Name: using linear agarose channels to study drosophila larval crawling behavior
Uploaded: 2016-11-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior at JoVE.com

We would like to thank Chris Wreden and Michelle Bland for comments on the manuscript and for technical help.

1. Bereiding van Larven <ol><li> Een week voor het opnemen van het gedrag, het opzetten van een kruis (minimaal 25 maagden en 5 mannen). Onderhouden van alle kruisen en nageslacht bij 25 ° C. LET OP: De temperatuur van kweekomstandigheden kan worden gewijzigd, maar de tijdslijn hieronder beschreven nodig zou hebben voor veranderingen in de ontwikkelingspsychologie snelheid aan te passen om rekening te houden. </li><li> 5 dagen voor de opname, het eerste wat in de ochtend, zet het kruis in een verzameling kooi ...

<ol>
	<li>Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Drosophila+larval+crawling+at+the+level+of+organism,+segment,+and+somatic+body+wall+musculature.">Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature.</a> J Neurosci. 32 (36), 12460-12471 (2012).</li><li>Marder, E., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+rhythmic+motor+pattern+generation.">Principles of rhythmic motor pattern generation.</a> Physiol rev. 76 (3), 687 (1996).</li><li>Mullins, O. J., Hackett, J. T., Buchanan, J. T., Friesen, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+control+of+swimming+behavior:+Comparison+of+vertebrate+and+invertebrate+model+systems.">Neuronal control of swimming behavior: Comparison of vertebrate and invertebrate model systems.</a> Prog Neurobiol. 93 (2), 244-269 (2011).</li><li>Ohyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multilevel+multimodal+circuit+enhances+action+selection+in+Drosophila.">A multilevel multimodal circuit enhances action selection in Drosophila.</a> Nature. 520 (7549), 633-639 (2015).</li><li>Landgraf, M., Thor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Drosophila+motoneurons:+specification+and+morphology.">Development of Drosophila motoneurons: specification and morphology.</a> Semin cell devl bio. 17 (1), 3-11 (2006).</li><li>Heckscher, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even-Skipped(+)+Interneurons+Are+Core+Components+of+a+Sensorimotor+Circuit+that+Maintains+Left-Right+Symmetric+Muscle+Contraction+Amplitude.">Even-Skipped(+) Interneurons Are Core Components of a Sensorimotor Circuit that Maintains Left-Right Symmetric Muscle Contraction Amplitude.</a> Neuron. 88 (2), 1-16 (2015).</li><li>Green, C. H., Burnet, B., Connolly, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+patterns+of+inter-and+intraspecific+variation+in+the+behaviour+of+Drosophila+larvae.">Organization and patterns of inter-and intraspecific variation in the behaviour of Drosophila larvae.</a> Anim Behav. 31 (1), 282-291 (1983).</li><li>Graf, S. A., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rover/Sitter+Drosophila+melanogaster+Larval+Foraging+Polymorphism+as+a+Function+of+Larval+Development,+Food-Patch+Quality,+and+Starvation.">Rover/Sitter Drosophila melanogaster Larval Foraging Polymorphism as a Function of Larval Development, Food-Patch Quality, and Starvation.</a> J Insect Behav. 2 (3), 301-313 (1989).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li><li>Rebay, I., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yan+Functions+as+a+General+Inhibitor+of+Differentiation+and+Is+Negatively+Regulated+by+Activation+of+the+Rasl+/+MAPK+Pathway.">Yan Functions as a General Inhibitor of Differentiation and Is Negatively Regulated by Activation of the Rasl / MAPK Pathway.</a> Cell. 81 (6), 857-866 (1995).</li><li>Chen, T. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Tufte, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The visual display of quantitative information. , (2004).</li></ol>

Een microfluïdische apparaat werd gebouwd om lineaire agarose kanalen die geschikt zijn Drosophila larven (figuur 1) te maken. Bij Drosophila larven in deze lineaire agarose kanalen geplaatst zijn gedragsrepertoire beperkt tot kruipen, waardoor gedetailleerde observatie van de dynamiek van larvale structuren via kruipen cyclus. Een opname op wanneer een larve voeren een reeks ritmische stappen (Figuur 3). Als dit niet gebeurt, controleer h...

Het algemene doel van deze methode is om Drosophila larven kruipen in detail te bestuderen. Experimenten op motoriek hebben een belangrijke rol in het ontwikkelen en testen van theorieën over motorische controle 2 gespeeld. Traditioneel motoriek is onderzocht bij waterdieren (bv, bloedzuiger, lamprei, kikkervisje) 3. Het repetitieve karakter van de motoriek bij deze dieren is toegelaten voor de studie van rhythmogenesis, voor de analyse van de biofysische evenementen rijden motoriek, en voor het bewaken van de neurale afvuren patronen die de motoriek te begeleiden. Het gebruik van Drosophila larven voor studies van beweging een unieke combinatie van voordelen boven andere modelsystemen: facile genetica, goed gekarakteriseerde ontwikkeling, een orgaan dat optisch helder in eerste en tweede stadia, en een voortdurende transmissie elektronen microscopische reconstructie van de gehele zenuwstelsel 4-6. Echter, Drosophila larvale locomotion op een vlakke ondergrond geopend is enigszins complex met inbegrip van pauzes, draaien, en meanderende kruipt 7. Deze publicatie geeft een methode om lineaire agarose kanalen gebruiken om Drosophila larvale locomotorisch gedrag te begeleiden, zodat de larven voeren volgehouden, recht, ritmische kruipen gedrag. Bestuderen Drosophila larven gedrag agarose kanalen, in plaats van gedrag vlakke oppervlakken geopend, heeft verschillende voordelen. Ten eerste kunnen onderzoekers eerst selecteren crawlgedrag uit de vele bewegingen die deel uitmaken van de larvale gedragsrepertoire. Ten tweede, door het aanpassen van de breedte van het kanaal ten opzichte van de larvale lichaamsgrootte, stapvoets kan worden aangepast. Derde kanalen zorgen voor de larve wordt vanuit dorsale, ventrale of laterale afhankelijk van de larve is geplaatst en georiënteerd binnen het kanaal. Deze veelzijdigheid in larvale oriëntatie zorgt voor een structuur van belang om voortdurend zichtbaar tijdens het kruipen zijn. Vierde,kanalen zijn vatbaar voor gebruik met een groot aantal microscopen en doelstellingen. Zo kan bijvoorbeeld de lineaire kanalen worden gebruikt voor lage-resolutie beeldvorming over bright-field stereoscopen en / of voor hoge-resolutie beeldvorming over spinning-disk confocale microscopen 1. Ten vijfde kan deze werkwijze worden gebruikt in combinatie met optogenetic / thermogenetische neuronale handelingen met genetische achtergrond. Tenslotte, omdat zowel de larvale lichaam (in eerste en tweede stadia) en agarose kanalen optisch helder, kanalen kunnen worden gebruikt bij het bestuderen van de dynamische bewegingen, of veranderingen in fluorescentie-intensiteit van larvale structuren gelabeld door genetisch gecodeerde fluorescerende probes. De beschreven methode is geschikt voor gedetailleerde kinematische studie van de eerste en tweede instar Drosophila larvale gedrag. Deze publicatie analyseert de dynamische veranderingen in fluorescentie-intensiteit van het centrale zenuwstelsel tijdens de voorwaartse larven kruipen op het gebruik van kanalen te tonen en als een voorloper van NeuRonal calcium imaging.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="643">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">6 oz square Drosophila bottle</td>
			<td style="width:101px;">Scimart</td>
			<td style="width:119px;">DR-103</td>
			<td style="width:212px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">agar</td>
			<td style="width:101px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">A1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">sucrose</td>
			<td style="width:101px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">apple juice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>not from concentrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Tegosept</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>T2300</td>
			<td>methyl-p-hydroxybenzoate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">35 x 10 mm round petri dish</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td align="right">351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">baker&#39;s yeast</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">PDMS casting mold</td>
			<td style="width:101px;">FlowJem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>can be requested from authors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">isopropyl alcohol</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A417-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">laboratory wipes</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">06-666-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">canned air</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">18-431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">10 cm petri dish</td>
			<td style="width:101px;">BioPioneer</td>
			<td style="width:119px;">GS82-1473-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">agarose</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">50-444-176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">razor blade</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">forceps</td>
			<td style="width:101px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">11241-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">22 x 40 cover glass, #1.5</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">50-365-605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Fiji (version 1.51d)</td>
			<td style="width:101px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>fiji.sc</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Excel 2016</td>
			<td style="width:101px;">Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>www.microsoftstore.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">MATLAB R2016</td>
			<td style="width:101px;">Mathworks</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>www.mathworks.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using linear agarose channels to study drosophila larval crawling behavior

Drosophila larven kruipen is in opkomst als een krachtig model voor neurale controle van sensomotorische gedrag te bestuderen. Echter, larven kruipen gedrag op een vlakke ondergrond geopend is complex, met inbegrip van: pauzeren, draaien en kronkelen. Deze complexiteit in het repertoire van beweging belemmert gedetailleerde analyse van de gebeurtenissen die zich tijdens een enkele kruipen stap cyclus. Om dit obstakel te overwinnen, werden lineaire agarose kanalen gemaakt dat larvale gedrag recht, duurzame, ritmische kruipen beperken. In principe, omdat agarose kanalen en de Drosophila larven lichaam zowel optisch helder, de beweging van larvale structuren gelabeld door genetisch gecodeerde fluorescerende probes kan worden gevolgd in intacte, vrij bewegende larven. In het verleden werden larven in lineaire kanalen geplaatst en kruipen op het niveau van hele organisme, segment, en spier werden geanalyseerd 1. In de toekomst kan larven kruipen kanalen worden gebruikt calcium imaging neuro bewakennal activiteit. Bovendien kunnen deze werkwijzen worden gebruikt met larven van elke genotype en eventuele-onderzoeker ontworpen kanaal. Waardoor het protocol hieronder is breed toepasbaar voor studies op de Drosophila larven als model motorbesturing begrijpen.

Dit artikel beschrijft een werkwijze voor het geleiden Drosophila larven gedrag middels agarose kanalen en voor het meten van de dynamiek van larvale structuren over een cyclus kruipen. Larven in lineaire kanalen voeren aanhoudende aanvallen van ritmische kruipen (figuur 3). Omdat zowel larven en kanalen zijn optisch helder, kunnen kanalen worden gebruikt met larven uitdrukken fluorescerende probes uitgedrukt in een structuur van belang. We namen larven die GFP ...

Watch this Scientific Journal Video about Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior at JoVE.com

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

De Drosophila larven is een krachtig modelsysteem om neuronale controle van gedrag te bestuderen. Deze publicatie beschrijft het gebruik van lineaire agarose kanalen om aanhoudende aanvallen van lineaire kruipen en methoden te lokken om de dynamiek van larvale structuren te kwantificeren tijdens repetitieve kruipen gedrag.

Met behulp van Linear Agarose kanalen om te studeren<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale Crawling Behavior

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Single Sensillum Opnamen in de Insecten Drosophila melanogaster En Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser capture microdissectie van Drosophila Perifere neuronen

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Visualisatie van larvale Segmentale zenuwen in 3 Rd Instar Drosophila Larvale Voorbereidingen

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Morfologische Analyse van de Drosophila Larvale Perifere sensorische neuron dendrieten en axonen het gebruik van genetische Mozaïeken

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

Methods to Assay Drosophila Behavior

Methods to Assay Drosophila Behavior

Methoden om Assay Drosophila Gedrag

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Live-Imaging van<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

Een eenvoudige manier om Veranderingen Meet in Reward-zoekend gedrag Met behulp<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

Quantification of Drosophila Grooming Behavior

Kwantificering van Drosophila Grooming Gedrag

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a ...

Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels

Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels

Behandeling van Monosynaptic verbindingen in Drosophila met behulp van resistente tetrodotoxine natrium kanalen

Here, a new technique termed Tetrotoxin (TTX) Engineered Resistance for Probing Synapses (TERPS) is applied to test for monosynaptic connections between ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

Bijhouden van Drosophila larvale gedrag in reactie op de stimulatie van de Optogenetic van olfactorische neuronen

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...