Name: using linear agarose channels to study drosophila larval crawling behavior
Uploaded: 2016-11-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior at JoVE.com

We would like to thank Chris Wreden and Michelle Bland for comments on the manuscript and for technical help.

1. Preparação de larvas <ol><li> Uma semana antes de gravar comportamento, configurar uma cruz (mínimo de 25 virgens e 5 machos). Manter todos os cruzamentos e filhos a 25 ° C. NOTA: A temperatura de condições de cultura pode ser alterado, mas a linha de tempo descrito abaixo iria necessitar de ser ajustada para considerar as alterações na velocidade de desenvolvimento. </li><li> 5 dias antes da gravação, a primeira coisa na parte da manhã, colocar a cruz em uma gaiola coleção com uma tampa de agar...

<ol>
	<li>Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Drosophila+larval+crawling+at+the+level+of+organism,+segment,+and+somatic+body+wall+musculature.">Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature.</a> J Neurosci. 32 (36), 12460-12471 (2012).</li><li>Marder, E., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+rhythmic+motor+pattern+generation.">Principles of rhythmic motor pattern generation.</a> Physiol rev. 76 (3), 687 (1996).</li><li>Mullins, O. J., Hackett, J. T., Buchanan, J. T., Friesen, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+control+of+swimming+behavior:+Comparison+of+vertebrate+and+invertebrate+model+systems.">Neuronal control of swimming behavior: Comparison of vertebrate and invertebrate model systems.</a> Prog Neurobiol. 93 (2), 244-269 (2011).</li><li>Ohyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multilevel+multimodal+circuit+enhances+action+selection+in+Drosophila.">A multilevel multimodal circuit enhances action selection in Drosophila.</a> Nature. 520 (7549), 633-639 (2015).</li><li>Landgraf, M., Thor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Drosophila+motoneurons:+specification+and+morphology.">Development of Drosophila motoneurons: specification and morphology.</a> Semin cell devl bio. 17 (1), 3-11 (2006).</li><li>Heckscher, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even-Skipped(+)+Interneurons+Are+Core+Components+of+a+Sensorimotor+Circuit+that+Maintains+Left-Right+Symmetric+Muscle+Contraction+Amplitude.">Even-Skipped(+) Interneurons Are Core Components of a Sensorimotor Circuit that Maintains Left-Right Symmetric Muscle Contraction Amplitude.</a> Neuron. 88 (2), 1-16 (2015).</li><li>Green, C. H., Burnet, B., Connolly, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+patterns+of+inter-and+intraspecific+variation+in+the+behaviour+of+Drosophila+larvae.">Organization and patterns of inter-and intraspecific variation in the behaviour of Drosophila larvae.</a> Anim Behav. 31 (1), 282-291 (1983).</li><li>Graf, S. A., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rover/Sitter+Drosophila+melanogaster+Larval+Foraging+Polymorphism+as+a+Function+of+Larval+Development,+Food-Patch+Quality,+and+Starvation.">Rover/Sitter Drosophila melanogaster Larval Foraging Polymorphism as a Function of Larval Development, Food-Patch Quality, and Starvation.</a> J Insect Behav. 2 (3), 301-313 (1989).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li><li>Rebay, I., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yan+Functions+as+a+General+Inhibitor+of+Differentiation+and+Is+Negatively+Regulated+by+Activation+of+the+Rasl+/+MAPK+Pathway.">Yan Functions as a General Inhibitor of Differentiation and Is Negatively Regulated by Activation of the Rasl / MAPK Pathway.</a> Cell. 81 (6), 857-866 (1995).</li><li>Chen, T. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Tufte, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The visual display of quantitative information. , (2004).</li></ol>

Um dispositivo de microfluidos foi construído para fazer canais de agarose lineares que podem acomodar as larvas de Drosophila (Figura 1). Quando as larvas de Drosophila são colocados nestes canais de agarose lineares seu repertório comportamental é limitada para o rastreamento, o qual permite a observação detalhada da dinâmica de estruturas larvais ao longo do ciclo de rastreio. Uma gravação bem sucedida quando ocorre uma larva de executar uma sé...

O objetivo geral deste método é estudar Drosophila rastreamento larval em detalhe. Experimentos em locomoção têm desempenhado um papel importante no desenvolvimento e teste de teorias sobre o controle motor 2. Tradicionalmente locomoção foi estudado em animais aquáticos (por exemplo, sanguessuga, lampreia, girino) 3. A natureza repetitiva de locomoção nestes animais foi permitido para o estudo de rhythmogenesis, para análise dos eventos biofísicas locomoção de condução, e para monitorizar os padrões de disparo neurais que acompanham a locomoção. O uso de larvas de Drosophila para estudos de locomoção apresenta uma combinação única de vantagens sobre outros sistemas modelo: genética fáceis, o desenvolvimento bem caracterizada, um corpo que é opticamente clara no primeiro e segundo estádios e uma reconstrução de microscopia eletrônica de transmissão contínua de toda a sistema nervoso 4-6. No entanto, Drosophila larval locomovimento sobre superfícies planas e abertas é um pouco complexo, incluindo pausas, voltas, e sinuoso rasteja 7. Esta publicação apresenta um método para usar os canais de agarose lineares para guiar o comportamento locomotor larval Drosophila tal que larvas executar sustentado, comportamento de rastreamento em linha reta, rítmica. Estudando o comportamento das larvas de Drosophila em canais de agarose, em vez de comportamento sobre superfícies planas e abertas, tem várias vantagens. Primeiro, ele permite que os pesquisadores para selecionar especificamente rastejando comportamento dos muitos movimentos que fazem parte do repertório comportamental larval. Em segundo lugar, ajustando a largura do canal em relação ao tamanho do corpo das larvas, rastejando velocidade pode ser ajustada. Em terceiro lugar, os canais para permitir que a larva para ser visto a partir dorsal, ventral, ou lateral, dependendo de como a larva é carregado e orientada no interior do canal. Esta versatilidade na orientação das larvas permite a qualquer estrutura de interesse a ser continuamente visível durante o rastreamento. Quarto,canais são passíveis de utilização com uma vasta variedade de microscópios e objectivos. Por exemplo, os canais lineares pode ser usado para geração de imagens de baixa resolução em stereoscopes de campo brilhante e / ou para imagens de alta resolução sobre a fiação de disco microscópios confocal 1. Em quinto lugar, este método pode ser usado em combinação com manipulações neuronais optogenetic / termogênico em todo o fundo genético. Finalmente, porque tanto o corpo larval (em primeiro e segundo estádios) e canais de agarose são opticamente clara, canais podem ser usados ​​quando se estuda os movimentos dinâmicos, ou mudanças na intensidade da fluorescência das estruturas larval rotulados por sondas fluorescentes geneticamente codificados. O método descrito é apropriado para estudos cinemáticos detalhadas de primeiro e segundo instar Drosophila comportamento larval. Esta publicação analisa as mudanças dinâmicas na intensidade de fluorescência do CNS durante o rastreamento larval para a frente para demonstrar o uso de canais e como um precursor para NeuImagem de cálcio ronal.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="643">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">6 oz square Drosophila bottle</td>
			<td style="width:101px;">Scimart</td>
			<td style="width:119px;">DR-103</td>
			<td style="width:212px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">agar</td>
			<td style="width:101px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">A1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">sucrose</td>
			<td style="width:101px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">apple juice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>not from concentrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Tegosept</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>T2300</td>
			<td>methyl-p-hydroxybenzoate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">35 x 10 mm round petri dish</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td align="right">351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">baker&#39;s yeast</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">PDMS casting mold</td>
			<td style="width:101px;">FlowJem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>can be requested from authors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">isopropyl alcohol</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A417-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">laboratory wipes</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">06-666-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">canned air</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">18-431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">10 cm petri dish</td>
			<td style="width:101px;">BioPioneer</td>
			<td style="width:119px;">GS82-1473-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">agarose</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">50-444-176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">razor blade</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">forceps</td>
			<td style="width:101px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">11241-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">22 x 40 cover glass, #1.5</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">50-365-605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Fiji (version 1.51d)</td>
			<td style="width:101px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>fiji.sc</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Excel 2016</td>
			<td style="width:101px;">Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>www.microsoftstore.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">MATLAB R2016</td>
			<td style="width:101px;">Mathworks</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>www.mathworks.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using linear agarose channels to study drosophila larval crawling behavior

Drosophila rastreamento larval está emergindo como um modelo poderoso para estudar controle neural do comportamento sensório-motor. No entanto, comportamento de rastreamento larval em superfícies planas e abertas é complexo, incluindo: pausa, girando, e sinuoso. Esta complexidade no repertório do movimento dificulta uma análise detalhada dos eventos que ocorrem durante um único ciclo de rastreamento passo. Para superar esse obstáculo, os canais de agarose lineares foram feitas, que restringem o comportamento das larvas para, sustentada, rastreamento rítmica reta. Em princípio, pois os canais de agarose e o corpo de larvas de Drosophila são ambos opticamente clara, o movimento das estruturas de larvas rotulados por sondas fluorescentes geneticamente codificados podem ser monitorizadas em larvas intacta, livremente em movimento. No passado, as larvas foram colocados em canais lineares e rastejando ao nível do organismo inteiro, segmento, e músculo foram analisados 1. No futuro, as larvas rastejar nos canais podem ser usados ​​para imagiologia de cálcio para monitorar neuroatividade nal. Além disso, estes métodos podem ser utilizados com larvas de qualquer genótipo e com qualquer canal concebido-investigador. Assim, o protocolo apresentado abaixo é amplamente aplicável para estudos utilizando a larva de Drosophila como um modelo para compreender o controlo do motor.

Este artigo descreve um método para guiar o comportamento da larva de Drosophila usando canais de agarose e para medir a dinâmica das estruturas larvais ao longo de um ciclo de rastreamento. Larvas em canais lineares executar ataques sustentados de rastreamento rítmica (Figura 3). Uma vez que tanto as larvas e os canais são opticamente transparentes, os canais podem ser usados ​​com larvas expressando sondas fluorescentes expressas em qualquer estrutura ...

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Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

A larva Drosophila é um sistema poderoso modelo para estudar o controle neural do comportamento. Esta publicação descreve o uso de canais de agarose lineares para provocar surtos sustentados de rastreamento e métodos linear para quantificar a dinâmica das estruturas de larvas durante o comportamento rastejando repetitivo.

Usando Canais Linear de agarose para o Estudo<em&gt; Drosophila</em&gt; Comportamento larval Crawling

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JoVE Journal

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