Name: optimization of a quantitative micro-neutralization assay
Uploaded: 2016-12-14T15:00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay at JoVE.com

The authors thank Dr. M. Matrosovich for providing the parent MDCK and MDCK-SIAT1 cell lines and Roche Pharmaceuticals for supplying the oseltamivir carboxylate.We also appreciate Dr. Anne Weston for valuable suggestions on the manuscript. This study was dependent upon the valued collaboration of the WHO National Influenza Centres and the WHO CCs within the WHO GISRS, who provided the influenza viruses used. This work was funded by the Medical Research Council through Programme U117512723.

<ol>
	<li>Walker, D. L., Horsfall, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+identity+in+neutralizing+and+hemagglutination-inhibiting+antibodies+against+influenza+viruses.">Lack of identity in neutralizing and hemagglutination-inhibiting antibodies against influenza viruses.</a> J Exp Med. 91, 65-86 (1950).</li><li>Medeiros, R., Escriou, N., Naffakh, N., Manuguerra, J. C., van der Werf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemagglutinin+residues+of+recent+human+A(H3N2)+influenza+viruses+that+contribute+to+the+inability+to+agglutinate+chicken+erythrocytes.">Hemagglutinin residues of recent human A(H3N2) influenza viruses that contribute to the inability to agglutinate chicken erythrocytes.</a> Virology. 289, 74-85 (2001).</li><li>Lin, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuraminidase+receptor+binding+variants+of+human+influenza+A(H3N2)+viruses+resulting+from+substitution+of+aspartic+acid+151+in+the+catalytic+site:+a+role+in+virus+attachment.">Neuraminidase receptor binding variants of human influenza A(H3N2) viruses resulting from substitution of aspartic acid 151 in the catalytic site: a role in virus attachment.</a> J Virol. 84, 6769-6781 (2010).</li><li>Harmon, M. W., Rota, P. A., Walls, H. H., Kendal, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+response+in+humans+to+influenza+virus+type+B+host-cell-derived+variants+after+vaccination+with+standard+(egg-derived)+vaccine+or+natural+infection.">Antibody response in humans to influenza virus type B host-cell-derived variants after vaccination with standard (egg-derived) vaccine or natural infection.</a> J Clin Microbiol. 26, 333-337 (1988).</li><li>Rowe, T., Abernathy, R. A., Hu-Primmer, J., Thompson, W. W., Lu, X., Lim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+antibody+to+avian+influenza+A+(H5N1)+virus+in+human+serum+by+using+a+combination+of+serologic+assays.">Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays.</a> J Clin Microbiol.37. 37, 937-943 (1999).</li><li>Okuno, Y., Tanaka, K., Baba, K., Maeda, A., Kunita, N., Ueda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+focus+reduction+neutralization+test+of+influenza+A+and+B+viruses+in+microtiter+system.">Rapid focus reduction neutralization test of influenza A and B viruses in microtiter system.</a> J Clin Microbiol. 28, 1308-1313 (1990).</li><li>Bachmann, M. F., Ecabert, B., Kopf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus:+a+novel+method+to+assess+viral+and+neutralizing+antibody+titers+in+vitro.">Influenza virus: a novel method to assess viral and neutralizing antibody titers in vitro.</a> J Immunol Methods. 225, 105-111 (1999).</li><li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays.">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virol J. 3, 63-70 (2006).</li><li>Comley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+screening+-+Emerging+importance+of+novel+reagents/probes+and+pathway+analysis.">High content screening - Emerging importance of novel reagents/probes and pathway analysis.</a> Drug Discovery World Summer 2005. , 31-53 (2005).</li><li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Carr, J., Roberts, N. A., Klenk, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+alpha-2,+6-sialyltransferase+in+MDCK+cells+increases+influenza+virus+sensitivity+to+neuraminidase+inhibitors.">Overexpression of the alpha-2, 6-sialyltransferase in MDCK cells increases influenza virus sensitivity to neuraminidase inhibitors.</a> J. Virol. 77, 8418-8425 (2003).</li><li>Sullivan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+virus+plaque+quantitation+using+a+flatbed+scanner.">High throughput virus plaque quantitation using a flatbed scanner.</a> J Virol Methods. 179, 81-89 (2012).</li><li>Lin, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+micro-neutralization+assay+and+its+application+in+antigenic+characterization+of+influenza+viruses.">Optimization of a micro-neutralization assay and its application in antigenic characterization of influenza viruses.</a> Influenza Other Respir Viruses. 9, 331-340 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

В данном исследовании мы описали формирования изображения на основе анализа MN, чтобы количественно оценить истинные антигенные отношения между вирусами. По сравнению с другими анализов доска снижение, метод измерения делает акцент ПМС целой скважины, обеспечивая полный охват инфекционном населения. Его независимость образования бляшек также расширяет применение анализа на вирусы, которые могут образовывать в основном невидимые маленькие бляшки или которые могут управлять только инфекцией одноклеточных. Таким образом, анализ способен изучения больше вирусов и эффектов более широкого спектра антител , чем HI, и это помогает более полно отражать антигенные сходства или различий между вирусами 12. Например, когда озельтамивир карбоксилат включен, анализ МН менее подвержена воздействию НС-зависимое связывание, что отражает антигенные различия более точно. Во время разработки анализа, были сделаны большие усилия для повышения согласованности эксперимента, скорость и обнаружениечувствительность, в том числе путем контроля входных вирусов через титрования, количественно изображения в высокой пропускной способности с помощью планшетного сканера, а также реализует удобную платформу для обработки данных. Результаты, как правило, согласуются с результатами и подтвердили те HI. Следует отметить, что результаты также показали антигенные различия между антигенных вариантов дрейфа последних вирусов типа А и вакцины B, а также антигенные изменения, вызванные культуры отобранных или спорадических изменений, таких как замена G155E в ГА1 некоторых A (H1N1) вирусов pdm09 12. Протокол соответствовал тип вируса или подтип с выбором клеточных линий, которые дали самую сильную инфекцию, что значительно повысило сигнал формирования изображения. Экспериментальное изменение сглаживали с конструкцией дубликатами, что сбалансированное с числом протестированных сывороток. Неопределенности могут также исходить от качества изображения, которое в основном зависит от устройства формирования изображения. Приличное цветной планшетный сканер может Significantly улучшить контраст изображения и снизить уровень шума. Количество вируса в входного нейтрализации должна быть количественно определена заранее из соответствующего титрования в то время как вирусы по-прежнему поддерживать одинаковый статус. В процессе нейтрализации, реакция антисыворотки к инфекции нормализована по отношению к разнице между контрольным вирусом (VC) и фонового уровня (CC). Точные измерения VC и CC имеют важное значение для нейтрализации эксперимента. Более дубликатами рекомендуется (восемь дубликатами были использованы в представительных результатов). И, наконец, понимание программного обеспечения имеет жизненно важное значение для успеха эксперимента. Программное обеспечение было протестировано для рутинной характеризации вирусов в центр по гриппу ВОЗ, Великобритания в течение более двух лет. Подробные инструкции по работе с различными ситуациями предусмотрено в дополнительном S1. Этот MN анализ подходит для применений, где образцы покрывают собой добremely большое поле зрения, но требуют лишь умеренного разрешения изображения. Низкая стоимость и простота установки делают систему доступной для большинства вирусологических лабораториях. Разброс измерений одного и того же образца составляла менее 3%, что примерно определяет неопределенности , вводимой во время сканирования 11. Такая воспроизводимости достаточно во многих исследованиях вирусологии и может быть дополнительно уменьшена путем усреднения изображений с использованием нескольких циклов сканирования. В заключение, данное исследование демонстрирует надежный анализ MN, который может быть широко используется при антигенной исследовании и поддерживать данные HI в детальном анализе в настоящее время циркулирующих вирусов гриппа, в частности, за два раза в год отбора вирусов для включения в вакцины гриппа человека.

Микро-нейтрализации (MN) Анализы используются в вирусологии для количественного определения нейтрализующих антител и противовирусной активности. В качестве альтернативы ингибирования гемагглютинации (HI) анализы, анализы MN может преодолеть без антигенных эффектов под влиянием изменения сродства рецептора-связывания в вирусов гриппа, которые могут осложнить интерпретацию результатов HI 1,2,3. До недавнего времени большинство MN анализы были основаны на цитопатического эффекта (CPE) или иммуноферментного анализа (ELISA) 4,5. Были разработаны MN анализы , основанные на фокус и бляшки сокращения в 1990 году 6,7,8. Зубной налет Анализы сокращения полагаются на подсчете видимых бляшек для количественной оценки инфекционности. Тем не менее, визуальный подсчет только покрывают большие бляшки, которые разрешимы человеческим глазом, хотя большинство бляшек маленькие и невидимые для многих современных циркулирующих вирусов. Это неполный охват может вызвать значительное изменение среди экзаменаторов и между экспериментами, что приводит к Incomparable результаты. Также невозможно использовать метод, когда некоторые вирусы показывают неудачную инфекции одиночных клеток или очень маленьких бляшек. Плохое разрешение подсчета может быть улучшена за счет введения протокола формирования изображения на основе. С развитием технологий, оптической микроскопии и высокой пропускной способностью читатели хорошо пластины могут обеспечить точные средства для подсчета инфицированных клеток 9. Под транс-освещенная микроскопом, инфицированные клетки с тэгом определенными маркерами могут быть визуализированы с помощью их поглощения или флуоресценции в отличие от субклеточном разрешения. Образец может быть проанализирован на экране компьютера. К сожалению, в связи с ограничением в поле зрения, более ста плиточные изображения должны покрывать одну скважину. Анализируя пластину с 96 лунок потребует обработки изображений и обработки около десяти тысяч изображений. Такой трудоемкий процесс занимает много времени и дорого, а разрешение получили в родахл ненужной для рутинной характеризации вирусных инфекций. Лаборатории с ограниченным бюджетом могут обнаружить, что подход построен вокруг планшетного сканера обеспечивает рентабельное, высокую пропускную способность альтернативу. В этой статье мы опишем улучшенный MN анализ уменьшения образования зубного налета, который подходит для антигенной характеристики большого количества вирусов и для количественного измерения противовирусной активности и нейтрализации антител. Анализ имеет несколько преимуществ: во-первых, она представляет собой анализ изображений на основе, который способен измерять вирусные инфекции на клеточном уровне, независимо от размера бляшки. Подсчет общего зараженную популяцию клеток (ПМС) в скважине значительно повышает чувствительность обнаружения, что позволяет охарактеризовать вирусы с низкой инфекционности. Во-вторых, более точное количественное титрование вводится до нейтрализации с целью определения количества вируса ввода. Вирус количественный ввод значительно снижает Variaция между различными экспериментами и делает результаты более сопоставимы между лабораториями. В-третьих, нейтрализующие титры антител можно определить непосредственно путем анализа изображений, что делает быстро и количественно оценивать удобно. Наконец, протокол обеспечивает рентабельную и высокой пропускной способностью вариант с требуемой разрешающей способности и точности. Количественное основан на планшете сканера и свободного программного обеспечения для обработки данных. Вся установка имеет небольшой размер и может быть развернуто в большинстве лабораторий. Протокол, представленные в этой статье, состоит из четырех основных этапов, в том числе титрования вируса, титрование количественному, нейтрализации вируса и нейтрализации количественному. Вирус титрование представляет собой препарат эксперимент, который определяет количество входных вирусов, которые будут использоваться в нейтрализации. Во время титрования, ряд вирусных концентраций, применяются к монослоев клеток в 96-луночный планшет. Инфицированные клетки затем количественному в разделе 2. Вирусный diluции, который производит 20% -85% ПМС, в свою очередь применяется в качестве входных вирусов к соответствующей нейтрализации в Раздел 3. Титры протокола нейтрализации количественно, используя раздел 4. Эксперименты, которые следовали вышеуказанные протоколы представлены в представительных результатов. Анализ был тщательно протестирован в течение последних двух лет с большинства современных вирусов гриппа, циркулирующих, таких как A (H1N1) pdm09, A (H3N2) и вирусы B. Результаты определения характеристик вируса гриппа были включены в доклады для консультативного совещания ВОЗ, которая дала рекомендации в отношении вакцин против гриппа для использования в Южном полушарии в 2016 году и в северном полушарии в 2016-2017 гг.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1115">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">VGM</td>
			<td style="width:172px;">Sigma</td>
			<td style="width:383px;">D6429, P0781</td>
			<td style="width:383px;">500 ml DMEM+5 ml Pen/Strepb</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:177px;">PBS A</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:383px;"></td>
			<td style="width:383px;">Nature pH Phosphate-buffered saline: NaCl -10 gm, KCl - 0.25 gm, Na2HPO4 - 1.437 gm, KH2PO4 &#8211; 0.25 .gm, and Dist. Water &#8211; 1 L.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:177px;">Avicell</td>
			<td style="width:172px;">FMC</td>
			<td style="width:383px;">RC-581F</td>
			<td style="width:383px;">2.4g in 100ml distilled water dissolved by agitation on a magnetic stirrer for 1 hr. Sterilize by autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">2XDMEM</td>
			<td style="width:172px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:383px;">21935-028</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">Trypsin</td>
			<td style="width:172px;">Sigma</td>
			<td style="width:383px;">T1426</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:177px;">Overlay (10ml/plate):</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:383px;"></td>
			<td style="width:383px;">5ml 2X DMEM, Trypsin 2&#956;g/ml final conccentration,Avicell&#160; - 5ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">Triton X- 100e</td>
			<td style="width:172px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:383px;">T8787</td>
			<td style="width:383px;">Permeabilisation buffer: 0.2% in PBS A (v/v)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">Tween 80</td>
			<td style="width:172px;">Sigma</td>
			<td style="width:383px;">P5188</td>
			<td style="width:383px;">&#160;Wash Buffer: 0.05% Tween &#8211; 80 in PBS A (v/v)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">Horse serum</td>
			<td style="width:172px;">PAA Labs Ltd</td>
			<td style="width:383px;">B15-021</td>
			<td style="width:383px;">ELISA Buffer: 10%&#160; in PBS A (v/v) + 0.1% Tween 80</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">Mouse MAb against influenza type A</td>
			<td style="width:172px;">Biorad</td>
			<td style="width:383px;">MCA 400</td>
			<td style="width:383px;">1st Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">Goat anti-mouse IgG (H+L) HRP conjugate</td>
			<td style="width:172px;">Biorad</td>
			<td style="width:383px;">172-1011</td>
			<td style="width:383px;">2nd Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">True Blu peroxidase substrate</td>
			<td style="width:172px;">KPL&#160;</td>
			<td style="width:383px;">50-78-02</td>
			<td style="width:383px;">Substrate:&#160; True blue +0.03% H2O2g (1:1000 of 30% solution)</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">96-well flat-bottom microtitre plates</td>
			<td style="width:172px;">Costar&#160;</td>
			<td style="width:383px;">3596</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:177px;">8 channel multiwall-plate washer and manifold</td>
			<td style="width:172px;">Sigma</td>
			<td style="width:383px;">M2656</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="104" style="height:104px;width:177px;">Perfection Plate Scanner</td>
			<td style="width:172px;">Epson</td>
			<td style="width:383px;">V750 Pro</td>
			<td style="width:383px;"><a href="http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&amp;infoType=Downloads.">The imaging software can be downloaded freely from http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&#38;infoType=Downloads.</a></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">Software operational environment: LabVIEW</td>
			<td style="width:172px;">National Instruments Corporation</td>
			<td style="width:383px;">Window based with NI Vision builder</td>
			<td style="width:383px;">Version: LabVIEW2012 or above</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of a quantitative micro-neutralization assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

После вышеуказанных процедур, мы приведем некоторые результаты недавних антигенных экспериментов по характеристике. Установка титрование был разработан, чтобы изучить восемь входных вирусов, с двойными дублей для каждого разведения. Вирусные разведений тестировали в пределах от 1,0 × 10 -1 и 1,0 х 1,0 -6 охватить различия между вирусами. Тестовые вирусы из подтипа H3N2, в том числе A / Камерун / 15В-3538/2015, A / Владивосток / 36/2015, A / Москва / 103/2015, A / Томск / 5/2015 /, А / Москва / 101 / 2015, A / Москва / 100/2015, A / Москва / 133/2015 и A / Братислава / 437/2015. Результаты титрования показаны на рисунке 5. Рисунок 5d показывают снижение доли МСП с увеличением вирусной разведения. Кривые были нормализованы в отношении МСП тех же вирусов , которые давали инфекции во всех клетках в скважине 12 (определяется как ICP насыщением). Если ПМС не достигает насыщения с приветGhest концентрация вируса, средний ПМС из соответствующих дубликатами использовали вместо (А / Москва / 103/2015 г. Рисунок 5d). Вирус разведений , которые произвели 30% ПМС насыщения были выбраны в качестве вируса входного разбавления для нейтрализации (таблица 3). Нейтрализация целью иметь вирус один вход против пяти антисыворотки, с двойными дублей на каждой пластине. Эталонный вирус показан H3N2 A / Стокгольм / 63/2015 года. Пять антисыворотки A / HK 4801/14 Яйцо F12 / 15, A / HK 7295/14 MDCK F02 / 15, A / Южная Африка R2665 / 15 SIAT F50 / 15, A / Swiss 9715923/13 SIAT NIBF F18 / 15, и A / Dutch 525/14 SIAT F23 / 15. Результаты нейтрализации показаны на рисунке 6. Рисунок 6D показывает ход инфекции с увеличением разбавления сыворотки. Нормированная положительная популяция на вертикальной оси представляет собой отношение от МСП соответствующего ответа антисыворотки против среднего ПМСэталонного вируса 12. Фон ICP из неинфицированных контрольных клеток вычитали в процессе нормализации. Нейтрализация титры были определены в качестве обратных антисыворотки разведений , соответствующих 50% снижению ПМС (таблица 4). Линейная интерполяция была использована для оценки титра, попадающие между двумя соседними разведений сывороток. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig1.jpg" /> Рисунок 1: Пример подключения луночного планшета в вирусе титровании эксперимента. Вирусы Тестовые назначаются отдельным строкам (от А до Н). Колонки предназначены для различных вирусных разведений (от 1 до 12). Две колонны использовались в качестве дублей для каждого вирусного разведения. Шкала бар = 10 мм. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig1large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig1large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> Рисунок 2: Схематическое изображение системы сканирования образца. (А) 96-луночного планшета на позиции формирования изображения планшетного сканера (переиздана из ссылки 11 с разрешения Elsevier BV), и (б) размеры предельного положения L-форму , показанную на стадии (а). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig2large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig2large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig3.jpg" /> Рисунок 3: Обои для рабочего диаграмма Количественное программного обеспечения &quot;Wellplate Reader&quot;. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig3large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig3large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> </p&gt; <img alt="Рисунок 4" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig4.jpg" /> Рисунок 4: Пример установки хорошо пластины в нейтрализации эксперимента. Каждый антисыворотка назначен двум колонкам с дубликатами (от 1 до 10). Ряды предназначены для различных разведений сывороток (от А до Н). Контроль вируса занимает столбец 11, с восемью дубликатами (А11 до Н11). Контрольная ячейка находится в колонке 12, с восемью дубликатами (А12 до Н12). Шкала бар = 10 мм. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig4large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig4large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 5" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig5.jpg" /> Рисунок 5: Результаты титрования эксперимента. (А) Установка хорошо пластины, (б) сканируется луночного планшета изображение, (с) иллюстрацияцветовой кодировкой, количественно, инфицированных вирусом клеток популяции, и (г) Нормализованный инфицированных вирусом популяций клеток против вируса разведений. 30% ПМС был использован в качестве порогового значения. Столбики ошибок в (г) являются стандартные отклонения (SD) от образца дупликации (± 1 SD). Шкала баров в (б) и (с) = 10 мм. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig5large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig5large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 6" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig6.jpg" /> Рисунок 6: Результаты эксперимента нейтрализации. (А) установка луночного планшета, (б) отсканированы хорошо изображение пластины, (с) иллюстрация, количественно Зараженные вирусом популяции клеток, и (г) нормализуется вирус-инфицированных популяция клеток против разведения сыворотки. Вход VIрус (VC) является A / Стокгольм / 63/2015 года. 50% МСП использовали для расчета титра. Столбики ошибок в (г) являются стандартные отклонения (SD) от образца дупликации (± 1 SD). Шкала баров в (б) и (с) = 10 мм. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig6large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig6large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig6large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> Дополнительный S1: <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/Supplementary_S1.pdf" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/Supplementary_S1.pdf" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/Supplementary_S1.pdf" target="_blank">чтобы скачать этот файл.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3"> Типичное разведение </td></tr><tr><td></td><td> клетки MDCK </td><td> Клетки MDCK-SIAT1 </td></tr><tr><td> 2 дня </td><td> 1: 5 (1 + 4) </td><td> 1:10 (1 + 9) </td></tr><tr><td> 3 дня </td&gt; <td> 1:10 (1 + 9) </td><td> 1:20 (1 + 19) </td></tr><tr><td colspan="3"> Типичное количество клеток на мл </td></tr><tr><td></td><td> клетки MDCK </td><td> Клетки MDCK-SIAT1 </td></tr><tr><td> 2 дня </td><td> 2 х 10 5 </td><td> 1 х 10 5 </td></tr><tr><td> 3 дня </td><td> 1 х 10 5 </td><td> 5 х 10 4 </td></tr></tbody></table> Таблица 1: Типичные разведения на субкультуры сливающихся колб MDCK или MDCK-SIAT1 клеток. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Режим </td><td> Профессиональный режим </td></tr><tr><td> тип документа </td><td> Фильм (с Film Guide Area) </td></tr><tr><td> Тип Автоматическая установка экспозиции </td><td> Фото </td></tr><tr><td> Явозраст Тип </td><td> 24-битный цвет </td></tr><tr><td> разрешение </td><td> 1200 точек на дюйм </td></tr><tr><td> Сохраненный формат изображения </td><td> TIFF </td></tr></tbody></table> Таблица 2: Типичная установка планшетного сканера. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Ряд </td><td> Вирус </td><td> Рекомендуемое разведение </td></tr><tr><td> </td><td> A / Cameron / 15V-3538/2016 </td><td> 1,0 х 10 -2 </td></tr><tr><td> В </td><td> А / Владивосток / 36/2015 </td><td> 1,0 × 10 -3 </td></tr><tr><td> С </td><td> A / Москва / 103/2015 </td><td> 1,1 х 10 -1 </td></tr><tr><td> D </td><td> A / Томск / 5/2015 </td><td> 5,9 х 10 -1 </td></tr><tr><td> Е </td><td> A / Москва / 101/2015 </td><td> 8,3 х 10 -1 </td></tr><tr><td> F </td><td> A / Москва / 100/2015 </td><td> 1,4 х 10 -2 </td></tr><tr><td> г </td><td> A / Москва / 133/2015 </td><td> 1,3 х 10 -2 </td></tr><tr><td> ЧАС </td><td> A / Братислава / 437/2015 </td><td> 1,3 х 10 -4 </td></tr></tbody></table> Таблица 3: Вирусные разведения , рассчитанные от населения 30% ПМС. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> колонка </td><td> Сыворотки </td><td> Рекомендуемый титр </td></tr><tr><td> 1 - 2 </td><td> A / HK4801 / 2014 </td><td> 110 </td></tr><tr><td> 3 - 4 </td><td> A / HK7295 / 2014 </td><td> 213,3 </td></tr><tr><td&gt; 5 - 6 </td><td> A / Южная Африка / R2665 / 2015 </td><td> 2155,8 </td></tr><tr><td> 7 - 8 </td><td> A / Швейцария / 9715293/2013 </td><td> 89,4 </td></tr><tr><td> 9 - 10 </td><td> A / Нидерланды / 525/2014 </td><td> 78,6 </td></tr></tbody></table> Таблица 4: Титры на 50% ПМС А / Стокгольм / 63/2015 против антисыворотки.

Watch this Scientific Journal Video about Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay at JoVE.com

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

Это исследование описывает формирования изображения на основе микро-нейтрализации анализа для анализа антигенные взаимосвязи между вирусами. Протокол использует планшетный сканер и имеет четыре шага, включая титрование, титрование количественному, обезвреживанию и нейтрализации количественному. Анализ хорошо работает с текущей циркулирующие вирусы гриппа A (H1N1) pdm09, A (H3N2) и вирусы B.

Оптимизация количественного микро-анализ нейтрализации

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Микротитровальные Блюдо образование биопленки Пробирной

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Прижизненное микроскопия Селезенка: Количественный анализ паразитов Мобильность и кровотока

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Количественные оценки миграции клеток в Phagokinetic анализа подвижности трек

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Количественные измерения иммунного ответа и сна в<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Количественные высокой пропускной Single-клеточной цитотоксичности анализа для Т-клеток

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Роман Всего тканей количественного анализа уровень оксида азота в<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Нейровоспалительных отклика

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an ...

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

Количественная оценка миграции нейтрофилов человека во культурный мочевого эпителия

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Создание и Оптимизация Верховного установки пропускной изучать<em&gt; Эпидермальный стафилококк</em&gt; И<em&gt; Mycobacterium Marinum</em&gt; Инфекция в качестве модели для Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Высокая пропускная способность Количественный реальном времени RT-PCR анализа для определения профилей экспрессии типов I и III интерферона подтипов

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Качественный и количественный анализы для обнаружения и определения характеристик белка Противомикробные

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...