Name: using linear agarose channels to study drosophila larval crawling behavior
Uploaded: 2016-11-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior at JoVE.com

We would like to thank Chris Wreden and Michelle Bland for comments on the manuscript and for technical help.

1. Preparación de las larvas <ol><li> Una semana antes de grabar el comportamiento, configure una cruz (mínimo de 25 vírgenes y 5 machos). Mantener todos los cruces y la progenie a 25 ° C. NOTA: La temperatura de las condiciones de cultivo puede ser alterado, pero tendría que ser ajustado para tener en cuenta los cambios en la velocidad del desarrollo de la línea de tiempo se describe a continuación. </li><li> 5 días antes de la grabación, a primera hora de la mañana, colocar la cruz en una jaula de r...

<ol>
	<li>Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Drosophila+larval+crawling+at+the+level+of+organism,+segment,+and+somatic+body+wall+musculature.">Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature.</a> J Neurosci. 32 (36), 12460-12471 (2012).</li><li>Marder, E., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+rhythmic+motor+pattern+generation.">Principles of rhythmic motor pattern generation.</a> Physiol rev. 76 (3), 687 (1996).</li><li>Mullins, O. J., Hackett, J. T., Buchanan, J. T., Friesen, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+control+of+swimming+behavior:+Comparison+of+vertebrate+and+invertebrate+model+systems.">Neuronal control of swimming behavior: Comparison of vertebrate and invertebrate model systems.</a> Prog Neurobiol. 93 (2), 244-269 (2011).</li><li>Ohyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multilevel+multimodal+circuit+enhances+action+selection+in+Drosophila.">A multilevel multimodal circuit enhances action selection in Drosophila.</a> Nature. 520 (7549), 633-639 (2015).</li><li>Landgraf, M., Thor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Drosophila+motoneurons:+specification+and+morphology.">Development of Drosophila motoneurons: specification and morphology.</a> Semin cell devl bio. 17 (1), 3-11 (2006).</li><li>Heckscher, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even-Skipped(+)+Interneurons+Are+Core+Components+of+a+Sensorimotor+Circuit+that+Maintains+Left-Right+Symmetric+Muscle+Contraction+Amplitude.">Even-Skipped(+) Interneurons Are Core Components of a Sensorimotor Circuit that Maintains Left-Right Symmetric Muscle Contraction Amplitude.</a> Neuron. 88 (2), 1-16 (2015).</li><li>Green, C. H., Burnet, B., Connolly, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+patterns+of+inter-and+intraspecific+variation+in+the+behaviour+of+Drosophila+larvae.">Organization and patterns of inter-and intraspecific variation in the behaviour of Drosophila larvae.</a> Anim Behav. 31 (1), 282-291 (1983).</li><li>Graf, S. A., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rover/Sitter+Drosophila+melanogaster+Larval+Foraging+Polymorphism+as+a+Function+of+Larval+Development,+Food-Patch+Quality,+and+Starvation.">Rover/Sitter Drosophila melanogaster Larval Foraging Polymorphism as a Function of Larval Development, Food-Patch Quality, and Starvation.</a> J Insect Behav. 2 (3), 301-313 (1989).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li><li>Rebay, I., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yan+Functions+as+a+General+Inhibitor+of+Differentiation+and+Is+Negatively+Regulated+by+Activation+of+the+Rasl+/+MAPK+Pathway.">Yan Functions as a General Inhibitor of Differentiation and Is Negatively Regulated by Activation of the Rasl / MAPK Pathway.</a> Cell. 81 (6), 857-866 (1995).</li><li>Chen, T. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Tufte, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The visual display of quantitative information. , (2004).</li></ol>

Un dispositivo de microfluidos se construyó para hacer canales de agarosa lineales que pueden alojar las larvas de Drosophila (Figura 1). Cuando las larvas de Drosophila se colocan en estos canales de agarosa lineales su repertorio de comportamiento se limita a rastreo, que permite la observación detallada de la dinámica de estructuras de larvas durante el ciclo de rastreo. Una grabación exitosa ocurre cuando una larva de realizar una ...

El objetivo general de este método es el estudio de Drosophila rastreo de larvas en detalle. Los experimentos sobre la locomoción han jugado un papel importante en el desarrollo y prueba las teorías sobre el control del motor 2. Tradicionalmente se ha estudiado la locomoción de los animales acuáticos (por ejemplo, sanguijuela, lamprea, renacuajo) 3. La naturaleza repetitiva de la locomoción en estos animales ha permitido el estudio de rhythmogenesis, para el análisis de los eventos biofísicos locomoción de conducción, y para el seguimiento de los patrones de activación neural que acompañan a la locomoción. El uso de las larvas de Drosophila para los estudios de locomoción presenta una combinación única de ventajas sobre otros sistemas de modelos: genética Facile, desarrollo bien caracterizado, un cuerpo que es ópticamente claro en estadios primero y segundo, y una reconstrucción microscópico electrónico de transmisión en curso de la entera 4-6 sistema nervioso. Sin embargo, Drosophila larval locoel movimiento en superficies planas abiertas es algo complejo que incluye pausas, giros y meandros arrastra 7. Esta publicación presenta un método para utilizar canales de agarosa lineales para guiar el comportamiento locomotor Drosophila larvas de tal manera que las larvas Realizar sostenida, el comportamiento de rastreo rítmica recta. El estudio de comportamiento de las larvas de Drosophila en los canales de agarosa, en lugar de comportamiento en superficies planas abiertas, tiene varias ventajas. En primer lugar, permite a los investigadores para seleccionar específicamente el comportamiento de rastreo de los muchos movimientos que forman parte del repertorio del comportamiento de las larvas. En segundo lugar, mediante el ajuste de la anchura del canal en comparación con el tamaño del cuerpo de las larvas, la velocidad de rastreo se puede ajustar. En tercer lugar, los canales permiten la larva a ser vista desde dorsal, ventral, o en el lado lateral en función de cómo se carga el larva y orientada dentro del canal. Esta versatilidad en la orientación de las larvas permite que cualquier estructura de interés que estar continuamente visibles durante el rastreo. Cuarto,canales son susceptibles para su uso con una amplia variedad de microscopios y objetivos. Por ejemplo, los canales lineales pueden ser utilizados para formación de imágenes de baja resolución en estereoscopios de campo brillante y / o de imágenes de alta resolución en la hilatura de discos microscopios confocales 1. En quinto lugar, este método se puede utilizar en combinación con manipulaciones neuronales optogenética / thermogenetic en cualquier fondo genético. Por último, debido a que tanto el cuerpo de las larvas (en estadios primera y segunda) y los canales de agarosa son ópticamente claro, los canales se pueden utilizar en el estudio de los movimientos dinámicos, o cambios en la intensidad de fluorescencia de las estructuras de larvas etiquetados por sondas fluorescentes codificadas genéticamente. El método descrito es apropiado para estudios detallados de cinemáticas primera y segunda instar Drosophila comportamiento de las larvas. Esta publicación analiza los cambios dinámicos en la intensidad fluorescente de la CNS durante el rastreo larval hacia adelante para demostrar el uso de los canales y como un precursor de neuRonal imágenes de calcio.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="643">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">6 oz square Drosophila bottle</td>
			<td style="width:101px;">Scimart</td>
			<td style="width:119px;">DR-103</td>
			<td style="width:212px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">agar</td>
			<td style="width:101px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">A1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">sucrose</td>
			<td style="width:101px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">apple juice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>not from concentrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Tegosept</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>T2300</td>
			<td>methyl-p-hydroxybenzoate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">35 x 10 mm round petri dish</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td align="right">351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">baker&#39;s yeast</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">PDMS casting mold</td>
			<td style="width:101px;">FlowJem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>can be requested from authors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">isopropyl alcohol</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A417-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">laboratory wipes</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">06-666-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">canned air</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">18-431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">10 cm petri dish</td>
			<td style="width:101px;">BioPioneer</td>
			<td style="width:119px;">GS82-1473-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">agarose</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">50-444-176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">razor blade</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">forceps</td>
			<td style="width:101px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">11241-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">22 x 40 cover glass, #1.5</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">50-365-605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Fiji (version 1.51d)</td>
			<td style="width:101px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>fiji.sc</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Excel 2016</td>
			<td style="width:101px;">Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>www.microsoftstore.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">MATLAB R2016</td>
			<td style="width:101px;">Mathworks</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>www.mathworks.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using linear agarose channels to study drosophila larval crawling behavior

Drosophila rastreo de las larvas se está convirtiendo en un poderoso modelo para estudiar el control neural de la conducta sensoriomotriz. Sin embargo, el comportamiento de rastreo de larvas en las superficies planas abiertas es complejo, incluyendo: hacer una pausa, girando, y meandros. Esta complejidad en el repertorio de movimiento dificulta el análisis detallado de los acontecimientos que ocurren durante un solo ciclo de rastreo zancada. Para superar este obstáculo, se hicieron canales de agarosa lineales que limitan el comportamiento de las larvas al sostenida, arrastre de la recta, rítmica. En principio, porque los canales de agarosa y el cuerpo de la larva de Drosophila son tanto ópticamente transparente, el movimiento de las estructuras de larvas marcadas por las sondas fluorescentes codificadas genéticamente se puede controlar en, las larvas se mueven libremente intacta. En el pasado, las larvas se colocaron en canales lineales y arrastrándose a nivel de todo el organismo, segmento, y el músculo se analizaron 1. En el futuro, las larvas que se arrastra en los canales se puede utilizar para imágenes de calcio para controlar neurola actividad final. Además, estos métodos se pueden utilizar con larvas de cualquier genotipo y con cualquier canal investigador-diseñado. Así, el protocolo se presenta a continuación es ampliamente aplicable para los estudios que utilizan la larva de Drosophila como un modelo para comprender el control motor.

Este artículo describe un método para guiar el comportamiento de las larvas de Drosophila utilizando canales de agarosa y para medir la dinámica de estructuras de larvas en un ciclo de rastreo. Las larvas en los canales lineales realizar combates sostenidos de rastreo rítmica (Figura 3). Debido a que tanto las larvas y los canales son ópticamente claro, los canales se pueden utilizar con larvas expresar sondas fluorescentes expresados ​​en cualquier est...

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Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

La larva de Drosophila es un sistema poderoso modelo para estudiar el control neural de la conducta. Esta publicación describe el uso de canales lineales de agarosa para provocar combates sostenidos de rastreo y métodos lineales para cuantificar la dinámica de las estructuras de larvas durante el rastreo comportamiento repetitivo.

Uso de los canales lineales de agarosa para estudiar<em&gt; Drosophila</em&gt; Comportamiento de las larvas de arrastre

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

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JoVE Journal

Neuroscience

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