Name: using linear agarose channels to study drosophila larval crawling behavior
Uploaded: 2016-11-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior at JoVE.com

We would like to thank Chris Wreden and Michelle Bland for comments on the manuscript and for technical help.

1. Utarbeidelse av larver <ol><li> En uke før innspillingen atferd, satt opp et kors (minimum 25 jomfruer og 5 menn). Opprettholde alle kors og avkom ved 25 ° C. MERK: Temperaturen på dyrkningsforhold kan endres, men tidslinjen beskrevet nedenfor trenger å bli justert på kontoen for endringer i utviklingshastigheten. </li><li> 5 dager før opptaket, først i morgen, plasserer innlegg inn i en samling bur med en agar / juice cap og en skvett (0,5-1 ml) av gjær lim i midten av agar / juice cap. <ol><li> For...

<ol>
	<li>Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Drosophila+larval+crawling+at+the+level+of+organism,+segment,+and+somatic+body+wall+musculature.">Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature.</a> J Neurosci. 32 (36), 12460-12471 (2012).</li><li>Marder, E., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+rhythmic+motor+pattern+generation.">Principles of rhythmic motor pattern generation.</a> Physiol rev. 76 (3), 687 (1996).</li><li>Mullins, O. J., Hackett, J. T., Buchanan, J. T., Friesen, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+control+of+swimming+behavior:+Comparison+of+vertebrate+and+invertebrate+model+systems.">Neuronal control of swimming behavior: Comparison of vertebrate and invertebrate model systems.</a> Prog Neurobiol. 93 (2), 244-269 (2011).</li><li>Ohyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multilevel+multimodal+circuit+enhances+action+selection+in+Drosophila.">A multilevel multimodal circuit enhances action selection in Drosophila.</a> Nature. 520 (7549), 633-639 (2015).</li><li>Landgraf, M., Thor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Drosophila+motoneurons:+specification+and+morphology.">Development of Drosophila motoneurons: specification and morphology.</a> Semin cell devl bio. 17 (1), 3-11 (2006).</li><li>Heckscher, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even-Skipped(+)+Interneurons+Are+Core+Components+of+a+Sensorimotor+Circuit+that+Maintains+Left-Right+Symmetric+Muscle+Contraction+Amplitude.">Even-Skipped(+) Interneurons Are Core Components of a Sensorimotor Circuit that Maintains Left-Right Symmetric Muscle Contraction Amplitude.</a> Neuron. 88 (2), 1-16 (2015).</li><li>Green, C. H., Burnet, B., Connolly, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+patterns+of+inter-and+intraspecific+variation+in+the+behaviour+of+Drosophila+larvae.">Organization and patterns of inter-and intraspecific variation in the behaviour of Drosophila larvae.</a> Anim Behav. 31 (1), 282-291 (1983).</li><li>Graf, S. A., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rover/Sitter+Drosophila+melanogaster+Larval+Foraging+Polymorphism+as+a+Function+of+Larval+Development,+Food-Patch+Quality,+and+Starvation.">Rover/Sitter Drosophila melanogaster Larval Foraging Polymorphism as a Function of Larval Development, Food-Patch Quality, and Starvation.</a> J Insect Behav. 2 (3), 301-313 (1989).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li><li>Rebay, I., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yan+Functions+as+a+General+Inhibitor+of+Differentiation+and+Is+Negatively+Regulated+by+Activation+of+the+Rasl+/+MAPK+Pathway.">Yan Functions as a General Inhibitor of Differentiation and Is Negatively Regulated by Activation of the Rasl / MAPK Pathway.</a> Cell. 81 (6), 857-866 (1995).</li><li>Chen, T. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Tufte, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The visual display of quantitative information. , (2004).</li></ol>

En microfluidic enheten ble bygget for å gjøre lineære agarose kanaler som rommer Drosophila larver (figur 1). Når Drosophila larver er plassert i disse lineære agarose kanalene deres atferdsrepertoar er begrenset til gjennomgang, som gjør det mulig for detaljert observasjon av dynamikken i larve strukturer over gjennomgangen syklus. En vellykket opptak oppstår når en larve utføre en serie av rytmiske skritt (figur 3). Hvis dette i...

Det overordnede målet med denne metoden er å studere Drosophila larve krypende i detalj. Forsøk på bevegelse har spilt en viktig rolle i å utvikle og teste teorier om motorisk kontroll to. Tradisjonelt bevegelse har blitt undersøkt i akvatiske dyr (for eksempel igle, niøye, rumpetroll) 3. Den repeterende natur for bevegelse i disse dyrene har tillatt for studiet av rhythmogenesis, for analyse av de biofysiske hendelsene drivende bevegelse, og for overvåking av nevrale avfyring mønstre som følger bevegelse. Bruken av Drosophila larver for studier av bevegelse presenterer en unik kombinasjon av fordeler fremfor andre modellsystemer: lettvinte genetikk, godt karakterisert utvikling, en kropp som er optisk klar på første og andre instars, og en pågående transmisjonselektronmikroskop rekonstruksjon av hele nervesystemet 4-6. Men Drosophila larve locobevegelse på flate åpne flater er noe komplisert inkludert pauser, snur, og meandrerende kryper 7. Denne publikasjonen presenterer en metode for å bruke lineære agarose kanaler for å lede Drosophila larve bevegelsesatferd slik at larvene utfører vedvarende, rett, rytmisk kryp atferd. Studerer Drosophila larve oppførsel i agarose kanaler, i stedet for på flate oppførsel åpne flater, har flere fordeler. Først gjør det forskerne å spesifikt velge krypende atferd fra de mange bevegelser som er en del av larveatferdsrepertoar. For det andre, ved å justere bredden av kanalen i forhold til larvekroppsstørrelse, krypende hastighet kan reguleres. For det tredje, kanaler tillater for larven å bli sett fra dorsal, ventral, eller lateral side avhengig av hvor larven er lastet og orientert inne i kanalen. Denne allsidigheten i larve orientering tillater noen struktur av interesse å være kontinuerlig synlig under gjennomgangen. Fjerde,kanaler er mottagelig for bruk sammen med en lang rekke mikroskoper og målsettinger. For eksempel kan lineære kanaler brukes for lav oppløsning bildebehandling på lyse-feltet stereoscopes og / eller for høy oppløsning avbildning av sentrifuge-disc confocal mikroskoper 1. Femte, kan denne metoden brukes i kombinasjon med optogenetic / thermogenetic neuronale manipulasjoner i en hvilken som helst genetisk bakgrunn. Til slutt, fordi både larvekroppen (i første og andre instars) og agarose kanalene er optisk klart, kanaler kan brukes når du studerer dynamiske bevegelser, eller endringer i fluorescerende intensiteten av larve strukturer merket med genetisk kodet fluorescerende prober. Metoden er beskrevet er egnet for detalj kinematiske studier av første og andre stadium Drosophila larve atferd. Denne publikasjonen analyserer dynamiske endringer i fluorescerende intensiteten av CNS under frem larvekryp å demonstrere bruken av kanaler og som en forløper til NeuRonal kalsium bildebehandling.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="643">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">6 oz square Drosophila bottle</td>
			<td style="width:101px;">Scimart</td>
			<td style="width:119px;">DR-103</td>
			<td style="width:212px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">agar</td>
			<td style="width:101px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">A1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">sucrose</td>
			<td style="width:101px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">apple juice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>not from concentrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Tegosept</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>T2300</td>
			<td>methyl-p-hydroxybenzoate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">35 x 10 mm round petri dish</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td align="right">351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">baker&#39;s yeast</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">PDMS casting mold</td>
			<td style="width:101px;">FlowJem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>can be requested from authors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">isopropyl alcohol</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A417-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">laboratory wipes</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">06-666-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">canned air</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">18-431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">10 cm petri dish</td>
			<td style="width:101px;">BioPioneer</td>
			<td style="width:119px;">GS82-1473-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">agarose</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">50-444-176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">razor blade</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">forceps</td>
			<td style="width:101px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">11241-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">22 x 40 cover glass, #1.5</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">50-365-605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Fiji (version 1.51d)</td>
			<td style="width:101px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>fiji.sc</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Excel 2016</td>
			<td style="width:101px;">Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>www.microsoftstore.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">MATLAB R2016</td>
			<td style="width:101px;">Mathworks</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>www.mathworks.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using linear agarose channels to study drosophila larval crawling behavior

Drosophila larve gjennomgangen fremstår som en kraftfull modell for å studere nevrale kontroll av sensorisk atferd. Imidlertid er larvekrypende oppførsel på flate åpne flater komplekse, inkludert: pause, snu, og svingete. Denne kompleksiteten i repertoaret bevegelses hindrer detaljert analyse av hendelsene som oppstår under en enkelt krype skride syklus. For å overvinne denne hindringen, ble lineære agarose kanaler gjorde at begrense larve atferd til rett, vedvarende, rytmisk gjennomgang. I prinsippet, fordi agarose kanaler og Drosophila larve legemet er både optisk klare, bevegelsen av larver strukturer merket med genetisk kodet fluorescerende prober kan overvåkes i intakte, fritt-bevegelige larver. I det siste, ble larvene plassert i lineære kanaler og krypende på nivå med hele organismen, segment, og muskel ble analysert 1. I fremtiden kan larvene gjennomgangen i kanaler brukes for kalsium bildebehandling til å overvåke neuronal aktivitet. Videre kan disse fremgangsmåter anvendes sammen med larver av en hvilken som helst genotype og med en hvilken som helst forsker-utformet kanal. Således protokollen presentert nedenfor er bredt anvendelig for undersøkelser ved hjelp av Drosophila larven som en modell for å forstå motorisk kontroll.

Denne artikkelen beskriver en fremgangsmåte for føring av Drosophila larve oppførsel ved hjelp av agarose-kanaler og for måling av dynamikken i larve strukturer over et gjennomsøking syklus. Larver i lineære kanaler utføre vedvarende anfall av rytmisk gjennomgangen (figur 3). Fordi både larver og kanaler er optisk klart, kan kanaler brukes med larver uttrykker fluorescerende prober uttrykt i noen struktur av interesse. Vi registrerte larver uttrykker GFP...

Watch this Scientific Journal Video about Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior at JoVE.com

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Drosophila larven er et kraftig modellsystem for å studere nevrale kontroll av virkemåten. Denne publikasjonen beskriver bruk av lineære agarose kanaler for å lokke fram vedvarende anfall av lineær gjennomgang og metoder for å kvantifisere dynamikken i larve strukturer under repeterende krypende atferd.

Bruke Lineær Agarose kanaler å studere<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve Crawling Behavior

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Morfologisk analyse av Drosophila Larve perifer sensorisk Neuron dendritter og Axoner bruke Genetic Mosaikk

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

Methods to Assay Drosophila Behavior

Methods to Assay Drosophila Behavior

Metoder til Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Live-Imaging av<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

En enkel måte å måle endringer i Reward-søkende atferd med<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

Quantification of Drosophila Grooming Behavior

Kvantifisering av Drosophila Grooming Behavior

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a ...

Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels

Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels

Undersøke Monosynaptic forbindelser i Drosophila bruke Tetrodotoxin motstandsdyktig natrium kanaler

Here, a new technique termed Tetrotoxin (TTX) Engineered Resistance for Probing Synapses (TERPS) is applied to test for monosynaptic connections between ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

Sporing Drosophila larver atferd som svar til Optogenetic stimulering av Olfactory nerveceller

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...