Name: optimization of a quantitative micro-neutralization assay
Uploaded: 2016-12-14T15:00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay at JoVE.com

The authors thank Dr. M. Matrosovich for providing the parent MDCK and MDCK-SIAT1 cell lines and Roche Pharmaceuticals for supplying the oseltamivir carboxylate.We also appreciate Dr. Anne Weston for valuable suggestions on the manuscript. This study was dependent upon the valued collaboration of the WHO National Influenza Centres and the WHO CCs within the WHO GISRS, who provided the influenza viruses used. This work was funded by the Medical Research Council through Programme U117512723.

LET OP: De bioveiligheidsniveau (BSL) voor de volgende protocol is BSL 2 voor seizoensgebonden influenza virussen en BSL 3+ voor potentiële pandemische griepvirussen. Virale titratie is vereist voordat een neutralisatie experiment beslist de virale concentratie van de virale controle (VC). 1. Virus titratie Opmerking: Afhankelijk van het aantal virussen en het aantal duplicaten, kan een plaat worden ingesteld met de volgende flexibiliteit: (1) De virale verdunning kan worden aangebracht langs ofwel de rijen of de kolommen (figuur 1). Elk virus moet een aparte rij / kolom te bezetten. (2) De virale verdunning increment is flexibel, maar het moet beginnen met de hoogste virale concentratie op de linker bovenhoek. (3) Er is geen beperking op het aantal duplicaten. LET OP: Madin Darby hond (MDCK) en MDCK-SIAT1 (SIAT) cellen werden vriendelijk verschaft door Dr. M. Matrosovich, Marburg, Gervele 10. SIAT cellen MDCK-cellen stabiel getransfecteerd met de humane CMP-N-acetylneuraminate: P-galactoside α-2,6- sialyltransferase-gen voor verhoogde expressie van siaalzuur (SA) α2-6Gal beëindigde oligosacchariden. <ol><li> Aliquot voldoende MDCK-cellen of MDCK-cellen SIAT 8 naar 96-well platen (200 ul / putje). Incubeer de cellen bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 2 of 3 dagen tot confluentie bereiken. Propageren cellen in DMEM aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd foetaal kalfsserum (FCS) en antibiotica (100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine). Incubeer de SIAT cellen bij 37 ° C met 5% CO2 en 1 mg / ml G418 sulfaat. NB: De verdunningsfactor is afhankelijk van de ervaring en de gebruikte cellijn. De eencellige laag moet confluent (dwz, geen celwand of toegankelijk schets voor MDCK cellen en een dicht gepakte layout voor MDCK-cellen SIAT1) bij de virusinoculatie. Voorbeelden van verdunningen op basis vande subcultuur van confluente flessen van MDCK of MDCK-cellen SIAT1 zijn vermeld in tabel 1. </li><li> Was de cellen 3 maal met 200 ul virus groeimedium (VGM) per putje. Steriliseer de meerwandige plaat ring met 70% EtOH gedurende 30 min, en spoel vervolgens in steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) of VGM voor de was. </li><li> Zuig het VGM onmiddellijk voeg 50 ul van VGM aan elk putje. </li><li> Voeg 900 ul van VGM aan elk van 6 steriele buizen (of minder, afhankelijk van het aantal testvirussen en duplicaten). Pipet 100 ul van virus in de eerste buis, meng goed, en serieel verdunnen, het veranderen van de tips tussen elke verdunning. Herhaal dit voor elk virus te worden getitreerd. LET OP: Dit zal virus verdunningen van 10 -1 tot 10 -6 geven. </li><li> Voeg 50 ul van elk virus verdunning, beginnend bij de hoogste verdunning (1 x 10 -5 in figuur 1), om dubbele putjes (kolommen 9 en 10 in figuur 1) van een 96-wells plaat. </li><li> Plaats de plaat bij 37 ° C gedurende 2-3 uur om het virus aan de cellen te infecteren. OPMERKING: A 2-3 uur incubatie moet voor worden gezorgd dat de virussen in het inoculum voldoende tijd om de monolaag te bereiken. </li><li> Bereid de overlay (10 ml / plaat) LET OP: De bekleding bestaat uit 5 ml 2x DMEM, trypsine (2 ug / ml uiteindelijke concentratie), 20 ui van 1 mg / ml bouillon en 5 ml van cellulose katoenlinters (zie Materials List). </li><li> Verwijder het inoculum. </li><li> Voeg de overlay (200 ul aan elk putje). Incubeer overnacht bij 37 ° C, ongestoord. Opmerking: Het virus ontluikende vindt plaats na ongeveer 4 uur, dus is het belangrijk dat de plaat niet verstoord na deze tijd. </li><li> Zuig het overlay uit de putjes. </li><li> Voeg ijskoude 4% paraformaldehyde in PBS A (200 pl / putje). Plaats ze bij 4 ° C gedurende 30 min en bij kamertemperatuur gedurende 20 min. LET OP: Een PBS is natuurlijke pH-fosfaat-gebufferde zoutoplossing met 10 gof NaCl, 0,25 g KCl, 1,437 g Na 2 HPO 4, 0,25 g KH 2 PO 4, en 1 liter gedestilleerd water (zie Materials List). LET OP: Paraformaldehyde is schadelijk bij inademing en kan brandwonden veroorzaken. Er is ook weinig bewijs van een kankerverwekkende effect, en het kan overgevoeligheid veroorzaken na contact met de huid. </li><li> Zuig het paraformaldehyde en was de platen tweemaal met PBS A (200 gl / putje). </li><li> Bewaar de platen in PBS A bij 4 ° C voor toekomstig gebruik, of doorgaan met de volgende stappen. </li><li> Voeg permeabilisatie buffer (100 ul / putje). Laat het bij kamertemperatuur gedurende 30 min. </li><li> Was plaat tweemaal met PBS A (200 pl / putje). </li><li> Voeg 50 ul van het eerste antilichaam, MAb tegen influenza type A (1: 1000 in ELISA-buffer) per putje. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur (of 4 ° C overnacht), onder schudden. </li><li> Was het 3 keer in 100 pl wasbuffer (0,05% Tween 80 in PBS A, v / v) per ook. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten tussen wasbeurten. Anders, 3 keer wassen zonder incubatie met behulp van 300 ul per putje. </li><li> Voeg 50 ul van het tweede antilichaam, geit anti-muis IgG (H + L) HRP conjugaat (1: 1000 in ELISA-buffer) per putje. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur onder schudden. </li><li> Was het 3 keer beschreven in stap 1.17. </li><li> Voeg het substraat (50 gl / putje). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten of totdat de ontwikkeling van een blauwe kleur duidelijk zichtbaar. </li><li> Om de reactie te stoppen was de plaat tweemaal met 200 gl gedestilleerd water per well, incuberen bij kamertemperatuur gedurende 2 min -3 tussen de wasbeurten. </li><li> Air-droog de plaat en bewaar het op een donkere plaats (bv, wikkel het in aluminiumfolie). </li></ol> 2. Titratie Kwantificering <ol><li> Plaats een plaat in het scangebied van een flatbed scanner, zie figuur 2a. Gebruik de positie L-vorm grens aanzorgen voor een optimale en reproduceerbare beeldvorming locatie. LET OP: Het is mogelijk om het beeld twee goed platen in één scan. </li><li> Een afbeelding scannen. OPMERKING: De instellingen worden getoond in tabel 2. </li><li> Voer het &quot;Wellplate Reader&quot; software om de gewenste virusconcentratie (figuur 3) te berekenen. <ol><li> Klik op de &quot;Load image&quot; knop om een ​​afbeelding te laden. Schuif de rode balk in het histogram van het tabblad &#39;Global Threshold &quot;om het sampling drempel aan te passen. Klik op de knop &quot;Update&quot; om het effect op het beeld te onderzoeken. </li><li> Vink het vakje &#39;Bereken Neutralisatie / titratie &quot;. Klik op de knop &quot;Sampling&quot; om de ICP te kwantificeren. Klik op de knop &quot;Save&quot; om de sampling resultaten op te slaan wanneer dat wordt gevraagd. OPMERKING: Nadat de sampling proces wordt een nieuw venster met de naam &quot;neutralisatie &amp; titratie Berekening&quot; verschijnt automatisch als het vakje &quot;Bereken Neutralisatie / titratie&quot; is aangevinkt. </li><li>Belasting of het invoeren van de goed-plaat definition kaart. Geef de drempel (bijvoorbeeld 30%) in &quot;Titratie: Optimal Virus Bevolking (%)&quot;. Selecteer het tabblad &#39;titratie Process &quot;om de titratie resultaten te berekenen. Controleer de titratie resultaten. Klik op de knop &quot;Opslaan en sluiten&quot; om de titratie resultaten op te slaan. OPMERKING: Raadpleeg Aanvullende S1 voor meer gedetailleerde instructies over de software. Een kopie van de op maat gemaakte software is beschikbaar op aanvraag. LET OP: Typisch, de beste virus verwatering voor de plaque-reductie assay levert ongeveer 50% (20-85%) ICP van de totale cellen in elk putje 11. </li></ol></li></ol> 3. Virus neutralisatie OPMERKING: Bereken het aantal platen nodig voor de neutralisatie assay. Elke plaat is geschikt voor een virus en een aantal antisera. Opmerking: Afhankelijk van het aantal antisera en het aantal duplicaten, een plaat kan worden ingesteld met the flexibiliteit volgende: (1) Het serum verdunning kan worden aangebracht langs volgens rij of kolom (figuur 4). Elk serum moet een aparte rij of kolom te bezetten. (2) De toename van serumverdunning is flexibel, maar het moet beginnen met de hoogste serumconcentratie de linkerbovenhoek van een plaat. (3) Het aantal duplicaten balanceert het aantal antisera. Meer duplicaten kunnen helpen om glad te strijken experimentele variaties. (4) Het aantal VC en het aantal van de celcontrole (CC) duplicaten zijn flexibel, maar ze moeten ook in afzonderlijke rijen of kolommen. Verwacht wordt dat het aantal VC duplo aanzienlijk groter dan die van de antisera. <ol><li> Bereid de cel monolaag, net als in de stappen 1,1-1,3, 2 of 3 dagen van tevoren. </li><li> Voeg 50 ul van VGM aan elk putje van de plaat. </li><li> Gebruik kolommen 11 en 12 voor VC en CC resp. Voeg 50 ul aliquots van 01:20-receptorvernietigend enzym (RDE) behandeld serum aan de eerste rij (A) van Columns 1-10. Opmerking: Voor elk virus en serum combinatie wordt de assay in duplo uitgevoerd, zodat een plaat kan bijvoorbeeld bevatten een virus getoetst vijf antisera. </li><li> Voer 2-voudige opeenvolgende verdunningen door het overdragen van 50 ul van rij A tot H Row (Kolommen 1-10 in figuur 4) en weggooien 50 pl van rij H. </li><li> Voeg 50 ul van verdunning elk putje van de CC kolom (kolom 12 in Figuur 4). </li><li> Voeg 50 ul van het virus aan elk putje van de plaat, behalve de CC kolom (1-11 kolommen, rijen AH in figuur 4). </li><li> Incubeer het op 37 ° C gedurende 2-3 uur. Verwijder het inoculum. Voeg de overlay (200 ui) aan elk putje. Incubeer het &#39;s nachts bij 37 ° C, ongestoord. Fix en vlekken op de platen als voor het virus titratie (stappen 1,11-1,22). </li></ol> 4. neutralisatie kwantificering <ol><li> Plaats een plaat in het scangebied van een flatbed scanner, zie Figure 2a. Gebruik de positie L-vorm te beperken om een ​​optimale en reproduceerbare beeldvorming locatie te waarborgen. LET OP: Het is mogelijk om het beeld twee goed platen in één scan. </li><li> Scan de plaat, zoals beschreven in stap 2.2. </li><li> Voer het &quot;Wellplate Reader&quot; software om de vereiste virale titers (figuur 3, stap 2,3) berekend. <ol><li> Klik op de &quot;Load image&quot; knop om een ​​afbeelding te laden. Schuif de rode balk in &quot;Global Threshold&quot; om het sampling drempel aan te passen. Klik op de knop &quot;Update&quot; om het effect te onderzoeken. </li><li> Vink het vakje &#39;Bereken Neutralisatie / titratie &quot;. Klik op de knop &quot;Sampling&quot; om de ICP te kwantificeren. Klik op de knop &quot;Save&quot; om de sampling resultaten op te slaan wanneer dat wordt gevraagd. OPMERKING: Nadat de sampling proces wordt een nieuw venster met de naam &quot;neutralisatie &amp; titratie Berekening&quot; verschijnt automatisch als het vakje &quot;Bereken Neutralisatie / titratie&quot; is aangevinkt. </li><li> Belasting of het invoeren van de goed plaat kaart. Geef de drempel (bijvoorbeeld 50%) in &quot;Neutralisatie:. Infectie aftrek (%)&quot; </li><li> Selecteer &quot;Neutralisatie&quot; gebruiken de titers berekend. Controleer de titers en klik op de knop &quot;Opslaan en sluiten&quot; om de neutralisatie resultaten op te slaan. OPMERKING: Neutralisatie wordt gerapporteerd als de reciproke van de hoogste verdunning van serum met voorgedefinieerde ICP reductie (bijvoorbeeld 50% of 80%) ten opzichte van de VC (het gemiddelde van kolom 11 in Figuur 4). Een 50% reductie ICP werd gebruikt in de Representatieve resultaten. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Walker, D. L., Horsfall, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+identity+in+neutralizing+and+hemagglutination-inhibiting+antibodies+against+influenza+viruses.">Lack of identity in neutralizing and hemagglutination-inhibiting antibodies against influenza viruses.</a> J Exp Med. 91, 65-86 (1950).</li><li>Medeiros, R., Escriou, N., Naffakh, N., Manuguerra, J. C., van der Werf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemagglutinin+residues+of+recent+human+A(H3N2)+influenza+viruses+that+contribute+to+the+inability+to+agglutinate+chicken+erythrocytes.">Hemagglutinin residues of recent human A(H3N2) influenza viruses that contribute to the inability to agglutinate chicken erythrocytes.</a> Virology. 289, 74-85 (2001).</li><li>Lin, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuraminidase+receptor+binding+variants+of+human+influenza+A(H3N2)+viruses+resulting+from+substitution+of+aspartic+acid+151+in+the+catalytic+site:+a+role+in+virus+attachment.">Neuraminidase receptor binding variants of human influenza A(H3N2) viruses resulting from substitution of aspartic acid 151 in the catalytic site: a role in virus attachment.</a> J Virol. 84, 6769-6781 (2010).</li><li>Harmon, M. W., Rota, P. A., Walls, H. H., Kendal, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+response+in+humans+to+influenza+virus+type+B+host-cell-derived+variants+after+vaccination+with+standard+(egg-derived)+vaccine+or+natural+infection.">Antibody response in humans to influenza virus type B host-cell-derived variants after vaccination with standard (egg-derived) vaccine or natural infection.</a> J Clin Microbiol. 26, 333-337 (1988).</li><li>Rowe, T., Abernathy, R. A., Hu-Primmer, J., Thompson, W. W., Lu, X., Lim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+antibody+to+avian+influenza+A+(H5N1)+virus+in+human+serum+by+using+a+combination+of+serologic+assays.">Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays.</a> J Clin Microbiol.37. 37, 937-943 (1999).</li><li>Okuno, Y., Tanaka, K., Baba, K., Maeda, A., Kunita, N., Ueda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+focus+reduction+neutralization+test+of+influenza+A+and+B+viruses+in+microtiter+system.">Rapid focus reduction neutralization test of influenza A and B viruses in microtiter system.</a> J Clin Microbiol. 28, 1308-1313 (1990).</li><li>Bachmann, M. F., Ecabert, B., Kopf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus:+a+novel+method+to+assess+viral+and+neutralizing+antibody+titers+in+vitro.">Influenza virus: a novel method to assess viral and neutralizing antibody titers in vitro.</a> J Immunol Methods. 225, 105-111 (1999).</li><li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays.">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virol J. 3, 63-70 (2006).</li><li>Comley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+screening+-+Emerging+importance+of+novel+reagents/probes+and+pathway+analysis.">High content screening - Emerging importance of novel reagents/probes and pathway analysis.</a> Drug Discovery World Summer 2005. , 31-53 (2005).</li><li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Carr, J., Roberts, N. A., Klenk, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+alpha-2,+6-sialyltransferase+in+MDCK+cells+increases+influenza+virus+sensitivity+to+neuraminidase+inhibitors.">Overexpression of the alpha-2, 6-sialyltransferase in MDCK cells increases influenza virus sensitivity to neuraminidase inhibitors.</a> J. Virol. 77, 8418-8425 (2003).</li><li>Sullivan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+virus+plaque+quantitation+using+a+flatbed+scanner.">High throughput virus plaque quantitation using a flatbed scanner.</a> J Virol Methods. 179, 81-89 (2012).</li><li>Lin, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+micro-neutralization+assay+and+its+application+in+antigenic+characterization+of+influenza+viruses.">Optimization of a micro-neutralization assay and its application in antigenic characterization of influenza viruses.</a> Influenza Other Respir Viruses. 9, 331-340 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

In deze studie beschrijven we een imaging-gebaseerde MN test de werkelijke antigene relatie tussen virussen kwantificeren. In vergelijking met andere plaque-reductie assays, benadrukt de methode het meten van de ICP van een heel goed, het waarborgen van de volledige dekking van de infectieuze bevolking. De onafhankelijkheid van plaquevorming vergroot tevens de toepassing van de bepaling voor virussen die hoofdzakelijk onzichtbaar kleine plaques kan vormen of die slechts beheerder eencellige infectie. Aldus was de zuiverheid kan onderzoeken vermenigvuldigen en de effecten van een groter aantal antilichamen dan HI, en het helpt om uitgebreider weerspiegelen de antigene overeenkomsten of verschillen tussen virussen 12. Wanneer bijvoorbeeld oseltamivircarboxylaat is opgenomen, de MN test wordt minder beïnvloed door NA-afhankelijke binding, die de antigene verschillen nauwkeuriger. Tijdens de ontwikkeling van de test werden grote inspanningen geleverd om het experiment consistentie, snelheid en detectie verbeterengevoeligheid, onder meer door het beheersen ingang virussen door middel gekwantificeerd titratie, beeldvorming in high throughput met een flatbed scanner, en implementeren van een gebruiksvriendelijke data processing platform. De resultaten zijn over het algemeen in overeenstemming met geweest en bevestigde die van HI. Met name de resultaten bleek ook antigene verschillen tussen antigene drift varianten recente type A en B vaccin virussen en antigene veranderingen veroorzaakt door kweek geselecteerde of incidenteel veranderingen, zoals G155E vervanging HA1 bepaalde A (H1N1) pdm09 virussen 12. Het protocol paste het virustype of subtype met de selectie van cellijnen die de sterkste infectie, die de beeldvorming sterk verbeterd signaal gaf. Experimentele variant werd glad gemaakt met het ontwerp van duplicaten dat evenwicht met het aantal geteste antisera. Onzekerheden komen ook de beeldkwaliteit, die voornamelijk wordt beïnvloed door de beeldvormingsinrichting. Een fatsoenlijke kleur flatbed scanner kan Significantly verbetering van het imago contrast en het lawaai te verminderen. De hoeveelheid toegevoegd virus in de neutralisatie, kwantitatief worden bepaald tevoren in de overeenkomstige titratie terwijl de virussen niettemin van hetzelfde te behouden. Tijdens neutralisatie, het antiserum reactie op een infectie wordt genormaliseerd tegen het verschil tussen de referentie-virus (VC) en het achtergrondniveau (CC). Nauwkeurige metingen van VC en CC zijn essentieel voor een neutralisatie experiment. Meer duplicaten aanbevolen (acht duplo werden in de Representatieve resultaten). Tenslotte begrijpen van de software is essentieel voor het succes van een experiment. De software is getest op routine virus karakterisering van de WHO Influenza Centrum, het UK voor meer dan twee jaar. Gedetailleerde instructies voor het omgaan met verschillende situaties is voorzien in het aanvullend S1. Dit MN test is geschikt voor toepassingen waar de monsters beslaan een extremely groot gezichtsveld, maar vereisen slechts een matige beeldvorming resolutie. De lage kosten en eenvoudige setup maken het systeem gemakkelijk beschikbaar voor de meeste virologie laboratoria. De variatie in de metingen van hetzelfde monster minder dan 3%, wat ruwweg de onzekerheid die tijdens het scannen 11 definieert. Dergelijke reproduceerbaarheid volstaat vele virologische studies en kan verder worden gereduceerd door het middelen beelden van meerdere scans. Samenvattend toont dit onderzoek aan een robuust MN test die routinematig worden gebruikt in antigene studie en HI data in gedetailleerde analyses van momenteel circulerende influenzavirussen, met name voor de halfjaarlijkse selectie van virussen voor opname in humane influenza vaccins.

Micro-neutralisatie (MN) assays worden in virologie voor de kwantificering van neutraliserende antilichamen en antivirale activiteiten. In plaats van hemagglutinatie inhibitie (HI) assays, MN assays kunnen niet- antigenisch effecten beïnvloed door de veranderingen van receptor-bindende affiniteit van influenzavirussen, die kunnen bemoeilijken de interpretatie van resultaten HI 1,2,3 overwinnen. Tot voor kort waren de meeste MN assays gebaseerd op cytopathische effecten (CPE) of enzymgekoppelde immunosorbent assays (ELISA) 4,5. MN assays op basis van focus en plaquereductie werden ontwikkeld in 1990 6,7,8. Plaquevermindering assays vertrouwen op te tellen zichtbaar plaques om het besmettingsgevaar te kwantificeren. Echter, visuele telt alleen betrekking grote plaques die oplosbaar door menselijke ogen, hoewel de meeste plaques zijn klein en onzichtbaar voor vele huidige circulerende virussen. Dit onvolledige dekking kan aanzienlijke verschillen veroorzaken tussen examinatoren en tussen de experimenten, wat leidt tot incomparable resultaten. Het is ook mogelijk de werkwijze te gebruiken bij sommige virussen vertonen abortieve infectie van enkele cellen of zeer kleine plaques. De arme telresolutie kan worden verbeterd door de introductie van een imaging-gebaseerd protocol. Met de vooruitgang in technologie, optische microscopie en high-throughput kan goed-plaat lezers accurate manier om de geïnfecteerde cellen 9 tellen bieden. Onder een trans-verlichte microscoop, kunnen geïnfecteerde cellen gelabeld met bepaalde markers worden gevisualiseerd door de absorptie of fluorescentie contrast in sub-cellulaire resolutie. Een monster kan vervolgens worden geanalyseerd op een computerscherm. Helaas, vanwege de beperking van het gezichtsveld, meer dan honderd beeldvensters dienen een enkel putje bedekken. Het analyseren van een plaat met 96 wells zou de beeldvorming en de verwerking van ongeveer tienduizend beelden nodig. Dergelijke moeizaam proces is tijdrovend en duur, en de resolutie is opgedaan general onnodig voor routine karakterisering van virale infecties. Laboratoria met een beperkt budget kan vinden dat de aanpak rond een flatbedscanner biedt een kosteneffectieve, high-throughput alternatief. In dit artikel beschrijven we een verbeterd plaquereductie MN test die geschikt is voor het karakteriseren van antigene een groot aantal virussen en voor het kwantitatief meten antivirale activiteiten en neutralisatie antilichamen. De test heeft een aantal voordelen: ten eerste een imaging-gebaseerde test die kan virusinfecties maatregel op cellulair niveau, ongeacht de plaque grootte. Het tellen van de totale geïnfecteerde celpopulatie (ICP) in een put verhoogt de detectiegevoeligheid, waardoor het mogelijk om de virussen te karakteriseren met lage infectiviteit. Ten tweede wordt een meer accurate kwantitatieve titratie vóór neutralisatie geïntroduceerd om de hoeveelheid toegevoegd virus te bepalen. De kwantitatieve ingang virus vermindert de variatie tussen de verschillende experimenten en maakt de resultaten beter vergelijkbaar tussen laboratoria. Ten derde neutralisatie titers kunnen rechtstreeks door het analyseren beelden, waardoor de kwantificering snelle en gebruikersvriendelijke bepaald. Tenslotte het protocol levert een rendabele hoge-doorvoer alternatief met de vereiste resolutie en nauwkeurigheid. De kwantificering is gebaseerd op een flatbed scanner en vrije data processing software. De hele opzet heeft een kleine footprint en is inzetbaar in de meeste laboratoria. Het protocol in dit document bestaat uit vier belangrijke stappen, met inbegrip van virus titratie titratie kwantificering, virus neutraliseren, en neutralisatie kwantificering. Virustitratie is samengesteld experiment dat bepaalt de hoeveelheid invoer virussen voor gebruik in neutraliseren. Tijdens een titratie, een aantal virale concentraties worden toegepast op de celmonolagen in 96-wells plaat. De geïnfecteerde cellen worden vervolgens gekwantificeerd in deel 2. De viral Dilutie die 20% -85% ICP produceert op zijn beurt toegepast als input virussen de overeenkomstige neutralisatie in sectie 3. De titers van de neutralisatie protocol worden gekwantificeerd met behulp van sectie 4. Experimenten die volgden de bovenstaande protocollen worden gepresenteerd in de Representatieve resultaten. De assay is uitgebreid getest gedurende de afgelopen twee jaar met de meeste van de huidige circulerende influenzavirussen zoals A (H1N1) pdm09, A (H3N2) en B virussen. De resultaten van het influenzavirus karakterisering werden opgenomen in de verslagen van de WHO overleg dat de aanbevelingen over griepvaccins voor gebruik in het zuidelijk halfrond in 2016 en het noordelijk halfrond in 2016-2017 gaf.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1115">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">VGM</td>
			<td style="width:172px;">Sigma</td>
			<td style="width:383px;">D6429, P0781</td>
			<td style="width:383px;">500 ml DMEM+5 ml Pen/Strepb</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:177px;">PBS A</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:383px;"></td>
			<td style="width:383px;">Nature pH Phosphate-buffered saline: NaCl -10 gm, KCl - 0.25 gm, Na2HPO4 - 1.437 gm, KH2PO4 &#8211; 0.25 .gm, and Dist. Water &#8211; 1 L.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:177px;">Avicell</td>
			<td style="width:172px;">FMC</td>
			<td style="width:383px;">RC-581F</td>
			<td style="width:383px;">2.4g in 100ml distilled water dissolved by agitation on a magnetic stirrer for 1 hr. Sterilize by autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">2XDMEM</td>
			<td style="width:172px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:383px;">21935-028</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">Trypsin</td>
			<td style="width:172px;">Sigma</td>
			<td style="width:383px;">T1426</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:177px;">Overlay (10ml/plate):</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:383px;"></td>
			<td style="width:383px;">5ml 2X DMEM, Trypsin 2&#956;g/ml final conccentration,Avicell&#160; - 5ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">Triton X- 100e</td>
			<td style="width:172px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:383px;">T8787</td>
			<td style="width:383px;">Permeabilisation buffer: 0.2% in PBS A (v/v)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">Tween 80</td>
			<td style="width:172px;">Sigma</td>
			<td style="width:383px;">P5188</td>
			<td style="width:383px;">&#160;Wash Buffer: 0.05% Tween &#8211; 80 in PBS A (v/v)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">Horse serum</td>
			<td style="width:172px;">PAA Labs Ltd</td>
			<td style="width:383px;">B15-021</td>
			<td style="width:383px;">ELISA Buffer: 10%&#160; in PBS A (v/v) + 0.1% Tween 80</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">Mouse MAb against influenza type A</td>
			<td style="width:172px;">Biorad</td>
			<td style="width:383px;">MCA 400</td>
			<td style="width:383px;">1st Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">Goat anti-mouse IgG (H+L) HRP conjugate</td>
			<td style="width:172px;">Biorad</td>
			<td style="width:383px;">172-1011</td>
			<td style="width:383px;">2nd Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">True Blu peroxidase substrate</td>
			<td style="width:172px;">KPL&#160;</td>
			<td style="width:383px;">50-78-02</td>
			<td style="width:383px;">Substrate:&#160; True blue +0.03% H2O2g (1:1000 of 30% solution)</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">96-well flat-bottom microtitre plates</td>
			<td style="width:172px;">Costar&#160;</td>
			<td style="width:383px;">3596</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:177px;">8 channel multiwall-plate washer and manifold</td>
			<td style="width:172px;">Sigma</td>
			<td style="width:383px;">M2656</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="104" style="height:104px;width:177px;">Perfection Plate Scanner</td>
			<td style="width:172px;">Epson</td>
			<td style="width:383px;">V750 Pro</td>
			<td style="width:383px;"><a href="http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&amp;infoType=Downloads.">The imaging software can be downloaded freely from http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&#38;infoType=Downloads.</a></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">Software operational environment: LabVIEW</td>
			<td style="width:172px;">National Instruments Corporation</td>
			<td style="width:383px;">Window based with NI Vision builder</td>
			<td style="width:383px;">Version: LabVIEW2012 or above</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of a quantitative micro-neutralization assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

Naar aanleiding van de bovenstaande procedures, presenteren we enkele resultaten uit de recente antigene karakterisering experimenten. De titratie opstelling is ontworpen om acht ingang virussen te onderzoeken, met dubbele duplicaten voor elke verdunning. De virale verdunningen werden getest tussen 1,0 x 10 -1 en 1,0 x 1,0 -6 om de variaties tussen de virussen dekken. De test virussen waren van het H3N2 subtype, waaronder A / Kameroen / 15V-3538/2015, A / Vladivostok / 36/2015, A / Moskou / 103/2015, A / Tomsk / 5/2015 / A / Moskou / 101 / 2015, A / Moskou / 100/2015, A / Moskou / 133/2015 en A / Bratislava / 437/2015. De titratie resultaten zijn weergegeven in figuur 5. Figuur 5d toont de daling van ISP met de toename van virusverdunning. De curven werden genormaliseerd tegen de ISP van dezelfde virussen die infecties bij alle cellen leverden in een put 12 (gedefinieerd als ICP verzadiging). Als de ICP niet verzadiging heeft bereikt met de highest virus concentratie werd de ICP gemiddelde uit overeenkomstige duplicaten in plaats daarvan gebruikt (A / Moskou / 103/2015 in figuur 5d). Het virus verdunningen die 30% verzadiging van ICP geproduceerd werden gekozen als ingang virusverdunning voor neutralisatie (tabel 3). Neutralisatie gericht op één ingang virus tegen vijf antisera, met dubbele duplicaten op elk bord. De referentie-virus aangetoond is H3N2 A / Stockholm / 63/2015. De vijf antisera zijn A / HK 4801/14 Egg F12 / 15, A / HK 7295/14 MDCK F02 / 15, A / Zuid-Afrika R2665 / 15 SIAT F50 / 15, A / Zwitserse 9715923/13 SIAT NIBF F18 / 15, en A / Nederlands 525/14 SIAT F23 / 15. De neutralisatie resultaten zijn weergegeven in figuur 6. Figuur 6d toont de infectie voortgang met de toename van serum verdunning. De genormaliseerde positieve populatie op de vertikale as de verhouding tussen ISP uit de overeenkomstige antisera respons tegen de gemiddelde ICPvan de referentie-virus 12. De achtergrond van ICP ongeïnfecteerde cellen werd afgetrokken controles tijdens de normalisatie. De neutralisatie titers werden bepaald als de reciproque van het antiserum verdunningen overeenkomt met 50% reductie ICP (Tabel 4). Lineaire interpolatie werd gebruikt om titers die tussen twee aangrenzende serumverdunningen schatten. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig1.jpg" /> Figuur 1: Voorbeeld van een goed plaat opstelling in een virus titratie experiment. Testvirussen worden toegewezen aan afzonderlijke lijnen (A tot H). Kolommen zijn voor verschillende virale verdunningen (1 tot 12). Twee kolommen werden als duplo voor elke virale verdunning. Schaal bar = 10 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> Figuur 2: Schema van een monster scansysteem. (A) Een 96-well plaat op de afbeeldingspositie van een flatbed scanner (gepubliceerd van referentie 11 met toestemming van Elsevier BV), en (b) de afmetingen van de positiegrens L-vorm getoond in (a). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig3.jpg" /> Figuur 3: Desktop diagram van de &quot;Wellplate Reader&quot; kwantificering software. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> </p&gt; <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig4.jpg" /> Figuur 4: Voorbeeld van een goed plaat opstelling in een neutralisatie experiment. Elk antiserum wordt toegewezen aan twee kolommen met duplicaten (1 tot 10). Rijen zijn voor verschillende serumverdunningen (A tot H). Het virus controle neemt Column 11, met acht duplicaten (A11 tot en met H11). De cel control is in kolom 12, met acht duplicaten (A12 tot H12). Schaal bar = 10 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 5" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig5.jpg" /> Figuur 5: Resultaten van een titratie experiment. (A) De goed-plaat setup, (b) een goed-plaat afbeelding gescand, (c) illustratiede kleur gecodeerd, gekwantificeerd, met virus geïnfecteerde celpopulatie en (d) genormaliseerd met virus geïnfecteerde celpopulaties tegen virusverdunningen. 30% ICP werd gebruikt als criterium. De fout bars in (d) zijn standaarddeviaties (SD) van het monster duplicaties (± 1 SD). Schaalbalken in (b) en (c) = 10 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 6" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig6.jpg" /> Figuur 6: Resultaten van een neutralisatie experiment. (A) De goed-plaat setup, (b) het goed plaat, (c) illustratie van de gekwantificeerd, virus-geïnfecteerde cel populatie, en (d) genormaliseerd-virus geïnfecteerde cel bevolking te beschermen tegen de serumverdunning gescand. De ingang virus (VC) is A / Stockholm / 63/2015. 50% ICP werd gebruikt om de titer te berekenen. De fout bars in (d) zijn standaarddeviaties (SD) van het monster duplicaties (± 1 SD). Schaalbalken in (b) en (c) = 10 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> Aanvullende S1: <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/Supplementary_S1.pdf" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3"> typische verdunning </td></tr><tr><td></td><td> MDCK cellen </td><td> MDCK-cellen SIAT1 </td></tr><tr><td> 2 dagen </td><td> 1: 5 (1 + 4) </td><td> 01:10 (1 + 9) </td></tr><tr><td> 3 dagen </td&gt; <td> 01:10 (1 + 9) </td><td> 01:20 (1 + 19) </td></tr><tr><td colspan="3"> Typische aantal cellen per ml </td></tr><tr><td></td><td> MDCK cellen </td><td> MDCK-cellen SIAT1 </td></tr><tr><td> 2 dagen </td><td> 2 x 10 5 </td><td> 1 x 10 5 </td></tr><tr><td> 3 dagen </td><td> 1 x 10 5 </td><td> 5 x 10 4 </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Typische verdunningen op een subcultuur die confluente flessen van MDCK of MDCK-SIAT1 cellen. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> mode </td><td> professionele modus </td></tr><tr><td> type document </td><td> Film (met Area Guide Film) </td></tr><tr><td> Automatische belichting </td><td> Foto </td></tr><tr><td> Imleeftijd Type </td><td> 24-bit kleur </td></tr><tr><td> Resolutie </td><td> 1200 dpi </td></tr><tr><td> Opgeslagen afbeelding Format </td><td> TIFF </td></tr></tbody></table> Tabel 2: Typische opstelling van een flatbed scanner. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Rij </td><td> Virus </td><td> Aanbevolen verdunning </td></tr><tr><td> EEN </td><td> A / Cameron / 15V-3538/2016 </td><td> 1,0 x 10 -2 </td></tr><tr><td> B </td><td> A / Vladivostok / 36/2015 </td><td> 1,0 x 10 -3 </td></tr><tr><td> C </td><td> A / Moskou / 103/2015 </td><td> 1,1 x 10 -1 </td></tr><tr><td> D </td><td> A / Tomsk / 5/2015 </td><td> 5.9 x 10 -1 </td></tr><tr><td> E </td><td> A / Moskou / 101/2015 </td><td> 8.3 x 10 -1 </td></tr><tr><td> F </td><td> A / Moskou / 100/2015 </td><td> 1,4 x 10 -2 </td></tr><tr><td> G </td><td> A / Moskou / 133/2015 </td><td> 1,3 x 10 -2 </td></tr><tr><td> H </td><td> A / Bratislava / 437/2015 </td><td> 1,3 x 10 -4 </td></tr></tbody></table> Tabel 3: Virale verdunningen berekend uit een populatie van 30% ICP. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Kolom </td><td> antisera </td><td> Aanbevolen titer </td></tr><tr><td> 1-2 </td><td> A / HK4801 / 2014 </td><td> 110 </td></tr><tr><td> 3-4 </td><td> A / HK7295 / 2014 </td><td> 213,3 </td></tr><tr><td&gt; 5-6 </td><td> A / Zuid-Afrika / R2665 / 2015 </td><td> 2155,8 </td></tr><tr><td> 7-8 </td><td> A / Zwitserland / 9715293/2013 </td><td> 89.4 </td></tr><tr><td> 9-10 </td><td> A / Nederland / 525/2014 </td><td> 78.6 </td></tr></tbody></table> Tabel 4: Titers bij 50% van ICP A / Stockholm / 63/2015 tegen antisera.

Watch this Scientific Journal Video about Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay at JoVE.com

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

Deze studie beschrijft een -Imaging gebaseerde micro-neutralisatietest de antigene relaties tussen virussen te analyseren. Het protocol maakt gebruik van een flatbed scanner en heeft vier stappen, waaronder titratie titratie kwantificering, neutralisatie, en neutralisatie kwantificering. De test werkt goed met de huidige circulerende influenza A (H1N1) pdm09, A (H3N2) en B-virussen.

Optimalisatie van een kwantitatieve micro-neutralisatie assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Microtiter Dish biofilm vorming Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Intravitale Microscopie van de milt: Kwantitatieve Analyse van Parasite Mobiliteit en Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Een kwantitatieve evaluatie van celmigratie door de Phagokinetic Track Motiliteit Assay

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Kwantitatieve meting van de immuunrespons en Sleep in<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Quantitative High-throughput Eencellige cytotoxiciteit T cellen

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an ...

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

Kwantitatieve beoordeling van Human migratie van neutrofielen door een Gekweekte blaas epitheel

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Oprichting en Optimalisatie van een High Throughput Setup om te studeren<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; En<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infectie als een model voor Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

High-throughput Kwantitatieve real-time RT-PCR assay voor het bepalen van expressieprofielen van de typen I en III interferon subtypen

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Kwalitatieve en Kwantitatieve Testen voor detectie en karakterisering van proteïne Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...