Name: optimization of a quantitative micro-neutralization assay
Uploaded: 2016-12-14T15:00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay at JoVE.com

The authors thank Dr. M. Matrosovich for providing the parent MDCK and MDCK-SIAT1 cell lines and Roche Pharmaceuticals for supplying the oseltamivir carboxylate.We also appreciate Dr. Anne Weston for valuable suggestions on the manuscript. This study was dependent upon the valued collaboration of the WHO National Influenza Centres and the WHO CCs within the WHO GISRS, who provided the influenza viruses used. This work was funded by the Medical Research Council through Programme U117512723.

MERK: biosikkerhetsnivå (BSL) for følgende protokollen er BSL 2 for sesongens influensavirus og BSL 3+ for potensielle pandemisk influensa virus. Viral titrering er nødvendig på forhånd av en nøytralisering eksperiment for å bestemme den virale konsentrasjon av viruskontrollen (VC). 1. Virus Titrering MERK: Avhengig av antall virus og antall duplikater, kan et godt plate settes opp med følgende fleksibilitet: (1) Den viral fortynning kan arrangeres sammen enten radene eller kolonnene (figur 1). Hvert virus skal oppta en egen rad / kolonne. (2) viral fortynning tilveksten er fleksibel, men det bør starte med den høyeste viral konsentrasjon øverst i venstre hjørne. (3) Det er ingen begrensning på antall duplikater. MERK: Madin Darby canine nyre (MDCK) og MDCK-SIAT1 (SIAT) celler ble vennlig levert av Dr. M. Matrosovich, Marburg, Germange 10. SIAT celler er MDCK-celler stabilt transfektert med den humane CMP-N-acetylneuraminat: p-galaktosid α-2,6-sialyltransferase-gen for ekspresjon av sialinsyre (SA) α2-6Gal-terminerte oligosakkarider. <ol><li> Delmengde tilstrekkelig MDCK-celler eller MDCK-celler SIAT 8 til 96-brønns plater (200 ul / brønn). Inkuber cellene ved 37 ° C med 5% CO 2 for 2 eller 3 dager å nå samløpet. Forplante cellene i DMEM supplert med 10% varme-inaktivert føtalt kalveserum (FCS) og antibiotika (100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin). Inkuber SIAT cellene ved 37 ° C med 5% CO2 og 1 mg / ml G418 sulfat. MERK: Fortynningsfaktoren er avhengig av erfaring og den anvendte cellelinjen. Den celle monolag skal sammenflytende (dvs. ingen celleveggen eller synlig disposisjon for MDCK-celler og en tettpakket layout for MDCK-celler SIAT1) på tidspunktet virus inokulasjonen. Eksempler på fortynninger på grunnlag avsubkulturen av konfluente kolber av MDCK eller MDCK-celler SIAT1 er gitt i tabell 1. </li><li> Vask cellene 3 ganger med 200 ul virusvekstmedium (VGM) per brønn. Steriliser multiwall platevasker med 70% EtOH i 30 min, og deretter skylle det i steril fosfatbufret saltløsning (PBS) eller VGM før vask. </li><li> Aspirer VGM og umiddelbart legge 50 ul av VGM til hver brønn. </li><li> Legg 900 ul av VGM til hver av 6 sterile rør (eller færre, avhengig av antall testvirus og duplikater). Pipetter 100 mL av virus i det første røret, bland godt, og serielt fortynne, endre tipsene mellom hver fortynning. Gjenta for hvert virus som skal titreres. MERK: Dette vil gi virus fortynninger av 10 -1 til 10 -6. </li><li> Tilsett 50 pl av hver fortynning virus, med start ved den høyeste fortynning (1 x 10 -5 i figur 1), for å dublerte brønner (Kolonnene 9 og 10 i figur 1) av en 96-brønns plate. </li><li> Sett platen ved 37 ° C i 2-3 timer for å la viruset for å infisere cellene. MERK: En 2 til 3 timers inkubering er nødvendig for å sikre at virus i inokulumet har nok tid til å nå den monolaget. </li><li> Klargjør overlay (10 ml / plate) MERK: legget består av 5 ml 2x DMEM, Trypsin (2 ug / ml endelig konsentrasjon), 20 ul av 1 mg / ml lager, og 5 ml av cellulose bomullslinters (se Materialer List). </li><li> Fjern inokulum. </li><li> Legg overlegget (200 ul til hver brønn). Inkuber over natten ved 37 ° C, uforstyrret. MERK: Viruset vordende finner sted etter ca. 4 timer, slik at det er viktig at platen ikke blir forstyrret etter dette tidspunktet. </li><li> Aspirer overlegg fra brønnene. </li><li> Legg iskald 4% paraformaldehyde i PBS A (200 ul / brønn). Plassere dem ved 4 ° C i 30 minutter, eller ved romtemperatur i 20 min. MERK: PBS A er naturlig-pH fosfatbufret saltoppløsning med 10 gof NaCl, 0,25 g KCl, 1,437 g Na2 HPO 4, 0,25 g KH 2PO 4, og 1 liter destillert vann (se Materialer List). MERK: Paraformaldehyde er skadelig ved innånding og kan forårsake brannskader ved svelging. Det er også begrenset bevis for kreft, og det kan føre til sensibilisering etter hudkontakt. </li><li> Aspirer paraformaldehyd og vaskes platene to ganger med PBS A (200 ul / brønn). </li><li> Oppbevar platene i PBS A ved 4 ° C for fremtidig bruk, eller fortsette med de neste trinnene. </li><li> Legg permeabiliseringsbuffer (100 ul / brønn). La den stå i romtemperatur i 30 min. </li><li> Vask platen to ganger med PBS A (200 ul / brønn). </li><li> Tilsett 50 ul av det første antistoffet, mus monoklonalt antistoff mot influensa type A (1: 1000 i ELISA-buffer), per brønn. Inkuber ved romtemperatur i 1 time (eller 4 ° C over natten), med risting. </li><li> Vask det 3 ganger i 100 ul vaskebuffer (0,05% Tween 80 i PBS A, v / v) p-er godt. Inkuber ved romtemperatur i 5 min mellom hver vask. Alternativt vaske det 3 ganger uten inkubasjon ved hjelp av 300 mL per brønn. </li><li> Tilsett 50 ul av det andre antistoff, geit-anti-mus IgG (H + L) HRP-konjugat (1: 1000 i ELISA-buffer), per brønn. Inkuber ved romtemperatur i 1 time, med risting. </li><li> Vask den 3 ganger som beskrevet i trinn 1,17. </li><li> Tilsett substrat (50 ul / brønn). Inkuber ved romtemperatur i 30 minutter eller inntil utviklingen av en blå farge er klart synlig. </li><li> For å stanse reaksjonen, platen vaskes to ganger med 200 pl destillert vann per brønn, inkubere ved romtemperatur i 2 -3 minutter mellom hver vask. </li><li> Air-tørke plate og lagre den på et mørkt sted (f.eks, pakk den inn i aluminiumsfolie). </li></ol> 2. Titrering Kvantitering <ol><li> Plasser et godt plate i skanneområdet til en planskanner, som vist i figur 2a. Bruk L-form stilling grensesikre en optimal og repeterbare bildebehandling plassering. MERK: Det er mulig å avbilde to brønnplater i en skanning. </li><li> Skanne et bilde. MERK: Innstillingene er vist i tabell 2. </li><li> Kjør &quot;Wellplate Reader&quot; programvare for å beregne nødvendig virus konsentrasjon (figur 3). <ol><li> Klikk på &quot;Last bilde&quot; for å laste et bilde. Skyv den røde linjen i histogrammet av &quot;Global terskel&quot; for å justere prøvetaking terskel. Klikk på &quot;Oppdater&quot; -knappen for å undersøke effekten på bildet. </li><li> Kryss av &quot;Beregn Nøytralisering / Titrering&quot; boksen. Klikk på &quot;Sampling&quot; -knappen for å kvantifisere ICP. Klikk på &quot;Lagre&quot; -knappen for å lagre prøvetaking resultater når du blir bedt. MERK: Etter at datainnsamlingen, vises et nytt vindu som heter &quot;Nøytralisering og tiltrering Beregning&quot; automatisk hvis &quot;Beregn Nøytralisering / titrering&quot; boksen er krysset av. </li><li>Load eller innspill definisjon kartet godt plate. Angi terskel (f.eks 30%) i &quot;Titrering: Optimal Virus Befolkning (%)&quot;. Velg &quot;Titrering Process&quot; for å beregne titrering resultater. Sjekk titrering resultater. Klikk på &quot;Save &amp; Close&quot; -knappen for å lagre titrering resultater. MERK: Se Utfyllende S1 for mer detaljert instruksjon på programvaren. En kopi av skreddersydd programvare er tilgjengelig på forespørsel. MERK: Vanligvis den beste virus fortynning for plakk-reduksjon metoden gir rundt 50% (20-85%) ICP av totale celler i hver brønn 11. </li></ol></li></ol> 3. Virus Nøytralisering MERK: Beregn det antall plater som kreves for nøytralisering analysen. Hver plate har plass til ett virus og en rekke antisera. MERK: Avhengig av antall antisera og antall duplikater, et godt plate kan settes opp med the følgende fleksibilitet: (1) Den serumfortynning kan anordnes langs hver rad eller kolonne (figur 4). Hver serum bør oppta en egen rad eller kolonne. (2) tilveksten av serum fortynning er fleksibel, men det bør starte med den høyeste serumkonsentrasjon øverst i venstre hjørne av en plate. (3) Antallet av dubletter balanserer antall antisera. Flere duplikater kan bidra til å jevne ut eksperimentelle variasjoner. (4) Antallet VC og antall cellestyringen (CC) duplikater er fleksible, men de bør også være i separate rader eller kolonner. Det er forventet at antallet av VC dubletter er betydelig større enn den for antisera. <ol><li> Forbered cellemonolaget, som i trinn 1,1-1,3, 2 eller 3 dager i forveien. </li><li> Tilsett 50 mL av VGM til hver brønn på platen. </li><li> Bruk Kolonner 11 og 12 for VC og CC, henholdsvis. Tilsett 50 ul aliquoter av 01:20 reseptor-ødelegge enzymet (RDE) -behandlet serum til den første raden (A) av Columns 1-10. NB: For hvert virus og serum kombinasjon, blir analysen utført i duplikat, slik at en plate kan for eksempel inneholde en virus testet mot fem antisera. </li><li> Utføre to-gangers seriefortynninger ved å overføre 50 ul fra rad A til rad H (kolonner 1-10 i figur 4) og kasting av 50 ul fra Row H. </li><li> Tilsett 50 mL av fortynningsmiddel til hver brønn av CC-kolonne (kolonne 12 i figur 4). </li><li> Tilsett 50 ul av viruset til hver brønn på platen, med unntak av CC kolonne (Kolonner 1-11, Rader AH i figur 4). </li><li> Inkuber det ved 37 ° C i 2-3 timer. Fjern inokulum. Tilsett legget (200 pl) til hver brønn. Inkuber det over natten ved 37 ° C, uforstyrret. Fest og beis platene som for virus titrering (trinn 01.11 til 01.22). </li></ol> 4. Nøytralisering Kvantifisering <ol><li> Plasser et godt plate i skanneområdet til en planskanner, som vist i Figure 2a. Bruk L-form posisjon grensen for å sikre en optimal og repeterbare bildebehandling plassering. MERK: Det er mulig å avbilde to brønnplater i en skanning. </li><li> Skanne plate, som beskrevet i trinn 2.2. </li><li> Kjør &quot;Wellplate Reader&quot; programvare for å beregne de nødvendige viral titer (Figur 3, trinn 2.3). <ol><li> Klikk på &quot;Last bilde&quot; for å laste et bilde. Skyv den røde linjen i &quot;global terskel&quot; for å justere prøvetaking terskel. Klikk på &quot;Oppdater&quot; -knappen for å undersøke effekten. </li><li> Kryss av &quot;Beregn Nøytralisering / Titrering&quot; boksen. Klikk på &quot;Sampling&quot; -knappen for å kvantifisere ICP. Klikk på &quot;Lagre&quot; -knappen for å lagre prøvetaking resultater når du blir bedt. MERK: Etter at datainnsamlingen, vises et nytt vindu som heter &quot;Nøytralisering og tiltrering Beregning&quot; automatisk hvis &quot;Beregn Nøytralisering / titrering&quot; boksen er krysset av. </li><li> Load eller innspill godt psent kartet. Angi terskel (f.eks 50%) i &quot;Nøytralisering. Infeksjon Fradrag (%)&quot; </li><li> Velg &quot;Nøytralisering Process&quot; for å beregne titere. Sjekk titere og klikk på &quot;Lagre og lukk&quot; -knappen for å lagre nøytralisering resultater. MERK: Nøytralisering blir rapportert som den resiproke verdi av den høyeste fortynning av serum med den forhåndsdefinerte ICP reduksjon (for eksempel 50% eller 80%) mot VC (gjennomsnittet av kolonne 11 i figur 4). En 50% ICP reduksjon ble brukt i Representative resultater. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Walker, D. L., Horsfall, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+identity+in+neutralizing+and+hemagglutination-inhibiting+antibodies+against+influenza+viruses.">Lack of identity in neutralizing and hemagglutination-inhibiting antibodies against influenza viruses.</a> J Exp Med. 91, 65-86 (1950).</li><li>Medeiros, R., Escriou, N., Naffakh, N., Manuguerra, J. C., van der Werf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemagglutinin+residues+of+recent+human+A(H3N2)+influenza+viruses+that+contribute+to+the+inability+to+agglutinate+chicken+erythrocytes.">Hemagglutinin residues of recent human A(H3N2) influenza viruses that contribute to the inability to agglutinate chicken erythrocytes.</a> Virology. 289, 74-85 (2001).</li><li>Lin, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuraminidase+receptor+binding+variants+of+human+influenza+A(H3N2)+viruses+resulting+from+substitution+of+aspartic+acid+151+in+the+catalytic+site:+a+role+in+virus+attachment.">Neuraminidase receptor binding variants of human influenza A(H3N2) viruses resulting from substitution of aspartic acid 151 in the catalytic site: a role in virus attachment.</a> J Virol. 84, 6769-6781 (2010).</li><li>Harmon, M. W., Rota, P. A., Walls, H. H., Kendal, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+response+in+humans+to+influenza+virus+type+B+host-cell-derived+variants+after+vaccination+with+standard+(egg-derived)+vaccine+or+natural+infection.">Antibody response in humans to influenza virus type B host-cell-derived variants after vaccination with standard (egg-derived) vaccine or natural infection.</a> J Clin Microbiol. 26, 333-337 (1988).</li><li>Rowe, T., Abernathy, R. A., Hu-Primmer, J., Thompson, W. W., Lu, X., Lim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+antibody+to+avian+influenza+A+(H5N1)+virus+in+human+serum+by+using+a+combination+of+serologic+assays.">Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays.</a> J Clin Microbiol.37. 37, 937-943 (1999).</li><li>Okuno, Y., Tanaka, K., Baba, K., Maeda, A., Kunita, N., Ueda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+focus+reduction+neutralization+test+of+influenza+A+and+B+viruses+in+microtiter+system.">Rapid focus reduction neutralization test of influenza A and B viruses in microtiter system.</a> J Clin Microbiol. 28, 1308-1313 (1990).</li><li>Bachmann, M. F., Ecabert, B., Kopf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus:+a+novel+method+to+assess+viral+and+neutralizing+antibody+titers+in+vitro.">Influenza virus: a novel method to assess viral and neutralizing antibody titers in vitro.</a> J Immunol Methods. 225, 105-111 (1999).</li><li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays.">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virol J. 3, 63-70 (2006).</li><li>Comley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+screening+-+Emerging+importance+of+novel+reagents/probes+and+pathway+analysis.">High content screening - Emerging importance of novel reagents/probes and pathway analysis.</a> Drug Discovery World Summer 2005. , 31-53 (2005).</li><li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Carr, J., Roberts, N. A., Klenk, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+alpha-2,+6-sialyltransferase+in+MDCK+cells+increases+influenza+virus+sensitivity+to+neuraminidase+inhibitors.">Overexpression of the alpha-2, 6-sialyltransferase in MDCK cells increases influenza virus sensitivity to neuraminidase inhibitors.</a> J. Virol. 77, 8418-8425 (2003).</li><li>Sullivan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+virus+plaque+quantitation+using+a+flatbed+scanner.">High throughput virus plaque quantitation using a flatbed scanner.</a> J Virol Methods. 179, 81-89 (2012).</li><li>Lin, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+micro-neutralization+assay+and+its+application+in+antigenic+characterization+of+influenza+viruses.">Optimization of a micro-neutralization assay and its application in antigenic characterization of influenza viruses.</a> Influenza Other Respir Viruses. 9, 331-340 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

I denne studien beskrev vi en bildebasert MN analyse for å kvantifisere den sanne antigene relasjoner mellom virus. Sammenlignet med andre plaque-reduksjonsanalyser, understreker fremgangsmåten måling av ICP av en hel brønn, sikre fullstendig dekning av infeksiøs befolkningen. Uavhengighet av plakkdannelse også utvider anvendelsen av analysen for virus som kan danne i hovedsak usynlig små plakker eller som bare kan administrere en enkelt celle infeksjon. Derfor er analysen i stand til å undersøke flere virus og effektene av et bredere spekter av antistoffer enn HI, og det bidrar til mer omfattende reflektere de antigene likheter og forskjeller mellom virus 12. For eksempel når oseltamivirkarboksylat er inkludert, MN analysen er mindre påvirket av NA-avhengig binding, noe som reflekterer de antigene forskjeller mer nøyaktig. Under utviklingen av analysen, ble store anstrengelser gjort for å forbedre forsøket konsistens, hastighet, og deteksjonfølsomhet, blant annet ved å kontrollere inngangs virus gjennom kvantifisert titrering, bildebehandling i høy gjennomstrømming med en planskanner, og implementere en brukervennlig databehandling plattform. Resultatene har generelt vært i samsvar med og bekreftet de av HI. Spesielt resultatene viste også antigene forskjeller mellom antigen drift varianter av nyere type A og B vaksine virus, samt antigene endringer forårsaket av kultur valgt eller sporadiske endringer, for eksempel G155E substitusjon i HA1 av visse A (H1N1) pdm09 virus 12. Protokollen matchet virustype eller subtype med utvelgelse av cellelinjer som ga de sterkeste infeksjon, som i stor grad forbedret bildesignalet. Eksperimentell variasjon ble glattet med utformingen av dubletter som balansert med antallet av testede antisera. Usikkerhet kan også komme fra bildekvaliteten, som hovedsakelig påvirket av bildeenhet. En anstendig fargeplanskanner kan signifikantforbedre ficantly kontrasten i bildet og redusere støy. Mengden av inngangsvirus i nøytraliseringen må være kvantitativt bestemt på forhånd fra den tilsvarende titreringen mens virus fortsatt opprettholde et tilsvarende status. Under nøytraliseringen, antiserumet respons på en infeksjon er normalisert mot forskjellen mellom referanse virus (VC) og bakgrunnsnivået (CC). Nøyaktige målinger av VC og CC er avgjørende for en nøytralisering eksperiment. Flere duplikater er anbefalt (åtte duplikater ble brukt i de representative resultater). Til slutt, forstå programvaren er avgjørende for å lykkes med et eksperiment. Programvaren er testet for rutinemessig virus karakterisering i WHO Influensasenteret, UK for mer enn to år. Detaljerte instruksjoner for å håndtere ulike situasjoner er gitt i tilleggs S1. Dette MN analysen er egnet for applikasjoner der prøvene dekker en extremely stort synsfelt, men krever bare moderat bildeoppløsning. Den lave kostnader og enkelt oppsett gjør systemet lett tilgjengelig for de fleste virologi laboratorier. Variasjonen i målinger av samme prøve var mindre enn 3%, noe som omtrent definerer usikkerheten introdusert i løpet av 11 scanning. En slik reproduserbarhet er tilstrekkelig i mange virologiske studier og kan reduseres ytterligere ved å danne gjennomsnitt bilder fra flere avsøkninger. Som konklusjon, denne studien viser en robust MN-analyse som kan rutinemessig brukt i antigene studier og å støtte HI data i detaljerte analyser av tiden-sirkulerende influensavirus, særlig for den halvårlige utvalg av virus for inkludering i menneskelige influensavaksiner.

Micro-nøytralisering (MN) analyser er anvendt i virologi for kvantifisering av nøytraliserende antistoffer og antivirale aktiviteter. Som et alternativ til hemagglutineringshemming (HI) analyser, MN analyser kan overvinne ikke-antigene effekter påvirket av affinitet endringer i reseptor-binding i influensavirus, som kan komplisere tolkningen av HI resulterer 1,2,3. Inntil nylig var de fleste MN analyser basert på cytopatiske effekter (CPE) eller enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) 4,5. MN analyser basert på fokus og plakk reduksjon ble utviklet i 1990 6,7,8. Plakkreduksjons analyser stole på telle synlige plaketter å kvantifisere smittsomhet. Men visuelle tellinger dekker bare store plakk som kan løses av menneskelige øyne, selv om de fleste av plakk er små og usynlige for mange av dagens sirkulerende virus. Dette ufullstendig dekning kan forårsake betydelig variasjon mellom sensorer og mellom eksperimenter, som fører til jegncomparable resultater. Det er også umulig å bruke metoden når noen virus viser avbrytende infeksjon av enkeltceller eller svært små plakk. Den dårlige telling oppløsning kan forbedres ved innføring av en avbildning-basert protokoll. Med fremskritt innen teknologi, optisk mikroskopi og høy gjennomstrømming godt plate leserne kan gi nøyaktige metoder for å telle de infiserte celler 9. I henhold til en trans-belyste mikroskop, kan infiserte celler som er merket med visse markører bli visualisert ved deres absorpsjon eller fluorescens kontrast i sub-cellulær oppløsning. En prøve kan deretter bli analysert på en dataskjerm. Uheldigvis, på grunn av begrensning i synsfeltet, er mer enn hundre lagte bilder som kreves for å dekke en enkelt brønn. Analysere en plate med 96 brønner vil kreve bildebehandling og behandling av om lag ti tusen bilder. En slik arbeidskrevende prosess er tidkrevende og kostbart, og oppløsningen fikk er i general unødvendig for rutinemessig karakterisering av virusinfeksjoner. Laboratorier med et begrenset budsjett kan finne at tilnærmingen bygget rundt en planskanner gir en kostnadseffektiv, høy gjennomstrømming alternativ. I denne artikkelen beskriver vi en forbedret plakkreduksjon MN analyse som er egnet for den antigene karakterisering av et stort antall virus og for kvantitativ måling av antiviral aktivitet og nøytralisering antistoffer. Analysen har flere fordeler: For det første er det en bildebasert assay som er i stand til å måle virus infeksjoner på cellenivå, uavhengig av plakk størrelse. Å telle det totale infiserte cellepopulasjon (ICP) inne i en brønn i stor grad øker deteksjonsfølsomheten, noe som gjør det mulig å karakterisere de virus med lav smittsomhet. For det andre, blir en mer nøyaktig kvantitativ titrering tilsettes før nøytralisering for å bestemme mengden av inngangsvirus. Den kvantitative innspill virus reduserer varia betydeligsjon mellom ulike eksperimenter og gjør resultatene mer sammenlignbare mellom laboratorier. For det tredje kan nøytralisering titere bestemmes direkte ved å analysere bildene, noe som gjør kvantifisering rask og brukervennlig. Til slutt tilveiebringer protokollen en kostnadseffektiv og high-throughput alternativ med den nødvendige oppløsning og nøyaktighet. Den kvantifisering er basert på en planskanner og gratis databehandling programvare. Hele oppsettet har en liten plass og er deployerbare i de fleste laboratorier. Protokollen presentert i denne artikkelen består av fire store skritt, inkludert virus titrering, titrering kvantifisering, virus nøytralisering, og nøytralisering kvantifisering. Virus-titrering er et preparat eksperiment som bestemmer mengden av inngangsvirus som skal brukes i nøytralisering. I løpet av en titrering, er en rekke virus konsentrasjoner anvendes på cellemonolagene i en 96-brønns plate. De infiserte celler blir deretter kvantifisert i § 2. viral Dilusjon som produserer 20% -85% ICP er i sin tur brukt som inngangs virus til tilsvarende nøytralisering i § 3. titer av nøytraliser protokollen er kvantifisert ved hjelp av seksjon 4. Eksperimenter som fulgte de ovennevnte protokollene er presentert i de representative resultater. Analysen har blitt testet grundig i løpet av de siste to årene med de fleste av dagens sirkulerende influensavirus, som A (H1N1) pdm09, A (H3N2), og B-virus. Resultatene av influensavirus karakterisering ble inkludert i rapportene for WHO konsultasjonsmøte som ga anbefalinger om influensavaksiner til bruk på den sørlige halvkule i 2016 og den nordlige halvkule i 2016-2017.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1115">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">VGM</td>
			<td style="width:172px;">Sigma</td>
			<td style="width:383px;">D6429, P0781</td>
			<td style="width:383px;">500 ml DMEM+5 ml Pen/Strepb</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:177px;">PBS A</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:383px;"></td>
			<td style="width:383px;">Nature pH Phosphate-buffered saline: NaCl -10 gm, KCl - 0.25 gm, Na2HPO4 - 1.437 gm, KH2PO4 &#8211; 0.25 .gm, and Dist. Water &#8211; 1 L.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:177px;">Avicell</td>
			<td style="width:172px;">FMC</td>
			<td style="width:383px;">RC-581F</td>
			<td style="width:383px;">2.4g in 100ml distilled water dissolved by agitation on a magnetic stirrer for 1 hr. Sterilize by autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">2XDMEM</td>
			<td style="width:172px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:383px;">21935-028</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">Trypsin</td>
			<td style="width:172px;">Sigma</td>
			<td style="width:383px;">T1426</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:177px;">Overlay (10ml/plate):</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:383px;"></td>
			<td style="width:383px;">5ml 2X DMEM, Trypsin 2&#956;g/ml final conccentration,Avicell&#160; - 5ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">Triton X- 100e</td>
			<td style="width:172px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:383px;">T8787</td>
			<td style="width:383px;">Permeabilisation buffer: 0.2% in PBS A (v/v)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">Tween 80</td>
			<td style="width:172px;">Sigma</td>
			<td style="width:383px;">P5188</td>
			<td style="width:383px;">&#160;Wash Buffer: 0.05% Tween &#8211; 80 in PBS A (v/v)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">Horse serum</td>
			<td style="width:172px;">PAA Labs Ltd</td>
			<td style="width:383px;">B15-021</td>
			<td style="width:383px;">ELISA Buffer: 10%&#160; in PBS A (v/v) + 0.1% Tween 80</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">Mouse MAb against influenza type A</td>
			<td style="width:172px;">Biorad</td>
			<td style="width:383px;">MCA 400</td>
			<td style="width:383px;">1st Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">Goat anti-mouse IgG (H+L) HRP conjugate</td>
			<td style="width:172px;">Biorad</td>
			<td style="width:383px;">172-1011</td>
			<td style="width:383px;">2nd Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">True Blu peroxidase substrate</td>
			<td style="width:172px;">KPL&#160;</td>
			<td style="width:383px;">50-78-02</td>
			<td style="width:383px;">Substrate:&#160; True blue +0.03% H2O2g (1:1000 of 30% solution)</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">96-well flat-bottom microtitre plates</td>
			<td style="width:172px;">Costar&#160;</td>
			<td style="width:383px;">3596</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:177px;">8 channel multiwall-plate washer and manifold</td>
			<td style="width:172px;">Sigma</td>
			<td style="width:383px;">M2656</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="104" style="height:104px;width:177px;">Perfection Plate Scanner</td>
			<td style="width:172px;">Epson</td>
			<td style="width:383px;">V750 Pro</td>
			<td style="width:383px;"><a href="http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&amp;infoType=Downloads.">The imaging software can be downloaded freely from http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&#38;infoType=Downloads.</a></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">Software operational environment: LabVIEW</td>
			<td style="width:172px;">National Instruments Corporation</td>
			<td style="width:383px;">Window based with NI Vision builder</td>
			<td style="width:383px;">Version: LabVIEW2012 or above</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of a quantitative micro-neutralization assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

Etter prosedyrene ovenfor, presenterer vi noen resultater fra nyere antigene karakterisering eksperimenter. Titreringen oppsett er designet for å undersøke åtte inngangs virus, med doble duplikater for hver fortynning. Viral fortynninger ble testet mellom 1,0 x 10 -1 og 1,0 x 1,0 -6 å dekke variasjoner mellom virus. Test virus var fra H3N2 subtype, inkludert A / Kamerun / 15V-3538/2015, A / Vladivostok / 36/2015 A / Moskva / 103/2015, A / Tomsk / 5/2015 / A / Moskva / 101 / 2015, A / Moskva / 100/2015, A / Moskva / 133/2015, og A / Bratislava / 437/2015. Titreringen Resultatene er vist i figur 5. Figur 5d viser reduksjon av ICPS med økningen av viruset fortynning. Kurvene ble normalisert mot ICPS av samme virus som ga infeksjoner i alle celler i en brønn 12 (definert som ICP metning). Hvis ICP ikke nådde metning med highest viruskonsentrasjon, ICP gjennomsnitt fra tilsvarende dubletter ble anvendt i stedet (A / Moskva / 103/2015 figur 5d). Viruset fortynningene som ga 30% av ICP metning ble valgt som inngangsvirus fortynning for nøytralisering (tabell 3). Nøytralisering forsøkte å ha en inngang virus mot fem antisera, med doble duplikater på hver plate. Referanse virus som vises er H3N2 A / Stockholm / 63/2015. De fem sera er A / HK 4801/14 Egg F12 / 15, A / HK 7295/14 MDCK F02 / 15, A / Sør-Afrika R2665 / 15 SIAT F50 / 15, A / sveitsisk 9715923/13 SIAT NIBF F18 / 15, og A / nederlandsk 525/14 SIAT F23 / 15. Nøytraliseringen Resultatene er illustrert i figur 6. Figur 6d viser infeksjon fremgang med økning av serum fortynning. Den normaliserte positive populasjon på den vertikale aksen representerer forholdet ICPS fra det tilsvarende antisera responsen mot gjennomsnittet ICPav referanse virus 12. Bakgrunnen ICP fra infiserte cellekontroller ble trukket under normalisering. De nøytraliserende titere ble bestemt som den inverse verdien av antiserum fortynninger som tilsvarer 50% reduksjon ICP (tabell 4). Lineær interpolering ble brukt for å estimere titere som faller mellom to tilstøtende serumfortynninger. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig1.jpg" /> Figur 1: Eksempel på et godt plate oppsett i et virus titrering eksperiment. Test virus er tildelt separate rader (A til H). Kolonnene er utformet for forskjellige virale fortynninger (1 til 12). To kolonner ble brukt som duplikater for hver viral fortynning. Scale bar = 10 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> Figur 2: Skjematisk i en prøve skannesystem. (A) En 96-brønns plate på bilde posisjonen til en planskanner (republisert fra referanse 11 med tillatelse fra Elsevier), og (b) dimensjoner av den L-formede stilling grense som er vist i (a). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig3.jpg" /> Figur 3: Desktop diagram av &quot;Wellplate Reader&quot; kvantifisering programvare. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> </p&gt; <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig4.jpg" /> Figur 4: Eksempel på et godt plate oppsett i en nøytralisering eksperiment. Hvert antiserum er tildelt to kolonner med duplikater (1 til 10). Rader er designet for forskjellige serum fortynninger (A til H). Viruset kontroll tar kolonne 11, med åtte duplikater (A11 til H11). Cellestyringen er i kolonne 12, med åtte dubletter (A12 H12). Scale bar = 10 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig5.jpg" /> Figur 5: Resultater fra en titrering eksperiment. (A) Den godt plate oppsett, (b) skannet godt plate image, (c) illustrasjonav den fargekodede, kvantifisert, virusinfiserte cellepopulasjon, og (d) normaliserte virus-infiserte cellepopulasjoner mot virus fortynninger. 30% ICP ble anvendt som terskelen. De feilfelt i (d) er standardavvik (SD) fra prøven duplikasjoner (± 1 SD). Skala barer i (b) og (c) = 10 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig6.jpg" /> Figur 6: Resultater fra en nøytralisering eksperiment. (A) Den godt plate konfigurasjonen, (b) skannet godt bilde plate, (c) illustrasjon av kvantifisert, virus-infiserte cellepopulasjon, og (d) normalisert virusinfiserte cellepopulasjon mot serumfortynning. Inngangs virus (VC) er A / Stockholm / 63/2015. 50% ICP ble anvendt for å beregne titere. De feilfelt i (d) er standardavvik (SD) fra prøven duplikasjoner (± 1 SD). Skala barer i (b) og (c) = 10 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig6large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> Tilleggs S1: <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/Supplementary_S1.pdf" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3"> typisk fortynning </td></tr><tr><td></td><td> MDCK celler </td><td> MDCK-SIAT1 celler </td></tr><tr><td> 2 dager </td><td> 1: 5 (1 + 4) </td><td> 01:10 (1 + 9) </td></tr><tr><td> 3 dager </td&gt; <td> 01:10 (1 + 9) </td><td> 01:20 (1 + 19) </td></tr><tr><td colspan="3"> Typisk antall celler pr ml </td></tr><tr><td></td><td> MDCK celler </td><td> MDCK-SIAT1 celler </td></tr><tr><td> 2 dager </td><td> 2 x 10 5 </td><td> 1 x 10 5 </td></tr><tr><td> 3 dager </td><td> 1 x 10 5 </td><td> 5 x 10 4 </td></tr></tbody></table> Tabell 1: Typiske fortynninger på en subkultur av konfluente kolber av MDCK eller MDCK-SIAT1 celler. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Modus </td><td> Professional Mode </td></tr><tr><td> dokumenttype </td><td> Film (med guide Film Area) </td></tr><tr><td> Auto Exposure Type </td><td> Bilde </td></tr><tr><td> imalder Type </td><td> 24-bit farge </td></tr><tr><td> oppløsning </td><td> 1200 dpi </td></tr><tr><td> Lagret bilde Format </td><td> TIFF </td></tr></tbody></table> Tabell 2: Typisk oppsett av en planskanner. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Rad </td><td> Virus </td><td> Anbefalt fortynning </td></tr><tr><td> EN </td><td> A / Cameron / 15V-3538/2016 </td><td> 1,0 x 10 -2 </td></tr><tr><td> B </td><td> A / Vladivostok / 36/2015 </td><td> 1,0 x 10 -3 </td></tr><tr><td> C </td><td> A / Moskva / 103/2015 </td><td> 1,1 x 10 -1 </td></tr><tr><td> D </td><td> A / Tomsk / 5/2015 </td><td> 5,9 x 10 -1 </td></tr><tr><td> E </td><td> A / Moskva / 101/2015 </td><td> 8,3 x 10 -1 </td></tr><tr><td> F </td><td> A / Moskva / 100/2015 </td><td> 1,4 x 10 -2 </td></tr><tr><td> G </td><td> A / Moskva / 133/2015 </td><td> 1,3 x 10 -2 </td></tr><tr><td> H </td><td> A / Bratislava / 437/2015 </td><td> 1,3 x 10 -4 </td></tr></tbody></table> Tabell 3: Viral fortynninger beregnet fra en befolkning på 30% ICP. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Søyle </td><td> sera </td><td> Anbefalt titer </td></tr><tr><td> 1 - 2 </td><td> A / HK4801 / 2014 </td><td> 110 </td></tr><tr><td> 3-4 </td><td> A / HK7295 / 2014 </td><td> 213,3 </td></tr><tr><td&gt; 5-6 </td><td> A / Sør-Afrika / R2665 / 2015 </td><td> 2155,8 </td></tr><tr><td> 7-8 </td><td> A / Sveits / 9715293/2013 </td><td> 89.4 </td></tr><tr><td> 9-10 </td><td> A / Nederland / 525/2014 </td><td> 78.6 </td></tr></tbody></table> Tabell 4: Titere på 50% ICP av A / Stockholm / 63/2015 mot antisera.

Watch this Scientific Journal Video about Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay at JoVE.com

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

Denne studien beskriver en avbildning-baserte mikro nøytralisering assay for å analysere de antigene forholdet mellom virus. Protokollen benytter en planskanner og har fire trinn, inkludert titrering, titrering kvantifisering, nøytralisering, og nøytralisering kvantifisering. Analysen fungerer godt med strøm sirkulerer influensa A (H1N1) pdm09, A (H3N2), og B-virus.

Optimalisering av en kvantitativ Micro-nøytralisering analyse

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Intravital Mikroskopi av Spleen: Kvantitativ analyse av Parasite Mobilitet og Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

En kvantitativ vurdering av Cell Migration ved Phagokinetic Track Motilitet Assay

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Kvantitativ Høy gjennomstrømming encellede Cytotoksisitet analysen for T celler

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an ...

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

Kvantitativ vurdering av Menneskelig Neutrophil Migration Across en kultivert Blære Epitel

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Etablering og optimalisering av en høy gjennomstrømning Oppsett for å studere<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Og<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infeksjon som en modell for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Høy gjennomstrømming Kvantitativ Real-time RT-PCR-analyse for fastsetting Expression Profiler av type I og III Interferon Subtyper

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Kvalitative og kvantitative analyser for påvisning og karakterisering av Protein antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...