for adfærd på flade åbne overflader, har flere fordele. For det første giver forskerne specifikt vælge kravle adfærd fra de mange bevægelser, der er en del af den larver adfærdsmæssige repertoire. For det andet, ved at justere bredden af ​​kanalen versus larvernes kropsstørrelse, kravlende hastighed kan justeres. Tredje, kanaler tillader larven kan ses fra dorsal, ventrale eller laterale side, afhængigt af hvordan larven er indlæst og orienteret i kanalen. Denne alsidighed i larvernes orientering muliggør en struktur af interesse at være konstant synlige under kravle. Fjerde,kanaler er medgørlige til anvendelse med en lang række forskellige mikroskoper og mål. For eksempel kan lineære kanaler bruges til lav-opløsning billeddannelse på lyse-field stereoscopes og / eller for høj opløsning billeddannelse på spinning-disk konfokale mikroskoper 1. For det femte kan denne metode anvendes i kombination med optogenetic / thermogenetic neuronale manipulationer i enhver genetisk baggrund. Endelig fordi både larvestadiet legeme (ved første og anden instars) og agarose kanaler er optisk klare, kanaler kan bruges, når man studerer de dynamiske bevægelser eller ændringer i fluorescerende intensitet larval strukturer mærket med genetisk kodede fluorescerende prober. Den beskrevne fremgangsmåde er egnet til detaljerede kinematiske studier af første og andet stadium Drosophila larvestadiet adfærd. Denne publikation analyserer de dynamiske ændringer i fluorescerende intensitet i CNS under frem larve gennemgang at demonstrere brugen af ​​kanaler og som en forløber for Neuronal calcium imaging.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="643">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">6 oz square Drosophila bottle</td>
			<td style="width:101px;">Scimart</td>
			<td style="width:119px;">DR-103</td>
			<td style="width:212px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">agar</td>
			<td style="width:101px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">A1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">sucrose</td>
			<td style="width:101px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">apple juice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>not from concentrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Tegosept</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>T2300</td>
			<td>methyl-p-hydroxybenzoate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">35 x 10 mm round petri dish</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td align="right">351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">baker&#39;s yeast</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">PDMS casting mold</td>
			<td style="width:101px;">FlowJem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>can be requested from authors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">isopropyl alcohol</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A417-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">laboratory wipes</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">06-666-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">canned air</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">18-431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">10 cm petri dish</td>
			<td style="width:101px;">BioPioneer</td>
			<td style="width:119px;">GS82-1473-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">agarose</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">50-444-176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">razor blade</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">forceps</td>
			<td style="width:101px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">11241-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">22 x 40 cover glass, #1.5</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">50-365-605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Fiji (version 1.51d)</td>
			<td style="width:101px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>fiji.sc</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Excel 2016</td>
			<td style="width:101px;">Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>www.microsoftstore.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">MATLAB R2016</td>
			<td style="width:101px;">Mathworks</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>www.mathworks.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using linear agarose channels to study drosophila larval crawling behavior

Drosophila larvestadiet gennemgang fremstår som en kraftfuld model til at studere neurale styring af sensomotoriske adfærd. Men larver crawling adfærd på flade åbne flader er komplekst, herunder: pause, drejning, og bugtende. Denne kompleksitet i repertoire af bevægelsen hindrer detaljeret analyse af de begivenheder, der opstår under en enkelt crawl skridtlængde cyklus. For at overvinde denne hindring, blev lineære agarose kanaler gjort at begrænse larve adfærd til lige, vedvarende, rytmisk gennemgang. I princippet fordi agarose kanaler og Drosophila larvestadiet kroppen er begge optisk klare, kan overvåges bevægelsen af larvestadium strukturer mærket med genetisk indkodede fluorescerende prober i intakt, frit bevægelige larver. I fortiden, blev larverne placeret i lineære kanaler og kravle på niveau med hele organismen, segment, og muskel blev analyseret 1. I fremtiden kan larver gennemsøgning i kanaler bruges til calcium imaging at overvåge neuronal aktivitet. Desuden kan disse metoder anvendes med larver af enhver genotype og med enhver forsker-designet kanal. Således protokollen nedenfor er bredt anvendelig til undersøgelser under anvendelse af Drosophila larve som model for at forstå motorstyring.

Denne artikel beskriver en metode til at styre Drosophila larvestadiet adfærd ved hjælp af agarose kanaler og til måling af dynamikken i larver strukturer over en kravle cyklus. Larver i lineære kanaler udføre vedvarende anfald af rytmisk gennemgang (figur 3). Fordi både larver og kanaler er optisk klar, kan kanaler bruges med larver udtrykker fluorescerende prober udtrykt i en struktur af interesse. Vi indspillede larver udtrykker GFP i alle neuroner ...

Watch this Scientific Journal Video about Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior at JoVE.com

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Drosophila larve er en kraftfuld modelsystem til at studere neurale styring af adfærd. Denne publikation beskriver brugen af ​​lineære agarose kanaler til at fremkalde vedvarende anfald af lineær gennemgang og metoder til at kvantificere dynamikken i larver strukturer under gentagne kravle adfærd.

Brug Linear Agarose Kanaler til at studere<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve Crawling Behavior

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Morfologiske Analyse af Drosophila Larver Perifer sensorisk Neuron dendritter og axoner anvende genetiske Mosaikker

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

Methods to Assay Drosophila Behavior

Methods to Assay Drosophila Behavior

Fremgangsmåder til assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Live-Imaging af<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvetilstand neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

En simpel måde at måle Ændringer i Reward-søger Behavior Brug<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

Quantification of Drosophila Grooming Behavior

Kvantificering af Drosophila Grooming Adfærd

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a ...

Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels

Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels

Undersøge Monosynaptic forbindelser i Drosophila ved hjælp af Tetrodotoxin resistente natrium kanaler

Here, a new technique termed Tetrotoxin (TTX) Engineered Resistance for Probing Synapses (TERPS) is applied to test for monosynaptic connections between ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

Sporing Drosophila larve adfærd som svar på Optogenetic Stimulation af olfaktoriske neuroner

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...